Выделение и профилирование первичных брыжеечных артериальных эндотелиальных клеток человека на уровне транскриптома

Резюме

Протокол описывает выделение, культивирование и профилирование эндотелиальных клеток из брыжеечной артерии человека. Дополнительно предусмотрен метод подготовки артерии человека к пространственной транскриптомике. Протеомика, транскриптомика и функциональные анализы могут быть выполнены на изолированных клетках. Этот протокол может быть перепрофилирован для любой артерии среднего или крупного размера.

Аннотация

Эндотелиальные клетки (ЭК) имеют решающее значение для сосудистой функции и функции всего организма благодаря их динамической реакции на сигналы окружающей среды. Выяснение транскриптома и эпигенома ЭК имеет первостепенное значение для понимания их роли в развитии, здоровье и болезни, но ограничено в доступности изолированных первичных клеток. Новейшие технологии позволили профилировать транскриптом и эпигеном EC с высокой пропускной способностью, что привело к идентификации ранее неизвестных субпопуляций клеток EC и траекторий развития. В то время как культуры ЕС являются полезным инструментом в исследовании функции и дисфункции ЕС, условия культуры и множественные проходы могут вводить внешние переменные, которые изменяют свойства нативного ЕС, включая морфологию, эпигенетическое состояние и программу экспрессии генов. Чтобы преодолеть это ограничение, в настоящей статье демонстрируется метод изоляции первичных ЭК человека от донорских брыжеечных артерий с целью захвата их родного состояния. ЭК в интимальном слое диссоциируют механически и биохимически с использованием определенных ферментов. Полученные клетки могут быть непосредственно использованы для объемного РНК или одноклеточного секвенирования РНК или покрыты для культивирования. Кроме того, описан рабочий процесс подготовки артериальной ткани человека к пространственной транскриптомике, в частности, для коммерчески доступной платформы, хотя этот метод также подходит для других методов пространственного профилирования транскриптома. Эта методология может быть применена к различным сосудам, собранным у различных доноров в состоянии здоровья или болезненных состояниях, чтобы получить представление о транскрипционной и эпигенетической регуляции EC, ключевом аспекте биологии эндотелиальных клеток.

Введение

Выстилая просвет кровеносных сосудов, эндотелиальные клетки (ЭК) являются важнейшими регуляторами сосудистого тонуса и перфузии тканей. ЭК замечательны своей способностью реагировать на внеклеточную среду и приспосабливаться к изменениям динамики и состава кровотока. Эти динамические реакции опосредованы через сеть внутриклеточных сигнальных событий, включая транскрипционные и посттранскрипционные модуляции с пространственно-временным разрешением. Нарушение регуляции этих реакций связано со многими патологиями, включая, но не ограничиваясь сердечно-сосудистыми заболеваниями, диабетом и раком ^1,2.

протокол

Исследования тканей человека были проведены на деидентифицированных образцах, полученных из Ресурсного центра островковых клеток Южной Калифорнии в городе Хоуп. Согласие на исследование на использование посмертных тканей человека было получено от ближайших родственников доноров, а этическое одобрение для этого исследования было предоставлено Институциональным наблюдательным советом города Надежды (IRB No 01046).

1. Физическая диссоциация (расчетное время: 1-2 ч)

1. Поместите свежую артерию на 10-сантиметровую посуду и вымойте стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco (D-PBS).
2. Стерильны....

Результаты

Анализ ЭК из брыжеечной артерии с использованием комбинации механической и ферментативной диссоциации или криоконсервации для использования в различных последующих анализах показан здесь (рисунок 1). ЭК могут быть профилированы в брыжеечных артериях с использованием.......

Обсуждение

Представленный рабочий процесс детализирует набор методов для профилирования EC из одного куска человеческой артерии с одноклеточным и пространственным разрешением. В протоколе есть несколько критических шагов и ограничивающих факторов. Одним из ключей к профилированию транскрипто?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL micro-centrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
23G needles	BD	305145
2-methylbutane	Thermo Fisher	AC327270010
40 µm strainer	Fisher	14100150
4200 TapeStation System	Agilent Technologies	G2991BA
5 mL tube	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
Attachment factor	Cell Applications	123-500	Attachment reagent in the protocol
Black wax			Any commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Chloroform	Fisher	C607
Collagenase D	Roche	11088866001
Cryostat	Leica
Cryostat brushes
D-Glucose	Fisher	D16-1
Dimethyl sulfoxide	Fisher	MT25950CQC
Dispase II	Roche	4942078001	Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
D-PBS	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Hemocytometer	Fisher	267110
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-100g
High sensitivity D1000 sample buffer	Agilent Technologies	5067-5603
High sensitivity D1000 screen tape	Agilent Technologies	5067-5584
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
Isopropanol	Fisher	BP26324
KCl	Fisher	P217-3
Liquid nitrogen
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Metal cannister
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Microvascular endothelial culture medium	Cell Applications	111-500
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
Optimal Cutting Temperature compound	Fisher	4585
Plastic cryomolds	Fisher	22363553
RNA screen tape	Agilent Technologies	5067-5576
RNA screen Tape sample buffer	Agilent Technologies	5067-5577
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B	RNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Superfrost PLUS Gold Slides	Fisher	1518848
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red	Thermo Fisher	12605010	Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns	10X Genomics	PN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns	10X Genomics	PN-1000184