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要約

プロトコルは、ヒト腸間膜動脈からの内皮細胞の単離、培養、およびプロファイリングを記載している。さらに、空間トランスクリプトミクスのためにヒト動脈を調製する方法が提供される。プロテオミクス、トランスクリプトミクス、および機能アッセイは、単離された細胞に対して行うことができる。このプロトコルは、任意の中型または大型の動脈に転用することができる。

要約

内皮細胞(EC)は、環境の手がかりに対する動的な応答を通じて、血管および全身の機能にとって重要です。ECのトランスクリプトームとエピゲノムを解明することは、発達、健康、疾患におけるECの役割を理解する上で最も重要ですが、単離された初代細胞の利用可能性は限られています。最近の技術により、ECトランスクリプトームとエピゲノムのハイスループットプロファイリングが可能になり、これまで知られていなかったEC細胞亜集団や発生軌跡の同定につながっています。EC培養はECの機能および機能不全の探索において有用なツールであるが、培養条件および複数の継代は、形態、エピジェネティック状態、および遺伝子発現プログラムを含む天然ECの特性を変化させる外部変数を導入する可能性がある。この限界を克服するために、本稿は、ヒト原発ECをドナー腸間膜動脈から単離し、その本来の状態を捕捉することを目指して実施する方法を実証する。内膜層のECは、特定の酵素の使用により機械的および生化学的に解離する。得られた細胞は、バルクRNAまたは単一細胞RNAシーケンシングに直接使用することも、培養のために播種することもできます。さらに、空間トランスクリプトーム、特に市販のプラットフォームのためのヒト動脈組織の調製のためのワークフローが記載されているが、この方法は他の空間トランスクリプトームプロファイリング技術にも適している。この方法論は、内皮細胞生物学の極めて重要な側面であるEC転写およびエピジェネティック調節に関する洞察を得るために、健康状態または疾患状態の様々なドナーから収集された異なる血管に適用することができる。

概要

血管の内腔を裏打ちする内皮細胞(EC)は、血管緊張および組織灌流の重要な調節因子である。ECは、細胞外環境に反応し、血流のダイナミクスと組成の変化に適応する能力において顕著です。これらの動的応答は、時空間分解能を有する転写および転写後調節を含む細胞内シグナル伝達事象のネットワークを介して媒介される。これらの応答の調節不全は、心血管疾患、糖尿病、および癌を含むがこれらに限定されない多くの病状に関与している1,2。

研究の大部分は、ECトランスクリプトームを調査するために細胞株または動物モデルを利用しています。前者は、比較的使いやすさと安価さを考えると、便利なツールです。しかし、逐次培養は、線維芽細胞の特徴や分極の欠如などの表現型変化をECに導入し、ECをin vivo状態から切り離す可能性があります3。初代細胞、例えばヒト臍帯静脈EC(HUVEC)は、1980年代から一般的な選択肢であったが、成人には存在しない発達血管床に由来するため、成熟ECを完全に表す可能性は低い。動物、特にマウスモデルは、ECの生理学的または病態生理学的環境をよりよく表し、遺伝的摂動の結果としてトランスクリプトームの尋問を可能にする。マウスECは、酵素ベースの手順4、5、6、7を用いて、大動脈、肺、および脂肪組織を含む様々な組織から単離することができる。しかしながら、単離された細胞は、形質転換6でない限り複数の継代に使用することができず、しばしば数が限られており、複数の動物からのプーリング5、8、9を必要とする。

トランスクリプトームレベルで、特に単一細胞分解能で血管構造を探索する新技術の出現は、ECの新規機能および特性を明らかにすることによって内皮生物学の新時代を可能にした5、10、11、12、13、14。Tabula Murisの研究者によって構築された豊富なリソースは、20の異なるマウス器官にわたるECを含む100,000細胞の単一細胞トランスクリプトームプロファイルを収集し15、共通のECマーカー遺伝子と、組織間および組織内の違いを伴うユニークなトランスクリプトームシグネチャの両方を明らかにした5,13。それにもかかわらず、ゲノム、エピゲノム、およびトランスクリプトームにおいて、特に非コード領域において、マウスとヒトとの間には明確な違いがある16、17、18。これらの前述の欠点は、健康と病気における本来の状態にあるECの忠実なプロファイルを得るために、ヒトサンプルを用いたECの分析の重要性を強調している。

ほとんどのEC単離方法は、タンパク質分解酵素とのインキュベーション前に、均質化、細かく切断、および組織を細かく切断することによる物理的解離に依存しています。酵素および状態はまた、トリプシンからコラゲナーゼまで、組織タイプによってもかなり異なり、単独でまたは組み合わせて使用される19、20、21。さらなる抗体ベースの濃縮または精製は、ECの純度を高めるためにしばしば含まれる。典型的には、EC膜マーカー、例えばCD144およびCD31に対する抗体は、磁気ビーズにコンジュゲートされ、細胞懸濁液22、23に添加される。このような戦略は、一般に、このプロトコールで導入された技術を含む、複数のヒトおよびマウス組織からのEC単離に適合させることができる。

ECは、その本来の状態では、複数の細胞型と相互作用し、細胞の近接性が機能にとって重要である血管ニッチに存在する可能性がある。単一細胞および単一核RNAシーケンシング(scRNAおよびsnRNA-seq)研究は、ECの不均一性を記述する上での最近のブレークスルーにとって最も重要であったが、解離プロセスは組織コンテキストおよび細胞間接触を混乱させ、EC生物学を理解する上でも重要である。2012年に開発され、2020年にメソッド・オブ・ザ・イヤー24と名付けられた空間トランスクリプトームプロファイリングは、脳25、腫瘍26、脂肪組織27を含む様々な組織の空間的特徴を保持しながら、グローバルな遺伝子発現をプロファイリングするために利用されてきた。これらの技術は、アフィニティー試薬または蛍光タグに結合した特定のRNA配列に特異的な特殊なプローブを使用して標的とすることができ、したがって、細胞内分解能28、29、30、31で選択された遺伝子を検出する。それらはまた、非標的化32、33、典型的には空間的にバーコードされたオリゴヌクレオチドを使用してRNAを捕捉し、それらは一緒になってその後の配列ライブラリー調製のためにcDNAに変換され、したがって、偏りのない方法で組織全体の遺伝子発現を推定するという利点を有する。しかしながら、空間分解能は、現在、市販の技術では単一セルラーレベルでは達成されていない。これは、scRNA-seqデータとのデータ統合によってある程度克服することができ、最終的には、元の空間情報を保持しながら、複雑な組織コンテキストにおける単一細胞トランスクリプトームのマッピングを可能にする34。

本明細書では、血管拡張、血管リモデリング、酸化ストレス、および炎症を研究するために使用されている末梢動脈であるヒト上腸間膜動脈を用いてECトランスクリプトームをプロファイルするワークフローが記載されている35、36、37。2つの技術が記載されている:1)単一細胞トランスクリプトームシーケンシングまたはその後のインビトロ培養に適した機械的解離および酵素消化を組み合わせた血管の内膜からECを単離および濃縮する;2)空間トランスクリプトームプロファイリング用の動脈切片を作製した(図1)。これら2つの手法は、ECとその周囲の細胞をプロファイリングするために、独立してまたは相補的に実行することができる。さらに、このワークフローは、任意の中動脈または大動脈での使用に適合させることができる。

プロトコル

ヒト組織研究は、シティ・オブ・ホープの南カリフォルニア島細胞資源センターから得られた非識別標本について実施された。死後のヒト組織の使用に関する研究同意はドナーの近親者から得られ、この研究の倫理的承認はシティ・オブ・ホープの治験審査委員会(IRB No. 01046)によって付与された。

1. 物理的解離(推定時間:1-2時間)

  1. 新鮮な動脈を10cmの皿に置き、滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)で洗浄する。
  2. 滅菌鉗子と解剖ハサミで、血管がきれいになるまで脂肪と外側の結合組織を取り除きます。皿の外側に置かれた定規で容器の長さを測定し、記録のために写真を撮ります(図1A)。
  3. 適切な消化緩衝液を37°Cに予め加温:scRNA-seqには細胞解離酵素を使用する;細胞培養アッセイには、1 ~ 6 mg/mL のコラゲナーゼ D、3 mg/mL の細菌由来プロテアーゼ、100 mM の HEPES、120 mM の NaCl、50 mM の KCl、5 mM のグルコース、1 mM の CaCl2 6,38 (pH 7.0、調整不要) を使用前に 5 分加えます。
  4. 腸間膜動脈(典型的には直径6〜8mm)を取り、はさみで縦に切断して血管内腔を垂直に開く。
  5. 針を使用して、容器を4つの角すべての黒いワックスに取り付け、内膜を露出させたままにします(図1B)。
  6. 予め温めた消化バッファー1mLを腸内膜に加える。滅菌メスを取り、容器の内腔を優しく2回こすります。
    注:この手順の目的は、内膜層を解離させることであり、練習が必要な場合があります。内皮を除去するために十分な力を加える必要があるが、組織のより深い層も除去されるほどではないが、EC表現を減少させる。
  7. 消化バッファーを 5 mL チューブに移します。1 mLの消化バッファーを内膜に加え、ピペットを慎重に上下させて残りの細胞を集め、5 mLチューブに加えます。細胞を37°Cでインキュベートし、150rpmで5分間回転させる。
  8. 2mLのM199培地(またはscRNA-seqで進行する場合はD-PBS)を細胞懸濁液に加え、酵素反応をクエンチする。穏やかに混合し、4°C、600 x g で5分間遠心分離する。
  9. 上清を除去し、上清を別々に保存して対照として培養し、全ての細胞がペレット中に捕捉されているか否かをステップ1.8で観察する。細胞ペレットを1mLのM199培地(またはscRNA-seqで進行する場合はD-PBS)に再懸濁する。
  10. 10 μL のトリパンブルーと 10 μL の細胞ストックを混合して、細胞生存率を評価します。細胞形態を観察し、血球計数器を用いて細胞を計数する。
    注:この時点で、細胞は、タンパク質またはRNA定量に使用したり、標準プロトコル39に従ってEC培養培地を使用してインビトロで培養したりすることができる。あるいは、次のセクションで説明するようにシーケンシング用に準備することもできます。
  11. 培養のために、500μLの付着試薬をウェルにピすることによって、6ウェルプレートの2つのウェルを室温で30分間コーティングする。付着試薬を除去し、滅菌D-PBSで洗浄した後、全細胞ストックを1つのウェルに分注し、コントロールとして上清を第2のウェルに保持した。

2. scRNA-seq試験の準備(推定時間:3-4時間)

  1. ステップ1.11からの細胞ストックを4°C、600 x g で5分間遠心分離する。上清を除去し、D-PBS中の0.04%ウシ血清アルブミン(BSA)の1mL中のP1000ピペットおよびワイドボアチップでペレットを穏やかに再懸濁した。単細胞懸濁液を確実にするためによく混合する。
  2. 溶液を40μmのストレーナーに通し、細胞破片を除去します。破片が残っている場合は、2番目のストレーナーをD-PBS中の4mLの0.04%BSAに通します。
  3. 4°Cで遠心分離機、600 x g で5分間遠心分離する。上清を除去し、ワイドボアピペットチップ付きP1000ピペットを用いて、ペレットをD-PBS中の0.04% BSAの500 μLに再懸濁する。単細胞懸濁液を確実にするためによく混合する。
  4. 10 μL の細胞ストックと 10 μL のトリパンブルーを混合して、細胞生存率を評価します。血球計数器を用いて、形態を観察し、クラスターのない単一細胞懸濁液が存在するかどうかを決定し、組織破片をチェックし、生細胞および死細胞の数を計算する。
  5. 細胞がクラスター化しているか、破片が残っている場合は、D-PBS中の0.04%BSAによる洗浄を繰り返すか、40μmのストレーナーを再度通過させます。
    注:これにより収量が低下しますが、最適なシーケンシングのためには、細胞がクリーンな単一細胞懸濁液に存在することが重要です。
  6. この単一細胞懸濁液は、scRNA-seqに使用することができる。

3. 空間トランスクリプトームプロファイリング(推定時間:3~4時間)

  1. 金属製キャニスターにイソペンタン (2-メチルブタン) を加え、液体窒素 (LN 2) またはドライアイス (LN 2 はドライアイスよりも温度が低くなるため、LN2 が好ましい) で冷やします。最適な切削温度コンパウンド(OCT)をラベルの付いたプラスチッククライオモールドのウェルに注ぎ、気泡が発生しないように注意し、出現するものを取り除きます。ドライアイスにクライオモルドを放置して冷やします。
  2. 血管の長さ1cmの少なくとも2つの冠状部を切断する。長い(12インチ)鉗子を使用して、凍結するまで組織をイソペンタンに沈める。中央に見える内腔の向きでOCTに組織をすばやく沈めます。気泡、特に組織の隣にある泡を取り除くように注意してください。
  3. 長い(12インチ)鉗子を使用して、クライオモールドをつかみ、金属製キャニスターに保持します。金型の基部は液体中にあるべきですが、イソペンタンが組織上を走るのを許すには深すぎてはいけません。凍結を観察すると、OCTは1〜2分で外部から徐々に白くなります。
  4. これらの切片を密閉容器に入れ、-80°Cで最大6ヶ月間保管する。
    注: サンプルをドライアイス上に常時保管し、複数の凍結融解サイクルを許さないでください。この組織は、組織学的解析、RNA/DNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)、または空間トランスクリプトミクス(これから説明する)に使用することができる。
  5. クライオスタット温度をチャンバー用に-20°C、試料ヘッド用に-10°Cに設定します。OCT埋め込み容器セクション、ナイフ、ブラシ、およびクライオスタット中で-20°Cに約30分間スライドさせて平衡化する。平衡化している間、機械とブレードを含むセクションに触れる可能性のあるすべての機器を、70%エタノールとそれに続くRNase除染溶液で洗浄します。
  6. 円形のクライオスタットブロックに少量のOCTを分配し、凍結する前にサンプルを上に置き、サンプルを取り付けます。ブロックを試料ヘッドの中央に置き、左側にある背の高い黒いハンドルを使用してブロックを所定の位置にねじ込みます。船舶を取り囲む余分なOCTをカットします。
  7. クライオスタット上で切断厚さを10μmに設定し、約60個の切片を切断し、予め冷却した1.5mLチューブに入れる。これらのセクションは、RNA品質を評価するために使用されます。クライオスタットから取り出したら、切片が完全に溶解するまで直ちに1mLのRNA抽出試薬およびボルテックスを加える。
  8. 200μLのクロロホルムを加え、溶液がイチゴミルクセーキに似るまで混合する。11,200 x g で4°Cで10分間遠心分離する。
  9. 水相(白とピンクの層の上に透明な相)を集め、それに500μLのイソプロパノールを加える。チューブを10回以上反転させて混合し、-80°Cで少なくとも20分間置きます。
  10. 11,200 x gで4°Cで10分間遠心分離する。 精製したRNAペレットを5μLのRNase非含有水に溶解する。RNA インテグリティ番号 (RIN) を調べます。
    注: RIN ≥ 7 のサンプルが推奨されますが、RIN ≥ 6 は許容されます。RNA溶解のための組織切片の数および溶液の量は、正確なRIN評価を可能にするために、最終RNA濃度がRIN機能範囲内にあることを保証するために使用されるシステムに応じて最適化を必要とし得る。
  11. 市販の組織最適化または遺伝子発現スライドに進む前に、プレーンガラススライドを使用して基準フレーム内に切片を適切に切断および配置する練習をしてください。これは、プレーンスライドガラス上に6.5 mm x 6.5 mmの正方形を描き、クライオスタットで-20°Cに冷却し、このキャプチャ領域に断面を配置することによって達成できます。
  12. アンチロールプレートを所定の位置に収めた状態で10μmの切片を切断し、反転させ、周囲のOCTを通して断面にそっと触れて慎重に平らにします。
  13. RNaseフリーのクライオスタットブラシを使用すると、周囲のOCTのみを使用して、組織セクションを正方形内に配置します。すぐにキャプチャ領域の裏側に1本の指(手袋)を置き、セクションをスライドに溶かします。
  14. セクションが付着したら、スライドをクライオバーの上に置き、セクションがフリーズできるようにします。組織が折り畳まれたり、組織が基準フレームの境界縁に重なったりしないように注意する必要があります。必要に応じて、刃を使用して内腔に沿って組織を半分または四分の一に切断し、血管セクションが6.5 mm x 6.5 mmフレーム内に収まるようにします。
  15. 3.12-3.14に従って組織の10μm切片を組織最適化または遺伝子発現スライドに切断する。ドライアイスの上に置いたスライドメーラーにスライドを移します。スライドを-80°Cで最大4週間保存してから、公開された空間プロトコル33,34に進みます。

4. シーケンシングデータ解析(推定時間:ソフトウェアに精通している場合により最大1週間)

注: 空間トランスクリプトーム解析の場合のみ、手順 4.8 に進んでください。scRNA-seqデータは、ヒトhg38参照トランスクリプトームにアライメントされた標準化されたパイプラインを使用して処理されます。Rパッケージスーラ(v3.2.2)は、公開されたガイドライン40に従ってscRNA-seqデータを分析するために使用されています。

  1. 十分に確立された品質管理メトリックを使用してフィルター:非常に多くの遺伝子(潜在的にマルチプレット)を持つ希少細胞および高いミトコンドリアパーセンテージを有する細胞(低品質または死にかけている細胞はしばしばミトコンドリア汚染を示す)を除去する。
  2. 対数正規化に比べてサンプル積分を改善する方法である「sctransform」を用いてデータを正規化する。これらの正規化されたデータは、次元削減およびクラスタリングに使用され、一方、対数正規化された発現レベルは、細胞型分類41などの遺伝子発現レベルに基づく分析に使用される。
  3. 細胞型ごとにマーカー遺伝子を選択し、例えば、ECについては血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM1)およびフォンビルブラント因子(VWF)、線維芽細胞についてはルミカン(LUM)およびプロコラーゲンC-エンドペプチダーゼエンハンサー(PCOLCE)、マクロファージについてはB細胞転座遺伝子1(BTG1)およびCD52、単球についてはC1QAおよびC1QB、ならびにミオシン重鎖11(MYH11)および トランスゲリン(TAGLN)血管平滑筋細胞36に対する。
  4. 各細胞型42に関連付けられた平均発現レベルを有する単一のマーカーを有するために、各マーカーの各ペア間の単一細胞にわたる平均発現レベルを計算する。
  5. 細胞を2つのセットに分離するために、単一細胞にわたる各マーカーの発現データに2つの成分を有するガウス混合モデル(GMM)を適用し、すなわち、マーカーを高発現し、マーカーを低発現させる。このようにして、各マーカーについて、各単一細胞が2つの構成要素42のうちの1つに割り当てられる。
  6. マーカー遺伝子のセット(フィッシャーの正確検定)の統計的エンリッチメントを使用して、各クラスターに細胞型を割り当てます。こうすることにより、クラスターごとに一連のp値が得られ、それぞれが細胞型に対応する。p 値が最も小さいセル・タイプが、そのクラスターに割り当てられます。
  7. Space Ranger パイプラインを使用して空間トランスクリプトーム データを処理することにより、空間的なバーコード除去と、hg38 ヒト トランスクリプトームへのアライメントされた読み取りの合計、一意の分子識別子 (UMI) またはスポットあたりの遺伝子数の中央値35 を含む品質管理 (QC) メトリックの生成がもたらされます。
    注: R パッケージ Seurat (v3.2.2) は、公開されたガイドライン40 に従って、スペース レンジャーが処理したデータを分析するために使用されます。
  8. 「sctransform」を使用してデータを正規化する方法は、組織の不均一性とスポット全体のカウントの非常に高い分散を考慮して、対数正規化と比較して下流分析を改善することが実証されています。

結果

様々な下流アッセイで使用するための機械的および酵素的解離または凍結保存の組み合わせを用いた腸間膜動脈からのECの分析がここに描かれている(図1)。ECsは、以下のステップを用いて腸間膜動脈においてプロファイリングすることができる:A)培養細胞へのコラゲナーゼ消化と結合した内膜からの機械的解離;B)scRNA-seqに対する単一細胞懸濁液の生成;またはC)動脈の断?...

ディスカッション

提示されたワークフローは、単一の細胞および空間分解能を有する単一のヒト動脈からECをプロファイルするための一連の技術を詳述する。プロトコルにはいくつかの重要なステップと制限要因があります。トランスクリプトームプロファイリングの鍵の1つは、組織の新鮮さとRNAの完全性です。RNAの分解を最小限に抑えるために、処理前にできるだけ氷上の組織を維持することが重要です。?...

開示事項

S.Z.はGenemo, Inc.の創設者兼取締役です。

謝辞

この作業は、NIH助成金R01HL108735、R01HL145170、R01HL106089(Z.B.C.へ)によって支援されました。DP1DK126138およびDP1HD087990(S.Z.へ);エラ・フィッツジェラルド財団の助成金とワネク・ファミリー・プロジェクト(Z.B.C.へ)ヒト細胞アトラス種子ネットワーク助成金(Z.B.C.およびS.Z.に)。この出版物で報告された研究には、米国国立衛生研究所の国立がん研究所が支援するCity of Hopeの統合ゲノミクスコアで行われた研究が含まれ、賞番号P30CA033572で行われました。著者らは、ヒト組織の単離のためのシティ・オブ・ホープの膵島移植チームのイスマイル・アル・アブドラ博士とメイリゲン・チー博士、scRNA-seq解析の支援に対するシティ・オブ・ホープのDongqiang Yuan博士、およびジョンズ・ホプキンス大学医学部心臓血管病理学部門のMarc Halushka博士に、血管組織学に関する彼の貴重な洞察に感謝したい。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL micro-centrifuge tubeUSA Scientific1615-5500
10 cm dishGenesee Scientific25-202
23G needlesBD305145
2-methylbutaneThermo FisherAC327270010
40 µm strainerFisher14100150
4200 TapeStation SystemAgilent TechnologiesG2991BA
5 mL tubeThermo Fisher14282300
6-well plateGreiner Bio-One07-000-208
Attachment factorCell Applications123-500Attachment reagent in the protocol
Black waxAny commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treatedFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugeEppendorf
ChloroformFisherC607
Collagenase DRoche11088866001
CryostatLeica
Cryostat brushes
D-GlucoseFisherD16-1
Dimethyl sulfoxideFisherMT25950CQC
Dispase IIRoche4942078001Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety ScalpelsMyco Instrumentation6008TR-10
D-PBSThermo Fisher14080055
EthanolFisherBP2818-4
Fetal bovine serumFisher10437028
HemocytometerFisher267110
HEPESSigma AldrichH3375-100g
High sensitivity D1000 sample bufferAgilent Technologies5067-5603
High sensitivity D1000 screen tapeAgilent Technologies5067-5584
IncubatorKept at 37 °C 5% CO2
IsopropanolFisherBP26324
KClFisherP217-3
Liquid nitrogen
Medium 199Sigma AldrichM2520-10X
Metal cannister
MicroscopeLeicaTo assess cell morphology
Microvascular endothelial culture mediumCell Applications111-500
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shakerEppendorf
Optimal Cutting Temperature compoundFisher4585
Plastic cryomoldsFisher22363553
RNA screen tapeAgilent Technologies5067-5576
RNA screen Tape sample bufferAgilent Technologies5067-5577
RNase ZAPThermo FisherAM9780
RNase-free waterTakaraRR036BRNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forcepsF.S.T91100-16
Sterile fine forcepsF.S.T11050-10
Sterile fine scissorsF.S.T14061-11
Superfrost PLUS Gold SlidesFisher1518848
TRIzol reagentFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol redThermo Fisher12605010Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit10X GenomicsPN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns10X GenomicsPN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns10X GenomicsPN-1000184

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