转录组水平上人类原发性肠系膜动脉内皮细胞的分离和分析

摘要

该方案描述了从人肠系膜动脉中分离、培养和分析内皮细胞。此外，还提供了一种制备用于空间转录组学的人类动脉的方法。蛋白质组学，转录组学和功能测定可以在分离的细胞上进行。该方案可以重新用于任何中型或大型动脉。

摘要

内皮细胞（EC）通过其对环境线索的动态反应，对血管和全身功能至关重要。阐明EC的转录组和表观基因组对于了解它们在发育，健康和疾病中的作用至关重要，但分离的原代细胞的可用性有限。最近的技术已经实现了EC转录组和表观基因组的高通量分析，从而鉴定了以前未知的EC细胞亚群和发育轨迹。虽然EC培养物是探索EC功能和功能障碍的有用工具，但培养条件和多个传代可以引入改变天然EC性质的外部变量，包括形态学，表观遗传状态和基因表达程序。为了克服这一局限性，本文展示了一种从供体肠系膜动脉中分离出人类原发性EC的方法，旨在捕获其天然状态。内膜层中的ECs通过使用特定的酶在机械和生化上解离。所得细胞可直接用于本体RNA或单细胞RNA测序或接种用于培养。此外，描述了用于制备用于空间转录组学的人类动脉组织的工作流程，特别是用于市售平台，尽管该方法也适用于其他空间转录组分析技术。该方法可以应用于从健康或疾病状态的各种供体收集的不同血管，以深入了解EC转录和表观遗传调节，这是内皮细胞生物学的一个关键方面。

引言

内皮细胞（EC）衬里血管腔内，是血管张力和组织灌注的关键调节因子。EC在对细胞外环境做出反应并适应血流动力学和组成变化的能力方面非常出色。这些动态反应通过细胞内信号传导事件网络介导，包括具有时空分辨率的转录和转录后调制。这些反应的失调与许多病理学有关，包括但不限于心血管疾病，糖尿病和癌症^1，2。

很大一部分研究利用细胞系或动物模型来询问EC转录组。前者是一个有用的工具，因为相对易于使用和便宜。然而，连续培养可以给EC引入表型改变，例如成纤维细胞特征和缺乏极化，使它们与 体内 状态³断开连接。原代细胞，例如人脐静脉EC（HUVEC）自20世纪80年代以来一直是一种流行的选择，但来源于成人中不存在的发育性血管床，因此不太可能完全代表成熟的EC。动物，特别是小鼠模型，更好地代表了EC的生理或病理生理环境，并允许由于遗传扰动而对转录组进行询问。鼠EC可以从各种组织中分离，包括主动脉，肺和脂肪组织，使用基于酶的程序^{4，5，6，7}。然而，分离的细胞不能用于多次传代，除非转化⁶ 并且通常数量有限，这需要从多个动物^5，8，9中汇集。

在转录组学水平上探索血管结构的新技术的出现，特别是单细胞分辨率，通过揭示ECs ^{5，10，11，12}，¹³，¹⁴的新功能和特性^，实现了内皮生物学的新时代。由Tabula Muris研究人员建立的丰富资源收集了100，000个细胞的单细胞转录组谱，包括来自20个不同小鼠器官的EC¹⁵的EC，揭示了具有组织间和组织内差异的独特转录组特征^5，13。然而，小鼠和人类在基因组，表观基因组和转录组之间存在明显差异，特别是在非编码区域^16，17，18中。上述缺点强调了使用人类样本分析EC的重要性，以便获得EC在健康和疾病中的原生状态的忠实特征。

大多数EC分离方法依赖于通过均质化，精细切割和组织切碎的物理解离，然后与蛋白水解酶一起孵育不同时间。酶和条件在组织类型之间也有很大差异，从胰蛋白酶到胶原酶，单独使用或组合使用^19，20，21。通常包括进一步的基于抗体的富集或纯化，以提高EC的纯度。通常，针对EC膜标志物的抗体，例如CD144和CD31与磁珠偶联并加入细胞悬浮液^22，23中。这种策略通常可以适用于从多个人和小鼠组织中分离EC，包括该方案中引入的技术。

在它们的天然状态下，EC与多种细胞类型相互作用，并且可能存在于血管壁龛中，其中细胞接近性对功能至关重要。虽然单细胞和单核RNA测序（scRNA和snRNA-seq）研究对于最近在描述EC异质性方面取得的突破至关重要，但解离过程破坏了组织环境和细胞 - 细胞接触，这对于理解EC生物学也很重要。空间转录组分析于2012年开发，并于2020年被评为年度方法²⁴，已用于分析全球基因表达，同时保留各种组织中的空间特征，包括脑²⁵，肿瘤²⁶和脂肪组织²⁷。这些技术可以靶向，使用特异性于附着在亲和试剂或荧光标签上的特定RNA序列的专用探针，从而以亚细胞分辨率^28，29，^30，31检测选择基因。它们也可以是无靶向的^32，33，通常使用空间条形码的寡核苷酸来捕获RNA，它们一起转化为cDNA用于随后的seq文库制备，因此具有以无偏倚方式推断整个组织基因表达的优点。然而，目前还没有使用市售技术在单一蜂窝水平上实现空间分辨率。这可以通过与scRNA-seq数据的数据集成在一定程度上克服，最终允许在复杂组织环境中绘制单细胞转录组，同时保留其原始空间信息³⁴。

在本文中，描述了使用人肠系膜上动脉（一种用于研究血管舒张，血管重塑，氧化应激和炎症的外周动脉）来分析EC转录组的工作流程^35，36，37。描述了两种技术:1）从血管的内膜中分离和富集EC，结合机械解离和酶消化，适用于单细胞转录组测序或随后 的体外 培养;2）准备用于空间转录组分析的动脉切片（图1）。这两种技术可以独立进行，也可以互补地用于分析EC及其周围细胞。此外，该工作流程可以适应任何中型或大型动脉。

研究方案

人体组织研究是从希望之城的南加州胰岛细胞资源中心获得的去识别标本上进行的。使用死后人体组织的研究同意是从捐赠者的近亲那里获得的，并且这项研究的伦理批准由希望之城的机构审查委员会（IRB No. 01046）授予。

1.物理解离（估计时间:1-2小时）

1. 将新鲜动脉放在10厘米的培养皿上，并用无菌的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）清洗。
2. 用无菌镊子和解剖剪刀，去除脂肪和外部结缔组织，直到血管清洁。用放置在培养皿外部的尺子测量容器的长度，并拍照记录（图1A）。
3. 将适当的消化缓冲液预热至37°C:对于scRNA-seq使用细胞解离酶;对于细胞培养测定，使用1-6mg / mL胶原酶D，3mg / mL细菌衍生蛋白酶，100mM HEPES，120mM NaCl，50 mM KCl，5mM葡萄糖，1mM CaCl₂^6，38 （pH 7.0，不需要调整）在使用前5分钟加入。
4. 取肠系膜动脉（通常直径为6-8 mm），用剪刀纵向切割以垂直打开血管腔。
5. 使用针头将容器连接到所有四个角的黑蜡上，使内膜暴露在外（图1B）。
6. 向内膜中加入1 mL预热消化缓冲液。取一把无菌手术刀，轻轻刮擦血管腔两次。
   注意:此过程的目的是解离内膜层，这可能需要练习。需要施加足够的力来去除内皮，但不要太大，以至于更深层的组织也被去除，这将减少EC的代表。
7. 将消化缓冲液转移到5 mL管中。向内膜中加入1mL消化缓冲液，并小心地上下移液以收集剩余的细胞并加入5mL试管中。将细胞在37°C下孵育，以150rpm旋转5分钟。
8. 向细胞悬浮液中加入2mL M199培养基（如果继续使用scRNA-seq，则为D-PBS）以淬灭酶促反应。轻轻混合并在4°C，600 ×g 离心5分钟。
9. 除去上清液并将上清液单独储存以培养作为对照，以观察在步骤1.8中是否在沉淀中捕获所有细胞。将细胞沉淀重悬于1mL M199培养基中（如果继续使用scRNA-seq，则为D-PBS）。
10. 通过将10μL台盼蓝与10μL细胞原液混合来评估细胞活力。观察细胞形态并使用血细胞计数器计数细胞。
    注意:此时，细胞可用于蛋白质或RNA定量，或按照标准方案³⁹使用EC培养基进行体外培养。或者，可以按照下一节所述准备它们进行测序。
11. 对于培养物，通过在室温下将500μL附着试剂移液到孔中30分钟来涂覆6孔板的两个孔。除去附着试剂并用无菌D-PBS洗涤后，将整个细胞储备分配到一个孔中，并将上清液作为对照保持在第二个孔中。

2. 制备scRNA-seq研究（估计时间:3-4小时）

1. 从步骤1.11到的细胞原液在4°C，600 ×g 下离心5分钟。除去上清液，用P1000移液管和宽孔吸头在1mL的0.04%牛血清白蛋白（BSA）中D-PBS中轻轻重悬沉淀。充分混合以确保单细胞悬浮液。
2. 将溶液通过40μm过滤器以除去细胞碎片。如果碎片仍然存在，通过第二个过滤器进入4 mL的0.04%BSA D-PBS。
3. 在4°C，600 ×g 下离心5分钟。使用带有宽口径移液器吸头的P1000移液器除去上清液并将沉淀重悬于D-PBS中的500μL 0.04%BSA中。充分混合以确保单细胞悬浮液。
4. 通过将10μL细胞原液与10μL台盼蓝混合来评估细胞活力。使用血细胞计数器，观察形态，确定是否存在没有簇的单细胞悬浮液，检查组织碎片，并计算活细胞和死细胞的数量。
5. 如果细胞聚集或碎片残留，在D-PBS中用0.04%BSA重复洗涤或再次通过40μm过滤器。
   注意:虽然这会降低产量，但重要的是细胞存在于干净的单细胞悬浮液中以获得最佳测序。
6. 单细胞悬浮液可用于scRNA-seq。

3. 空间转录组分析（估计时间:3-4小时）

1. 将异戊烷（2-甲基丁烷）加入金属罐中，并在液氮（LN₂）或干冰（优选LN₂ ）中冷却，因为它会使温度低于干冰）。将最佳切割温度化合物（OCT）倒入标记的塑料冷冻室中，注意不要产生气泡并去除出现的气泡。将冷冻肉冻放在干冰上冷却。
2. 切割至少两个冠状部分，血管长度为1厘米。使用长（12"）镊子，将组织浸没在异戊烷中直至冷冻。将组织快速浸没在OCT中，方向为中心可见的管腔。注意去除任何气泡，尤其是组织旁边的气泡。
3. 使用长（12"）镊子，抓住冷冻室，并将其握在金属罐中。虽然模具的底部应该在液体中，但它不应该太深，让异戊烷流过组织。观察冻结，OCT将在1-2分钟内从外部逐渐变白。
4. 将这些部分储存在-80°C的密封容器中长达6个月。
   注意:始终将样品保持在干冰上，不允许超过一个冻融循环。该组织可用于组织学分析，RNA / DNA荧光 原位 杂交（FISH）或空间转录组学，现在将对此进行描述。
5. 将低温恒温器温度设置为-20°C（腔室）和-10°C（试样头）。在低温恒温器中平衡OCT嵌入的容器切片，刀，刷子和滑块至-20°C约30分钟。在平衡的同时，用70%乙醇清洁机器和所有可能接触这些部分的设备，包括刀片，然后用RNase去污溶液。
6. 通过将少量OCT分配到圆形低温恒温器块上并在样品冻结之前将其放在顶部来附着样品。将块放入试样头的中心，并使用左侧的高黑色手柄将块拧到位。切掉容器周围任何多余的OCT。
7. 在低温恒温器上将切割厚度设置为10μm，切割约60段并将其置于预冷的1.5 mL管中。这些部分将用于评估RNA质量。从低温恒温器中取出后，立即加入1 mL RNA提取试剂并涡旋，直到切片完全溶解。
8. 加入200μL氯仿并混合，直到溶液类似于草莓奶昔。在4°C下以11，200 ×g 离心10分钟。
9. 收集水相（白色和粉红色层顶部的透明相）并向其加入500μL异丙醇。通过将管倒置10次混合，并在-80°C下放置至少20分钟。
10. 在4°C下以11，200 × g离心10分钟。 将纯化的RNA沉淀溶解在5μL无RNase水中。检查RNA完整性数（RIN）。
    注意:RIN ≥ 7 的样品是首选，但 RIN ≥ 6 是可以接受的。用于RNA溶解的组织切片数量和溶液体积可能需要优化，具体取决于用于确保最终RNA浓度在RIN功能范围内的系统，以便进行准确的RIN评估。
11. 在进行市售组织优化或基因表达载玻片之前，使用普通载玻片在基准框架内正确切割和放置切片。这可以通过在普通载玻片上绘制6.5 mm x 6.5 mm正方形，在低温恒温器中冷却至-20°C，并在该捕获区域放置部分来实现。
12. 在防滚板就位的情况下切割10μm切片，翻转并通过轻轻触摸周围的OCT部分来小心地压平。
13. 使用不含RNase的低温恒温刷将组织部分放在正方形内，仅使用周围的OCT.立即将一根手指（戴上手套）放在捕获区域的背面，将该部分融化到载玻片上。
14. 一旦切片粘附，将载玻片放在冷冻棒上，以使切片冻结。必须注意避免组织折叠和组织覆盖基准骨架的分界边缘。如有必要，使用刀片沿管腔将组织切成两半或四分之一，以确保血管部分适合6.5 mm x 6.5 mm框架。
15. 按照3.12-3.14在组织优化或基因表达载玻片上切割10μm组织切片。将载玻片转移到放置在干冰上的载玻片邮件机上。在-80°C下储存载玻片长达4周，然后继续使用已发布的空间方案^33，34。

4. 测序数据分析（预计时间:最长1周，视软件是否熟悉情况而定）

注意:仅对于空间转录组学分析，请跳至步骤 4.8。scRNA-seq数据使用与人类hg38参考转录组对齐的标准化管道进行处理。R包Seurat（v3.2.2）用于根据已发布的指南⁴⁰分析scRNA-seq数据。

1. 使用完善的质量控制指标进行过滤:去除具有非常多基因的罕见细胞（可能是多重细胞）和高线粒体百分比的细胞（低质量或垂死细胞通常存在线粒体污染）。
2. 使用"sctransform"对数据进行归一化，与对数归一化相比，这是一种提高样本积分的方法。这些归一化数据用于降维和聚类，而对数归一化表达水平用于基于基因表达水平的分析，例如细胞类型分类⁴¹。
3. 选择每种细胞类型的标记基因，例如， 血小板内皮细胞粘附分子-1 （PECAM1） 和 von Willebrand 因子 （VWF） 用于 ECs， lumican （LUM） 和 前胶原 C-内肽酶增强子 （PCOLCE） 用于成纤维细胞， B 细胞易位基因 1 （BTG1） 和 CD52 用于巨噬细胞， C1QA 和 C1QB 用于单核细胞， 肌球蛋白重链 11 （MYH11） 和用于血管平滑肌细胞的 转格林 （TAGLN）³⁶.
4. 计算每对标记物之间单个细胞的平均表达水平，以便具有与每个细胞类型⁴²关联的平均表达水平的单个标记。
5. 将具有两个组分的高斯混合模型（GMM）应用于单个细胞中每个标记物的表达数据，以便将细胞分成两组，即高度表达标记物和低表达标记物。这样，对于每个标记物，每个单个细胞被分配给两个组分⁴²中的一个。
6. 使用标记基因集（Fisher's exact test）的统计富集，为每个簇分配一种细胞类型。通过这样做，可以为每个聚类获得一组 p 值，每个值对应于一个像元类型。具有最低 p 值的像元类型将分配给该聚类。
7. 使用 Space Ranger 管道处理空间转录组数据，从而实现空间去条形码并生成质量控制 （QC） 指标，包括对 hg38 人类转录组的总对齐读取、唯一分子标识符 （UMI） 的中位数或每个点^{的基因 35}。
   注意:R 包 Seurat （v3.2.2） 用于根据已发布的指南⁴⁰ 分析 Space Ranger 处理的数据。
8. 使用"sctransform"对数据进行归一化，这种方法已被证明可以改善下游分析，与对数归一化相比，考虑到组织的异质性和斑点计数的非常高的方差。

结果

这里描述了使用机械和酶解离或冷冻保存的组合来分析肠系膜动脉的EC，用于各种下游测定（图1）。可以使用以下步骤在肠系膜动脉中分析EC:A）从内膜的机械解离与胶原酶消化到培养细胞相结合;B）产生用于scRNA-seq的单细胞悬浮液;或C）动脉的横截面可以嵌入OCT中进行冷冻切片以分析空间转录组（图1 和 图2）。

讨论

所介绍的工作流程详细介绍了一组技术，以单细胞和空间分辨率从单条人类动脉中分析EC。协议中有几个关键步骤和限制因素。转录组分析的一个关键是组织的新鲜度和RNA的完整性。在加工之前尽可能多地将组织保持在冰上以尽量减少RNA降解非常重要。通常，在死亡后8-14小时之间处理死后组织。然而，建议在从供体中提取后尽快开始分离或冷冻保存。特别是对于空间转录组映射，组织应保持在干?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL micro-centrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
23G needles	BD	305145
2-methylbutane	Thermo Fisher	AC327270010
40 µm strainer	Fisher	14100150
4200 TapeStation System	Agilent Technologies	G2991BA
5 mL tube	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
Attachment factor	Cell Applications	123-500	Attachment reagent in the protocol
Black wax			Any commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Chloroform	Fisher	C607
Collagenase D	Roche	11088866001
Cryostat	Leica
Cryostat brushes
D-Glucose	Fisher	D16-1
Dimethyl sulfoxide	Fisher	MT25950CQC
Dispase II	Roche	4942078001	Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
D-PBS	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Hemocytometer	Fisher	267110
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-100g
High sensitivity D1000 sample buffer	Agilent Technologies	5067-5603
High sensitivity D1000 screen tape	Agilent Technologies	5067-5584
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
Isopropanol	Fisher	BP26324
KCl	Fisher	P217-3
Liquid nitrogen
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Metal cannister
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Microvascular endothelial culture medium	Cell Applications	111-500
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
Optimal Cutting Temperature compound	Fisher	4585
Plastic cryomolds	Fisher	22363553
RNA screen tape	Agilent Technologies	5067-5576
RNA screen Tape sample buffer	Agilent Technologies	5067-5577
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B	RNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Superfrost PLUS Gold Slides	Fisher	1518848
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red	Thermo Fisher	12605010	Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns	10X Genomics	PN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns	10X Genomics	PN-1000184