Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מתאר את הבידוד, התרבית והפרופיל של תאי האנדותל מהעורק המזנטרי האנושי. בנוסף, מסופקת שיטה להכנת העורק האנושי לתעתיק מרחבי. פרוטאומיקה, תעתיק ובדיקות תפקודיות יכולות להתבצע על תאים מבודדים. פרוטוקול זה יכול להיות repurposed עבור כל עורק בגודל בינוני או גדול.

Abstract

תאי אנדותל (ECs) חיוניים לתפקוד כלי הדם והגוף כולו באמצעות התגובה הדינמית שלהם לרמזים סביבתיים. הבהרת השעתוק והאפיגנום של ECs היא בעלת חשיבות עליונה להבנת תפקידם בהתפתחות, בבריאות ובמחלות, אך היא מוגבלת בזמינותם של תאים ראשוניים מבודדים. הטכנולוגיות האחרונות אפשרו פרופיל בתפוקה גבוהה של תעתיק EC ואפיגנום, מה שהוביל לזיהוי תת-אוכלוסיות של תאי EC שלא היו ידועים קודם לכן ומסלולי התפתחות. בעוד שתרביות EC הן כלי שימושי בחקר תפקוד EC וחוסר תפקוד לקוי, תנאי התרבית והקטעים המרובים יכולים להציג משתנים חיצוניים המשנים את התכונות של EC ילידי, כולל מורפולוגיה, מצב אפיגנטי ותוכנית ביטוי גנים. כדי להתגבר על מגבלה זו, המאמר הנוכחי מדגים שיטה לבידוד ECs ראשוניים אנושיים מעורקים מזנטריים של תורמים שמטרתם ללכוד את מצב מולדתם. ECs בשכבה האינטימית מנותקים מכנית וביוכימית עם שימוש באנזימים מסוימים. התאים המתקבלים יכולים לשמש ישירות לריצוף RNA בתפזורת או לריצוף RNA חד-תאי או מצופה לתרבית. בנוסף, מתוארת זרימת עבודה להכנת רקמת עורקים אנושית עבור תעתיק מרחבי, במיוחד עבור פלטפורמה זמינה מסחרית, אם כי שיטה זו מתאימה גם לטכניקות אחרות של פרופיל תעתיק מרחבי. ניתן ליישם מתודולוגיה זו על כלי שיט שונים שנאספו ממגוון תורמים במצבי בריאות או מחלות כדי לקבל תובנות לגבי ויסות שעתוק ואפיגנטי של EC, היבט מרכזי בביולוגיה של תאי האנדותל.

Introduction

תאי האנדותל (ECs) הם מווסתים חיוניים של טונוס כלי הדם ושל זלוף הרקמות. ECs הם יוצאי דופן ביכולתם להגיב לסביבה החוץ-תאית ולהסתגל לשינויים בדינמיקה ובהרכב של זרימת הדם. תגובות דינמיות אלה מתווכות באמצעות רשת של אירועי איתות תוך-תאיים, כולל אפנון שעתוק ופוסט-שעתוק עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית. חוסר הוויסות של תגובות אלה מעורב בפתולוגיות רבות, כולל אך לא מוגבל למחלות לב וכלי דם, סוכרת וסרטן 1,2.

חלק גדול מהמחקרים עושים שימוש בקווי תאים או במודלים של בעלי חיים כדי לחקור את תעתיק ה-EC. הראשון הוא כלי שימושי, בהתחשב בקלות השימוש היחסית ובזולות. עם זאת, התרבות הסדרתית יכולה להכניס שינויים פנוטיפיים ל-ECs, כגון תכונות פיברובלסטיות וחוסר קיטוב, ולנתק אותן ממצב ה-in vivo 3 שלהן. התאים הראשוניים, למשל, EC של וריד טבור אנושי (HUVEC) היו בחירה פופולרית מאז שנות ה-80 של המאה ה-20, אך הם נגזרים ממצע כלי דם התפתחותי שאינו קיים אצל מבוגרים, ולכן לא סביר שייצגו באופן מלא ECs בוגרים. בעלי חיים, במיוחד מודלים של עכברים, מייצגים טוב יותר את הסביבה הפיזיולוגית או הפתופיזיולוגית של ECs ומאפשרים חקירה של תעתיקים כתוצאה מהפרעה גנטית. ניתן לבודד את ה-ECs של מורין מרקמות שונות, כולל אבי העורקים, הריאות ורקמות השומן באמצעות הליכים מבוססי אנזימים 4,5,6,7. עם זאת, לא ניתן להשתמש בתאים המבודדים עבור מעברים מרובים אלא אם כן הם מומרים6 ולעתים קרובות הם מוגבלים במספרם, מה שדורש איגום מבעלי חיים מרובים 5,8,9.

הופעתן של טכנולוגיות חדשות החוקרות את ארכיטקטורת כלי השיט ברמה תעתיקית, במיוחד עם רזולוציה של תא יחיד, אפשרה עידן חדש של ביולוגיה אנדותל על ידי חשיפת פונקציות ותכונות חדשניות של ECs 5,10,11,12,13,14. משאב עשיר שנבנה על ידי חוקרי טאבולה מוריס אסף פרופילי תעתיק חד-תאיים של 100,000 תאים, כולל ECs על פני 20 איברי מורין שונים15, אשר חשפו הן גנים נפוצים של סמן EC והן חתימות תעתיק ייחודיות עם הבדלים בין רקמותותוך-רקמה 5,13. עם זאת, ישנם הבדלים ברורים בין עכבר לאדם בגנום, באפיגנום ובשעתוק, במיוחד באזורים שאינם מקודדים 16,17,18. חסרונות אלה הנ"ל מדגישים את החשיבות של ניתוח של ECs באמצעות דגימות אנושיות על מנת לקבל פרופיל נאמן של ECs במדינת מולדתם בבריאות ומחלות.

רוב שיטות הבידוד של EC מסתמכות על דיסוציאציה פיזית באמצעות הומוגניזציה, חיתוך דק וטחינה של הרקמה לפני הדגירה עם אנזימים פרוטאוליטיים לזמנים שונים. האנזימים והתנאים גם משתנים במידה ניכרת בין סוגי הרקמות, מטריפסין ועד קולגן, המשמשים לבדם או בשילוב 19,20,21. העשרה או טיהור נוספים מבוססי נוגדנים נכללים לעתים קרובות כדי להגביר את טוהר ה- ECs. בדרך כלל, נוגדנים נגד סמני ממברנה EC, למשל, CD144 ו- CD31 מצומדים לחרוזים מגנטיים ומוסיפים לתרחיף התא22,23. אסטרטגיה כזו יכולה להיות מותאמת באופן כללי לבידוד EC ממספר רקמות אנושיות ועכבריות, כולל הטכניקות שהוצגו בפרוטוקול זה.

במצבם המקורי, ECs מקיימים אינטראקציה עם סוגי תאים מרובים ועשויים להתקיים בנישות כלי דם שבהן קרבת התאים חיונית לתפקוד. בעוד שמחקרים של ריצוף RNA חד-תאי וחד-גרעיני (scRNA ו-snRNA-seq) היו בעלי חשיבות עליונה לפריצות הדרך האחרונות בתיאור ההטרוגניות של EC, תהליך הדיסוציאציה משבש את הקשר הרקמות ואת המגע בין התא לתא, שגם הם חשובים להבנת הביולוגיה של EC. פותח בשנת 2012 ונבחר לשיטת השנה בשנת 202024, פרופיל תעתיק מרחבי שימש לפרופיל ביטוי גנים גלובלי תוך שמירה על המאפיינים המרחביים ברקמות שונות כולל מוח25, גידול26 ורקמת שומן27. ניתן למקד את הטכנולוגיות, תוך שימוש בגששים מיוחדים ספציפיים לרצפי RNA מסוימים המחוברים לריאגנטים של זיקה או לתגים פלואורסצנטיים, ובכך לזהות גנים נבחרים ברזולוציה תת-תאית 28,29,30,31. הם יכולים גם להיות לא ממוקדים32,33, בדרך כלל באמצעות אוליגונוקלאוטידים בעלי ברקוד מרחבי כדי ללכוד רנ"א, אשר יחד מומרים ל-cDNA להכנת ספריית seq לאחר מכן ולכן יש להם את היתרון של הסקת ביטוי גנים של רקמות שלמות באופן בלתי משוחד. עם זאת, רזולוציה מרחבית אינה מושגת כיום ברמה תאית אחת עם טכנולוגיות זמינות מסחרית. ניתן להתגבר על כך במידה מסוימת באמצעות שילוב נתונים עם נתוני scRNA-seq, מה שבסופו של דבר מאפשר מיפוי של תעתיק חד-תאי בהקשר של רקמה מורכבת תוך שמירה על המידע המרחבי המקורי שלו34.

כאן, מתוארת זרימת עבודה לפרופיל תעתיק EC באמצעות עורק מזנטרי עליון אנושי, עורק היקפי ששימש לחקר הרחבת כלי דם, שיפוץ כלי דם, עקה חמצונית ודלקת 35,36,37. שתי טכניקות מתוארות: 1) לבודד ולהעשיר ECs מן האינטימה של כלי הדם המשלבים דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי המתאים לריצוף תעתיק של תאים בודדים או לתרבית מבחנה שלאחר מכן; 2) להכין מקטעי עורקים ליצירת פרופיל תעתיק מרחבי (איור 1). ניתן לבצע את שתי הטכניקות הללו באופן עצמאי או משלים לפרופיל ECs ולתאים הסובבים אותם. יתר על כן, ניתן להתאים זרימת עבודה זו לשימוש בכל עורק בינוני או גדול.

Protocol

מחקרי רקמות אנושיות נערכו על דגימות לא מזוהמות שהתקבלו ממרכז משאבי התאים של האיים של דרום קליפורניה בעיר התקווה. ההסכמות המחקריות לשימוש ברקמות אנושיות לאחר המוות התקבלו מקרובי משפחתם של התורמים, ואישור אתי למחקר זה ניתן על ידי מועצת הביקורת המוסדית של עיר התקווה (IRB No. 01046).

1. דיסוציאציה פיזית (זמן משוער: 1-2 שעות)

  1. מניחים עורק טרי על תבשיל בקוטר 10 ס"מ ושוטפים עם מלח סטרילי של Dulbecco עם מאגר פוספט (D-PBS).
  2. עם מלקחיים סטריליים ומספריים דיסקציה, להסיר את השומן ואת רקמות החיבור החיצוניות עד הכלי נקי. מדוד את אורך הכלי עם סרגל המוצב מחוץ לצלחת וצלם תמונות לתיעוד (איור 1A).
  3. חיץ עיכול מתאים מראש ל-37 מעלות צלזיוס: עבור scRNA-seq השתמשו באנזים דיסוציאציה של תאים; עבור מבחני תרביות תאים, השתמשו ב-1-6 מ"ג/מ"ל של קולגןאז D, 3 מ"ג/מ"ל של פרוטאז שמקורו בחיידקים, 100 mM של HEPES, 120 mM של NaCl, 50 mM של KCl, 5 mM של גלוקוז, עם 1 mM של CaCl2 6,38 (pH 7.0, אינו דורש התאמה) שנוספו 5 דקות לפני השימוש.
  4. קח את העורק המזנטרי (בדרך כלל בקוטר של 6-8 מ"מ) וחתוך לאורך עם מספריים כדי לפתוח את לומן הכלי אנכית.
  5. באמצעות מחטים, חברו את הכלי לשעווה שחורה בכל ארבע הפינות, והשאירו את האינטימה חשופה (איור 1B).
  6. מוסיפים 1 מ"ל של מאגר עיכול שחומם מראש לאינטימה. קח אזמל סטרילי ולגרד את לומן של הכלי בעדינות פעמיים.
    הערה: מטרת הליך זה היא לנתק את השכבה האינטימית, שעשויה להצריך תרגול. מספיק כוח צריך להיות מופעל כדי להסיר אנדותל, אבל לא כל כך הרבה כי שכבות עמוקות יותר של רקמה מוסרים גם, אשר יפחית את ייצוג EC.
  7. מעבירים את חיץ העיכול לצינור של 5 מ"ל. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ עיכול לאינטימה ופיפטה למעלה ולמטה בזהירות כדי לאסוף את התאים הנותרים ולהוסיף לצינור 5 מ"ל. תאי דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, מסתובבים ב-150 סל"ד למשך 5 דקות.
  8. הוסף 2 מ"ל של M199 בינוני (או D-PBS אם ממשיכים עם scRNA-seq) לתרחיף התא כדי להרוות את התגובה האנזימטית. מערבבים בעדינות וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 600 x גרם למשך 5 דקות.
  9. הסר את הסופרנטנט ואחסן את הסופרנאטנט בנפרד לתרבית כבקרה כדי לבחון אם כל התאים נלכדים בכדור בשלב 1.8. בצעו החייאה של כדור התא ב-1 מ"ל של מדיום M199 (או D-PBS אם ממשיכים עם scRNA-seq).
  10. הערך את כדאיות התא על-ידי ערבוב של 10 μL של כחול טריפאן עם 10 μL של מלאי התאים. שימו לב למורפולוגיה של התאים וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.
    הערה: בשלב זה, ניתן להשתמש בתאים לכימות חלבונים או RNA או בתרבית במבחנה באמצעות מדיה של תרבית EC בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים39. לחלופין, ניתן להכין אותם לריצוף כמתואר בסעיף הבא.
  11. עבור התרבות, מצפים שתי בארות של צלחת של 6 בארות על ידי צנרת 500 μL של מגיב חיבור לתוך בארות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת ריאגנט חיבור ושטיפה עם D-PBS סטרילי, מחלקים את מלאי התאים המלא לבאר אחת, והסופרנטנט נשמר כבקרה לתוך הבאר השנייה.

2. הכנה למחקרי scRNA-seq (זמן משוער: 3-4 שעות)

  1. צנטריפוגה מלאי התאים משלב 1.11 ב 4 °C ,600 x g במשך 5 דקות. מוציאים את הסופרנטנט ומחזירים את הכדור בעדינות עם פיפטה P1000 וטיפ רחב ב-1 מ"ל של 0.04% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-D-PBS. ערבבו היטב כדי להבטיח השעיה חד-תאית.
  2. מעבירים את התמיסה דרך מסננת של 40 מיקרומטר כדי להסיר את פסולת התאים. אם נשארת פסולת, עברו דרך מסננת שנייה ל-4 מ"ל של 0.04% BSA ב-D-PBS.
  3. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 600 x גרם למשך 5 דקות. הסר את ה-supernatant והחזיר את הכדור ב-500 μL של 0.04% BSA ב-D-PBS באמצעות פיפטה P1000 עם קצה פיפטה רחב-נשא. ערבבו היטב כדי להבטיח השעיה חד-תאית.
  4. הערך את הכדאיות של התא על-ידי ערבוב של 10 μL של מלאי התאים עם 10 μL של טריפאן כחול. באמצעות המוציטומטר, שימו לב למורפולוגיה, קבעו אם יש תרחיף חד-תאי ללא אשכולות, בדקו אם יש פסולת רקמה, וחשבו את מספר התאים החיים והמתים.
  5. אם התאים מקובצים או נשארת פסולת, יש לחזור על שטיפה עם 0.04% BSA ב-D-PBS או לעבור שוב דרך מסננת של 40 מיקרומטר.
    הערה: אמנם זה יפחית את התפוקה, אך חשוב שהתאים יתקיימו בתרחיף נקי של תא יחיד לריצוף אופטימלי.
  6. ההשעיה החד-תאית יכולה לשמש ל-scRNA-seq.

3. פרופיל תעתיק מרחבי (זמן משוער: 3-4 שעות)

  1. מוסיפים איזופנטן (2-מתילבוטאן) למכל מתכת וצוננים בחנקן נוזלי (LN2) או בקרח יבש (LN2 עדיף מכיוון שהוא יביא את הטמפרטורה נמוכה יותר מקרח יבש). יוצקים תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בבארות של קריומולדות פלסטיק מסומנות תוך הקפדה לא ליצור בועות ולהסיר את אלה המופיעות. השאירו את הקריומלד על קרח יבש כדי להצטנן.
  2. חותכים לפחות שני חלקים קורונליים, 1 ס"מ אורך הכלי. באמצעות מלקחיים ארוכים (12 אינץ') מטביעים את הרקמה באיזופנטן עד להקפאה. הטביע במהירות את הרקמה ב- OCT בכיוון עם הלומן הנראה במרכז. הקפידו להסיר בועות, במיוחד אלה שליד הרקמה.
  3. באמצעות מלקחיים ארוכים (12 אינץ'), תפסו את הקרימולדים והצמידו אותם למכל המתכת. בעוד הבסיס של תבניות צריך להיות בנוזל, זה לא צריך להיות עמוק מדי כדי לאפשר איזופנטן לרוץ על הרקמה. שימו לב להקפאה, ה-OCT יהפוך ללבן בהדרגה מבחוץ תוך 1-2 דקות.
  4. אחסן חלקים אלה במיכל אטום בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) למשך עד 6 חודשים.
    הערה: שמרו דגימות על קרח יבש בכל עת ואל תאפשרו יותר ממחזור הפשרה אחד של הקפאה. רקמה זו יכולה לשמש לניתוח היסטולוגי, פלואורסצנציה של RNA/DNA בהכלאה באתרה (FISH), או תעתיק מרחבי, שיתואר כעת.
  5. הגדר את טמפרטורת הקריוסטט ל -20 מעלות צלזיוס עבור החדר ו -10 מעלות צלזיוס עבור ראש הדגימה. שיווי משקל OCT משובץ קטעי כלי שיט, סכינים, מברשות, ומגלשות ל -20 מעלות צלזיוס בקריוסטאט למשך כ -30 דקות. תוך כדי שיווי משקל, נקו את המכונה ואת כל הציוד שעשוי לגעת בחלקים, כולל הלהב, עם 70% אתנול ואחריו תמיסת RNase deontamination.
  6. חברו את הדגימה על ידי חלוקת כמות קטנה של OCT על בלוק ה-cryostat העגול והנחת הדגימה למעלה לפני שהיא קופאת. מניחים את הבלוק במרכז ראש הדגימה ומבריגים את הבלוק במקומו באמצעות ידית שחורה גבוהה משמאל. חתכו כל עודף OCT המקיף את כלי השיט.
  7. הגדרת עובי החיתוך ל-10 מיקרומטר על הקריוסטט, חותכים כ-60 חלקים ומניחים אותם בצינור מקורר מראש של 1.5 מ"ל. סעיפים אלה ישמשו להערכת איכות הרנ"א. עם הסרת הקריוסטט, יש להוסיף מיד 1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA ומערבולת עד שהקטעים מומסים לחלוטין.
  8. מוסיפים 200 μL של כלורופורם ומערבבים עד שהתמיסה דומה למילקשייק תות. צנטריפוגה ב 11,200 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F).
  9. אספו את הפאזה המימית (פאזה שקופה על גבי שכבות לבנות וורודות) והוסיפו לה 500 μL של איזופרופנול. מערבבים על ידי היפוך הצינורות מעל 10 פעמים ומניחים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות.
  10. צנטריפוגה ב 11,200 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F). ממיסים את גלולת ה-RNA המטוהרת ב-5 μL של מים נטולי RNase. בדוק את מספר שלמות הרנ"א (RIN).
    הערה: דוגמאות עם RIN ≥ 7 עדיפות, אך RIN ≥ 6 מקובל. מספר חלקי הרקמה ונפח התמיסה להמסת RNA עשויים לדרוש אופטימיזציה בהתאם למערכת המשמשת כדי להבטיח שריכוז הרנ"א הסופי נמצא בטווח התפקוד של RIN כדי לאפשר הערכת RIN מדויקת.
  11. תרגלו חיתוך והצבה של מקטעים בצורה נכונה בתוך המסגרות הפידוקיאליות באמצעות שקופיות זכוכית רגילות לפני שתמשיכו לאופטימיזציה של רקמות זמינות מסחרית או לשקופיות ביטוי גנים. ניתן להשיג זאת על ידי ציור ריבועים של 6.5 מ"מ x 6.5 מ"מ על מגלשת זכוכית רגילה, קירור ל -20 מעלות צלזיוס בקריוסטאט, והצבת חלקים באזור לכידה זה.
  12. חותכים מקטעים של 10 מיקרומטר עם צלחת נגד גלגול במקום, הופכים ומשטיחים בזהירות על ידי נגיעה עדינה בקטע דרך ה-OCT שמסביב.
  13. באמצעות מברשות cryostat ללא RNase ממקמות את חלק הרקמה בתוך הריבוע, תוך שימוש רק ב- OCT שמסביב. יש להניח מיד אצבע אחת (בכפפות) על החלק האחורי של אזור הלכידה כדי להמיס את החלק אל המגלשה.
  14. לאחר שהקטע נדבק, הניחו את השקופית על ה-cryobar כדי לאפשר למקטע להקפיא. יש להיזהר כדי למנוע קיפול רקמות ורקמות מעל הקצוות המסומנים של המסגרת הפידוקיאלית. במידת הצורך, חתכו את הרקמה לחצאים או לרבעים לאורך הלומן באמצעות להב כדי לוודא שמקטע הכלי מתאים למסגרת של 6.5 מ"מ x 6.5 מ"מ.
  15. חותכים 10 מיקרומטר מקטעי רקמה לפי 3.12-3.14 לאופטימיזציה של רקמות או לשקופיות ביטוי גנים. העבר את המגלשה לדואר שקופיות המונח על קרח יבש. אחסן שקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות לפני שתמשיך עם פרוטוקולים מרחביים שפורסמו33,34.

4. ניתוח נתוני רצף (זמן משוער: עד שבוע אחד בהתאם להיכרות עם התוכנה)

הערה: לניתוח תעתיק מרחבי בלבד, דלג לשלב 4.8. נתוני scRNA-seq מעובדים באמצעות הצינור הסטנדרטי המותאם לתעתיק הייחוס האנושי hg38. חבילת R Seurat (v3.2.2) משמשת לניתוח נתוני scRNA-seq בעקבות הנחיותשפורסמו 40.

  1. מסננים באמצעות מדדי בקרת איכות מבוססים היטב: תאים נדירים עם מספר גבוה מאוד של גנים (פוטנציאליים מכפילים) ותאים עם אחוזי מיטוכונדריאליים גבוהים (תאים באיכות נמוכה או גוססים מציגים לעתים קרובות זיהום מיטוכונדריאלי) מוסרים.
  2. נרמל נתונים באמצעות "sctransform", שיטה לשיפור שילוב הדגימה בהשוואה לנורמליזציה של יומן. נתונים מנורמלים אלה משמשים להפחתת ממדיות ולאשכולות, בעוד שרמות ביטוי מנורמלות ביומן משמשות לניתוח המבוסס על רמות ביטוי גנים, כגון סיווג מסוג תאים41.
  3. בחר גנים של סמן לכל סוג תא, לדוגמה, מולקולת הידבקות של תאי אנדותל טסיות דם -1 (PECAM1) ופקטור פון וילברנד (VWF) עבור ECs, לומיקן (LUM) ופרוקולגן C-Endopeptidase משפר (PCOLCE) עבור פיברובלסטים, גן טרנסלוקציה של תאי B 1 (BTG1) ו - CD52 עבור מקרופאגים, C1QA ו- C1QB עבור מונוציטים, ושרשרת כבדה של מיוזין 11 (MYH11) ו transgelin (TAGLN) עבור תאי שריר חלקים של כלי הדם36.
  4. חישב את רמת הביטוי הממוצעת על פני תאים בודדים בין כל זוג סמנים כדי שיהיה סמן יחיד עם רמת ביטוי ממוצעת המשויכת לכל סוג תא42.
  5. החל מודל תערובת גאוס (GMM) עם שני מרכיבים על נתוני הביטוי של כל סמן על פני תאים בודדים על מנת להפריד תאים לשתי קבוצות, כלומר, ביטוי גבוה של הסמן וביטוי נמוך של הסמן. בדרך זו, עבור כל סמן, כל תא בודד מוקצה לאחד משני הרכיבים42.
  6. השתמש בהעשרה סטטיסטית עבור קבוצת הגנים של הסמן, הבדיקה המדויקת של פישר, כדי להקצות סוג תא לכל אשכול. על ידי כך מתקבלת קבוצה של ערכי p לכל אשכול, שכל אחד מהם מתאים לסוג תא. סוג התא עם ערך ה-p הנמוך ביותר מוקצה לאשכול זה.
  7. לעבד את נתוני התמלול המרחבי באמצעות צינורות Space Ranger וכתוצאה מכך לנטרל את הברקוד המרחבי וליצור מדדי בקרת איכות (QC), כולל סך כל הקריאות המיושרות לתעתיק האנושי hg38, המספר החציוני של מזהה מולקולרי ייחודי (UMI) או גנים לנקודה35.
    הערה: חבילת R Seurat (v3.2.2) משמשת לניתוח הנתונים המעובדים על-ידי Space Ranger בהתאם להנחיותשפורסמו 40.
  8. נרמל נתונים באמצעות "sctransform", שיטה אשר הוכחה כדי לשפר את הניתוח במורד הזרם בהשוואה לנורמליזציה של לוגים בהתחשב בהטרוגניות של הרקמה והשונות הגבוהה מאוד בספירה על פני הכתמים.

תוצאות

הניתוח של ECs מעורק מזנטרי באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית ואנזימטית או שימור בהקפאה לשימוש במבחנים שונים במורד הזרם מתואר כאן (איור 1). ECs ניתן פרופיל בעורקים מזנטריים באמצעות השלבים הבאים: A) דיסוציאציה מכנית מן האינטימה יחד עם עיכול קולגן לתאי תרבית; ב) יצירת תרחיף חד-תאי ...

Discussion

זרימת העבודה המוצגת מפרטת סדרה של טכניקות ליצירת פרופיל של ECs מתוך פיסת עורק אנושי יחידה עם רזולוציה חד-תאית ומרחבית. ישנם מספר שלבים קריטיים וגורמים מגבילים בפרוטוקול. אחד המפתחות ליצירת פרופילי תעתיק הוא רעננות הרקמה ותקינות הרנ"א. חשוב לשמור על רקמות על קרח ככל האפשר לפני העיבוד כדי למז...

Disclosures

ש.ז. הוא מייסד וחבר מועצת המנהלים של Genemo, Inc.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (ל- Z.B.C.); DP1DK126138 ו- DP1HD087990 (ל- S.Z.); מענק של קרן אלה פיצג'רלד ופרויקט משפחת וונק (ל-Z.B.C.); ומענק רשת זרעים של אטלס תאים אנושיים (ל-Z.B.C. ול-S.Z.). המחקר שדווח בפרסום זה כלל עבודה שבוצעה בליבת הגנומיקה האינטגרטיבית בעיר התקווה הנתמכת על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס P30CA033572. המחברים רוצים להודות לד"ר איסמעיל אל-עבדאללה ולד"ר מריגנג צ'י מצוות השתלת האיים ב-City of Hope לבידוד רקמות אנושיות, לד"ר דונגצ'יאנג יואן ב-City of Hope על עזרתו בניתוח scRNA-seq, ולד"ר מארק הלושקה מהמחלקה לפתולוגיה של הלב וכלי הדם, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס על תובנותיו שלא יסולאו בפז על היסטולוגיה של כלי הדם.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL micro-centrifuge tubeUSA Scientific1615-5500
10 cm dishGenesee Scientific25-202
23G needlesBD305145
2-methylbutaneThermo FisherAC327270010
40 µm strainerFisher14100150
4200 TapeStation SystemAgilent TechnologiesG2991BA
5 mL tubeThermo Fisher14282300
6-well plateGreiner Bio-One07-000-208
Attachment factorCell Applications123-500Attachment reagent in the protocol
Black waxAny commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treatedFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugeEppendorf
ChloroformFisherC607
Collagenase DRoche11088866001
CryostatLeica
Cryostat brushes
D-GlucoseFisherD16-1
Dimethyl sulfoxideFisherMT25950CQC
Dispase IIRoche4942078001Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety ScalpelsMyco Instrumentation6008TR-10
D-PBSThermo Fisher14080055
EthanolFisherBP2818-4
Fetal bovine serumFisher10437028
HemocytometerFisher267110
HEPESSigma AldrichH3375-100g
High sensitivity D1000 sample bufferAgilent Technologies5067-5603
High sensitivity D1000 screen tapeAgilent Technologies5067-5584
IncubatorKept at 37 °C 5% CO2
IsopropanolFisherBP26324
KClFisherP217-3
Liquid nitrogen
Medium 199Sigma AldrichM2520-10X
Metal cannister
MicroscopeLeicaTo assess cell morphology
Microvascular endothelial culture mediumCell Applications111-500
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shakerEppendorf
Optimal Cutting Temperature compoundFisher4585
Plastic cryomoldsFisher22363553
RNA screen tapeAgilent Technologies5067-5576
RNA screen Tape sample bufferAgilent Technologies5067-5577
RNase ZAPThermo FisherAM9780
RNase-free waterTakaraRR036BRNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forcepsF.S.T91100-16
Sterile fine forcepsF.S.T11050-10
Sterile fine scissorsF.S.T14061-11
Superfrost PLUS Gold SlidesFisher1518848
TRIzol reagentFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol redThermo Fisher12605010Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit10X GenomicsPN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns10X GenomicsPN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns10X GenomicsPN-1000184

References

  1. Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
  2. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  3. Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , 1-38 (2007).
  4. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
  5. Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
  6. Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  7. Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7 (2014).
  8. Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
  9. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
  10. Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
  11. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  12. Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
  13. Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
  14. Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
  15. The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  16. Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
  17. Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
  18. Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19 (2016).
  19. Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
  20. McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
  21. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489 (2021).
  22. Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
  24. Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
  25. Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
  26. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  27. Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
  28. Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  29. Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
  30. Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
  31. Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
  32. Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  33. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  34. Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  35. Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
  36. Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211 (2020).
  37. Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337 (2011).
  38. Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  39. Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
  40. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  41. Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296 (2019).
  42. Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
  43. Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976 (2018).
  44. Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690 (2020).
  45. Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
  46. van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  47. Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088 (2021).
  48. Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
  49. Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
  50. Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627 (2021).
  51. Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771 (2021).
  52. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  53. Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved