Aislamiento y perfil de células endoteliales arteriales mesentéricas primarias humanas a nivel de transcriptoma

Resumen

El protocolo describe el aislamiento, el cultivo y el perfil de las células endoteliales de la arteria mesentérica humana. Además, se proporciona un método para preparar la arteria humana para la transcriptómica espacial. La proteómica, la transcriptómica y los ensayos funcionales se pueden realizar en células aisladas. Este protocolo se puede reutilizar para cualquier arteria de tamaño mediano o grande.

Resumen

Las células endoteliales (CE) son cruciales para la función vascular y de todo el cuerpo a través de su respuesta dinámica a las señales ambientales. Dilucidar el transcriptoma y el epigenoma de las CE es primordial para comprender sus funciones en el desarrollo, la salud y la enfermedad, pero está limitado en la disponibilidad de células primarias aisladas. Las tecnologías recientes han permitido el perfil de alto rendimiento del transcriptoma y el epigenoma de la CE, lo que ha llevado a la identificación de subpoblaciones de células de la CE previamente desconocidas y trayectorias de desarrollo. Si bien los cultivos de EC son una herramienta útil en la exploración de la función y la disfunción de la EC, las condiciones de cultivo y los múltiples pasajes pueden introducir variables externas que alteran las propiedades de la EC nativa, incluida la morfología, el estado epigenético y el programa de expresión génica. Para superar esta limitación, el presente artículo demuestra un método para aislar las CE primarias humanas de las arterias mesentéricas de donantes con el objetivo de capturar su estado nativo. Las CE en la capa íntima se disocian mecánica y bioquímicamente con el uso de enzimas particulares. Las células resultantes se pueden usar directamente para la secuenciación de ARN a granel o ARN unicelular o enchapadas para cultivo. Además, se describe un flujo de trabajo para la preparación de tejido arterial humano para transcriptómica espacial, específicamente para una plataforma disponible comercialmente, aunque este método también es adecuado para otras técnicas de perfilado de transcriptoma espacial. Esta metodología se puede aplicar a diferentes vasos recolectados de una variedad de donantes en estados de salud o enfermedad para obtener información sobre la regulación transcripcional y epigenética de la CE, un aspecto fundamental de la biología celular endotelial.

Introducción

Al revestir la luz de los vasos sanguíneos, las células endoteliales (CE) son reguladores cruciales del tono vascular y la perfusión tisular. Las CE son notables en su capacidad para reaccionar al entorno extracelular y adaptarse a los cambios en la dinámica y composición del flujo sanguíneo. Estas respuestas dinámicas están mediadas a través de una red de eventos de señalización intracelular, incluyendo modulaciones transcripcionales y post-transcripcionales con resolución espacio-temporal. La desregulación de estas respuestas está implicada en muchas patologías, incluyendo pero no limitado a enfermedades cardiovasculares, diabetes y cáncer ^1,2.

Una gran proporción de los estudios utilizan líneas celulares o modelos animales para interrogar el transcriptoma de la CE. La primera es una herramienta útil, dada la relativa facilidad de uso y el bajo costo. Sin embargo, el cultivo en serie puede introducir alteraciones fenotípicas en las CE, como características fibroblásticas y una falta de polarización, desconectándolas de su estado in vivo ³. Las células primarias, por ejemplo, la EC de la vena umbilical humana (HUVEC) han sido una opción popular desde la década de 1980, pero se derivan de un lecho vascular del desarrollo que no existe en adultos, por lo que es poco probable que representen completamente las CE maduras. Los animales, especialmente los modelos de ratón, representan mejor el entorno fisiológico o fisiopatológico de las CE y permiten el interrogatorio de los transcriptomas como resultado de la perturbación genética. Las CE murinas se pueden aislar de varios tejidos, incluyendo la aorta, los pulmones y los tejidos adiposos utilizando procedimientos basados en enzimas 4,5,6,7. Sin embargo, las células aisladas no se pueden usar para múltiples pasajes a menos que se transformen⁶ y a menudo están limitadas en número, lo que requiere la agrupación de múltiples animales ^5,8,9.

El advenimiento de nuevas tecnologías que exploran la arquitectura de los vasos a nivel transcriptómico, particularmente con resolución de una sola célula, ha permitido una nueva era de biología endotelial al revelar nuevas funciones y propiedades de las CE 5,10,11,12,13,14. Un rico recurso construido por los investigadores de Tabula Muris recopiló perfiles transcriptómicos unicelulares de 100,000 células, incluidas las CE en 20 órganos murinos diferentes¹⁵, que revelaron genes marcadores de CE comunes y firmas transcriptómicas únicas con diferencias inter e intrasulares ^5,13. Sin embargo, existen claras diferencias entre el ratón y el ser humano en el genoma, el epigenoma y el transcriptoma, especialmente en las regiones no codificantes 16,17,18. Estos inconvenientes antes mencionados enfatizan la importancia del análisis de las CE utilizando muestras humanas para obtener un perfil fiel de las CE en su estado nativo en salud y enfermedad.

La mayoría de los métodos de aislamiento de EC se basan en la disociación física a través de la homogeneización, el corte fino y el picado del tejido antes de la incubación con enzimas proteolíticas durante diferentes tiempos. Las enzimas y condiciones también varían considerablemente entre los tipos de tejido, desde tripsina hasta colagenasa, utilizada sola o en combinación 19,20,21. A menudo se incluye un enriquecimiento o purificación adicional basado en anticuerpos para aumentar la pureza de las CE. Por lo general, los anticuerpos contra los marcadores de membrana EC, por ejemplo, CD144 y CD31 se conjugan con perlas magnéticas y se agregan a la suspensión celular^22,23. Dicha estrategia puede adaptarse generalmente para el aislamiento CE de múltiples tejidos humanos y de ratón, incluidas las técnicas introducidas en este protocolo.

En su estado nativo, las CE interactúan con múltiples tipos de células y pueden existir en nichos vasculares donde la proximidad celular es crucial para la función. Si bien los estudios de secuenciación de ARN unicelular y nuclear único (scRNA y snRNA-seq) han sido primordiales para los avances recientes en la descripción de la heterogeneidad de la CE, el proceso de disociación interrumpe el contexto tisular y el contacto célula-célula, que también son importantes para comprender la biología de la CE. Desarrollado en 2012 y nombrado Método del Año en 2020²⁴, el perfil del transcriptoma espacial se ha utilizado para perfilar la expresión génica global al tiempo que conserva las características espaciales en varios tejidos, incluidos el cerebro²⁵, el tumor²⁶ y el tejido adiposo²⁷. Las tecnologías pueden ser dirigidas, utilizando sondas especializadas específicas para secuencias particulares de ARN unidas a reactivos de afinidad o etiquetas fluorescentes, detectando así genes seleccionados a resolución subcelular 28,29,30,31. También pueden ser no dirigidos^32,33, típicamente usando oligonucleótidos con código de barras espaciales para capturar ARN, que juntos se convierten en ADNc para la posterior preparación de la biblioteca seq y, por lo tanto, tiene la ventaja de deducir la expresión génica de tejido completo de manera imparcial. Sin embargo, la resolución espacial no se logra actualmente a un solo nivel celular con tecnologías disponibles comercialmente. Esto se puede superar hasta cierto punto con la integración de datos con datos scRNA-seq, lo que en última instancia permite el mapeo del transcriptoma unicelular en un contexto tisular complejo al tiempo que conserva su información espacial original³⁴.

Aquí, se describe un flujo de trabajo para perfilar el transcriptoma de EC utilizando la arteria mesentérica superior humana, una arteria periférica que se ha utilizado para estudiar la vasodilatación, la remodelación vascular, el estrés oxidativo y la inflamación 35,36,37. Se describen dos técnicas: 1) aislar y enriquecer las CE a partir de la íntima de los vasos sanguíneos combinando la disociación mecánica y la digestión enzimática adecuadas para la secuenciación del transcriptoma unicelular o el posterior cultivo in vitro; 2) preparar secciones arteriales para el perfil del transcriptoma espacial (Figura 1). Estas dos técnicas se pueden realizar de forma independiente o complementaria para perfilar las CE y sus células circundantes. Además, este flujo de trabajo se puede adaptar para su uso en cualquier arteria mediana o grande.

Protocolo

Se realizaron estudios de tejidos humanos en especímenes no identificados obtenidos del Centro de Recursos de Células de Islotes del Sur de California en City of Hope. Los consentimientos de la investigación para el uso de tejidos humanos postmortem se obtuvieron de los familiares de los donantes, y la aprobación ética para este estudio fue otorgada por la Junta de Revisión Institucional de City of Hope (IRB No. 01046).

1. Disociación física (tiempo estimado: 1-2 h)

1. Coloque una arteria fresca en un plato de 10 cm y lávese con solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) estéril de Dulbecco.
2. Con pinzas estériles y tijeras de disección, retire la grasa y los tejidos conectivos externos hasta que el vaso esté limpio. Mida la longitud del recipiente con una regla colocada fuera del plato y tome fotografías para los registros (Figura 1A).
3. Tampón de digestión apropiado precalentado a 37 ° C: para scRNA-seq use la enzima de disociación celular; para los ensayos de cultivo celular utilizar 1-6 mg/mL de colagenasa D, 3 mg/mL de proteasa derivada de bacterias, 100 mM de HEPES, 120 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 5 mM de glucosa, con 1 mM de CaCl₂ ^6,38 (pH 7,0, no requiere ajuste) añadido 5 min antes de su uso.
4. Tome la arteria mesentérica (típicamente con un diámetro de 6-8 mm) y corte longitudinalmente con tijeras para abrir la luz del vaso verticalmente.
5. Usando agujas, conecte el recipiente a la cera negra en las cuatro esquinas, dejando la íntima expuesta (Figura 1B).
6. Agregue 1 ml de tampón de digestión precalentado a la íntima. Tome un bisturí estéril y raspe la luz del vaso suavemente dos veces.
   NOTA: El propósito de este procedimiento es disociar la capa íntima, que puede necesitar práctica. Se necesita ejercer suficiente fuerza para eliminar el endotelio, pero no tanto como para que también se eliminen las capas más profundas de tejido, lo que reducirá la representación de la CE.
7. Transfiera el tampón de digestión a un tubo de 5 ml. Agregue 1 ml de tampón de digestión a la íntima y bombee hacia arriba y hacia abajo con cuidado para recoger las células restantes y agregar al tubo de 5 ml. Incubar las células a 37 °C, girando a 150 rpm durante 5 min.
8. Agregue 2 ml de medio M199 (o D-PBS si procede con scRNA-seq) a la suspensión celular para apagar la reacción enzimática. Mezclar suavemente y centrifugar a 4 °C, 600 x g durante 5 min.
9. Retire el sobrenadante y guarde el sobrenadante por separado para cultivarlo como control para observar si todas las células se capturan en el pellet en el paso 1.8. Resuspend el pellet celular en 1 mL de medio M199 (o D-PBS si se procede con scRNA-seq).
10. Evaluar la viabilidad celular mezclando 10 μL de azul de tripano con 10 μL de stock celular. Observe la morfología celular y cuente las células usando un hemocitómetro.
    NOTA: En este punto, las células pueden ser utilizadas para la cuantificación de proteínas o ARN o cultivadas in vitro utilizando medios de cultivo EC siguiendo los protocolos estándar³⁹. Alternativamente, se pueden preparar para la secuenciación como se describe en la siguiente sección.
11. Para el cultivo, cubra dos pocillos de una placa de 6 pocillos pipeteando 500 μL de reactivo de fijación en pozos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el reactivo de fijación y lavarlo con D-PBS estéril, dispensar el stock de celdas completas en un pozo y mantener el sobrenadante como control en el segundo pozo.

2. Preparación para estudios de scRNA-seq (tiempo estimado: 3-4 h)

1. Centrifugar el material celular desde el paso 1.11 a 4 °C, 600 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet suavemente con una pipeta P1000 y una punta de orificio ancho en 1 ml de albúmina sérica bovina (BSA) al 0,04% en D-PBS. Mezcle bien para asegurar una suspensión de una sola celda.
2. Pase la solución a través de un colador de 40 μm para eliminar los restos celulares. Si quedan escombros, pase a través de un segundo colador a 4 ml de BSA al 0.04% en D-PBS.
3. Centrífuga a 4 °C, 600 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 μL de BSA al 0,04% en D-PBS utilizando una pipeta P1000 con una punta de pipeta de diámetro ancho. Mezcle bien para asegurar una suspensión de una sola celda.
4. Evaluar la viabilidad celular mezclando 10 μL de stock celular con 10 μL de azul de tripano. Usando un hemocitómetro, observe la morfología, determine si hay una suspensión de una sola célula sin grupos, verifique si hay restos de tejido y calcule el número de células vivas y muertas.
5. Si las células están agrupadas o quedan restos, repita el lavado con BSA al 0,04% en D-PBS o vuelva a pasar por el colador de 40 μm.
   NOTA: Si bien esto reducirá el rendimiento, es importante que las células existan en una suspensión limpia de una sola célula para una secuenciación óptima.
6. La suspensión unicelular se puede utilizar para scRNA-seq.

3. Perfil del transcriptoma espacial (tiempo estimado: 3-4 h)

1. Agregue isopentano (2-metilbutano) a un recipiente de metal y enfríe en nitrógeno líquido (LN₂) o hielo seco (se prefiere LN₂ , ya que llevará la temperatura más baja que el hielo seco). Vierta el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) en los pocillos de criomolds de plástico etiquetados teniendo cuidado de no crear burbujas y eliminar las que aparecen. Deje criomold sobre hielo seco para que se enfríe.
2. Cortar al menos dos secciones coronales, 1 cm de longitud del vaso. Usando fórceps largas (12"), sumerja el tejido en isopentano hasta que se congele. Sumerja rápidamente el tejido en OCT en orientación con el lumen visible en el centro. Tenga cuidado de eliminar cualquier burbuja, especialmente las que están al lado del tejido.
3. Usando fórceps largas (12"), agarre los criomoldes y sosténgalos en el bote de metal. Si bien la base de los moldes debe estar en el líquido, no debe ser demasiado profunda para permitir que el isopentano corra sobre el tejido. Observe la congelación, la OCT se volverá blanca progresivamente desde el exterior en 1-2 min.
4. Guarde estas secciones en un recipiente sellado a -80 °C durante un máximo de 6 meses.
   NOTA: Mantenga las muestras en hielo seco en todo momento y no permita más de un ciclo de congelación-descongelación. Este tejido se puede utilizar para análisis histológicos, hibridación in situ de fluorescencia de ARN / ADN (FISH) o transcriptómica espacial, que se describirá ahora.
5. Ajuste la temperatura del criostato a -20 °C para la cámara y -10 °C para la cabeza de la muestra. Equilibre las secciones de recipientes incrustados en OCT, cuchillos, cepillos y diapositivas a -20 ° C en el criostato durante aproximadamente 30 minutos. Mientras equilibra, limpie la máquina y todo el equipo que pueda tocar las secciones, incluida la cuchilla, con etanol al 70% seguido de una solución de descontaminación RNasa.
6. Coloque la muestra dispensando una pequeña cantidad de OCT en el bloque de criostato circular y colocando la muestra encima antes de que se congele. Coloque el bloque en el centro de la cabeza de la muestra y atornille el bloque en su lugar con un mango negro alto a la izquierda. Elimine cualquier exceso de OCT que rodee el recipiente.
7. Ajuste el espesor de corte a 10 μm en el criostato, corte aproximadamente 60 secciones y colóquelas en un tubo preenfriado de 1,5 ml. Estas secciones se utilizarán para evaluar la calidad del ARN. Tras la extracción del criostato, agregue inmediatamente 1 ml de reactivo de extracción de ARN y vórtice hasta que las secciones se disuelvan por completo.
8. Agregue 200 μL de cloroformo y mezcle hasta que la solución se asemeje a un batido de fresa. Centrifugadora a 11.200 x g durante 10 min a 4 °C.
9. Recoger la fase acuosa (fase clara sobre las capas blancas y rosadas) y añadirle 500 μL de isopropanol. Mezclar invirtiendo los tubos más de 10 veces y colocar a -80 °C durante al menos 20 min.
10. Centrifugadora a 11.200 x g durante 10 min a 4 °C. Disuelva el pellet de ARN purificado en 5 μL de agua libre de RNasa. Examine el número de integridad del ARN (RIN).
    NOTA: Se prefieren las muestras con RIN ≥ 7, pero RIN ≥ 6 es aceptable. El número de secciones de tejido y el volumen de solución para la disolución de ARN pueden requerir optimización dependiendo del sistema utilizado para garantizar que la concentración final de ARN esté dentro del rango de función RIN para permitir una evaluación precisa de RIN.
11. Practique cortar y colocar secciones correctamente dentro de los marcos fiduciarios utilizando portaobjetos de vidrio lisos antes de proceder a la optimización de tejidos disponibles comercialmente o a los portaobjetos de expresión génica. Esto se puede lograr dibujando cuadrados de 6,5 mm x 6,5 mm en un portaobjetos de vidrio liso, enfriando a -20 ° C en el criostato y colocando secciones en esta área de captura.
12. Corte las secciones de 10 μm con la placa estabilizadora en su lugar, voltee y aplane cuidadosamente tocando suavemente la sección a través de la OCT circundante.
13. Usando cepillos de criostato sin RNasa, coloque la sección de tejido dentro del cuadrado, usando solo la OCT circundante. Coloque inmediatamente un dedo (con guantes) en la parte posterior del área de captura para derretir la sección en la diapositiva.
14. Una vez que la sección se haya adherido, coloque la diapositiva en la criobar para permitir que la sección se congele. Se debe tener cuidado para evitar el plegamiento del tejido y el tejido que recubre los bordes demarcados del marco fiduciario. Si es necesario, corte el tejido en mitades o cuartos a lo largo del lumen con una cuchilla para asegurarse de que la sección del recipiente encaje dentro del marco de 6,5 mm x 6,5 mm.
15. Corte secciones de tejido de 10 μm según 3.12-3.14 en diapositivas de optimización de tejidos o de expresión génica. Transfiera la diapositiva a un correo de diapositivas colocado sobre hielo seco. Almacene las diapositivas a -80 °C durante un máximo de 4 semanas antes de continuar con los protocolos espaciales publicados^33,34.

4. Análisis de datos de secuenciación (tiempo estimado: hasta 1 semana dependiendo de la familiaridad con el software)

NOTA: Solo para el análisis transcriptómico espacial, vaya al paso 4.8. Los datos de scRNA-seq se procesan utilizando la tubería estandarizada alineada con el transcriptoma de referencia hg38 humano. El paquete R Seurat (v3.2.2) se utiliza para analizar datos de scRNA-seq siguiendo las directrices publicadas⁴⁰.

1. Filtrar utilizando métricas de control de calidad bien establecidas: se eliminan las células raras con un número muy alto de genes (potencialmente multiplets) y las células con altos porcentajes mitocondriales (las células de baja calidad o moribundas a menudo presentan contaminación mitocondrial).
2. Normalice los datos utilizando "sctransform", un método para mejorar la integración de muestras en comparación con la normalización de registros. Estos datos normalizados se utilizan para la reducción de la dimensionalidad y la agrupación, mientras que los niveles de expresión logarítmicos se utilizan para el análisis basado en los niveles de expresión génica, como la clasificación de tipo celular⁴¹.
3. Seleccionar genes marcadores por tipo de célula, por ejemplo, molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias-1 (PECAM1) y factor von Willebrand (VWF) para CE, lumican (LUM) y potenciador de procolágeno C-endopeptidasa (PCOLCE) para fibroblastos, gen de translocación de células B 1 (BTG1) y CD52 para macrófagos, C1QA y C1QB para monocitos, y cadena pesada de miosina 11 (MYH11) y transgelina (TAGLN) para las células del músculo liso vascular³⁶.
4. Calcule el nivel de expresión promedio entre celdas individuales entre cada par de marcadores para tener un solo marcador con un nivel de expresión promedio asociado con cada tipo de celda⁴².
5. Aplicar un modelo de mezcla gaussiana (GMM) con dos componentes a los datos de expresión de cada marcador a través de celdas individuales para separar las celdas en dos conjuntos, es decir, expresar altamente el marcador y expresar humildemente el marcador. De esta manera, para cada marcador, cada celda individual se asigna a uno de los dos componentes⁴².
6. Utilice el enriquecimiento estadístico para el conjunto de genes marcadores, una prueba exacta de Fisher, para asignar un tipo de célula a cada grupo. Al hacerlo, se obtiene un conjunto de valores p por clúster, cada uno correspondiente a un tipo de celda. El tipo de celda con el valor p más bajo se asigna a ese clúster.
7. Procese los datos transcriptómicos espaciales utilizando las tuberías de Space Ranger, lo que resulta en descócidos espaciales y generación de métricas de control de calidad (QC), incluidas las lecturas alineadas totales con el transcriptoma humano hg38, el número medio de identificador molecular único (UMI) o genes por punto³⁵.
   NOTA: El paquete R Seurat (v3.2.2) se utiliza para analizar los datos procesados por Space Ranger siguiendo las directrices publicadas⁴⁰.
8. Normalizar los datos utilizando "sctransform", un método que se ha demostrado que mejora el análisis aguas abajo en comparación con la normalización logarítmica dada la heterogeneidad del tejido y la varianza muy alta en los recuentos a través de las manchas.

Resultados

El análisis de las CE de la arteria mesentérica utilizando una combinación de disociación mecánica y enzimática o criopreservación para su uso en varios ensayos aguas abajo se representa aquí (Figura 1). Las CE se pueden perfilar en las arterias mesentéricas utilizando los siguientes pasos: A) disociación mecánica de la íntima junto con la digestión de la colagenasa a las células de cultivo; B) generación de suspensión unicelular para scRNA-seq; o C) las secciones transversal...

Discusión

El flujo de trabajo presentado detalla un conjunto de técnicas para perfilar las CE a partir de una sola pieza de arteria humana con resolución espacial y de una sola célula. Hay varios pasos críticos y factores limitantes en el protocolo. Una clave para el perfil del transcriptoma es la frescura del tejido y la integridad del ARN. Es importante mantener los tejidos en hielo tanto como sea posible antes del procesamiento para minimizar la degradación del ARN. Por lo general, los tejidos post mortem se procesan entre...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL micro-centrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
23G needles	BD	305145
2-methylbutane	Thermo Fisher	AC327270010
40 µm strainer	Fisher	14100150
4200 TapeStation System	Agilent Technologies	G2991BA
5 mL tube	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
Attachment factor	Cell Applications	123-500	Attachment reagent in the protocol
Black wax			Any commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Chloroform	Fisher	C607
Collagenase D	Roche	11088866001
Cryostat	Leica
Cryostat brushes
D-Glucose	Fisher	D16-1
Dimethyl sulfoxide	Fisher	MT25950CQC
Dispase II	Roche	4942078001	Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
D-PBS	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Hemocytometer	Fisher	267110
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-100g
High sensitivity D1000 sample buffer	Agilent Technologies	5067-5603
High sensitivity D1000 screen tape	Agilent Technologies	5067-5584
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
Isopropanol	Fisher	BP26324
KCl	Fisher	P217-3
Liquid nitrogen
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Metal cannister
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Microvascular endothelial culture medium	Cell Applications	111-500
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
Optimal Cutting Temperature compound	Fisher	4585
Plastic cryomolds	Fisher	22363553
RNA screen tape	Agilent Technologies	5067-5576
RNA screen Tape sample buffer	Agilent Technologies	5067-5577
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B	RNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Superfrost PLUS Gold Slides	Fisher	1518848
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red	Thermo Fisher	12605010	Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns	10X Genomics	PN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns	10X Genomics	PN-1000184