Isolement et profilage des cellules endothéliales artérielles mésentériques primaires humaines au niveau du transcriptome

Résumé

Le protocole décrit l’isolement, la culture et le profilage des cellules endothéliales de l’artère mésentérique humaine. En outre, une méthode est fournie pour préparer l’artère humaine à la transcriptomique spatiale. La protéomique, la transcriptomique et les tests fonctionnels peuvent être effectués sur des cellules isolées. Ce protocole peut être réutilisé pour n’importe quelle artère de taille moyenne ou grande.

Résumé

Les cellules endothéliales (CE) sont cruciales pour le fonctionnement vasculaire et du corps entier grâce à leur réponse dynamique aux signaux environnementaux. L’élucidation du transcriptome et de l’épigénome des CE est primordiale pour comprendre leur rôle dans le développement, la santé et la maladie, mais est limitée dans la disponibilité de cellules primaires isolées. Les technologies récentes ont permis le profilage à haut débit du transcriptome et de l’épigénome EC, conduisant à l’identification de sous-populations de cellules EC et de trajectoires de développement auparavant inconnues. Alors que les cultures EC sont un outil utile dans l’exploration de la fonction et du dysfonctionnement EC, les conditions de culture et les multiples passages peuvent introduire des variables externes qui modifient les propriétés de l’EC native, y compris la morphologie, l’état épigénétique et le programme d’expression des gènes. Pour surmonter cette limitation, le présent article démontre une méthode d’isolement des CE primaires humains des artères mésentériques des donneurs visant à capturer leur état natif. Les CE dans la couche intimale sont dissociés mécaniquement et biochimiquement avec l’utilisation d’enzymes particulières. Les cellules résultantes peuvent être directement utilisées pour le séquençage de l’ARN en vrac ou de l’ARN unicellulaire ou plaquées pour la culture. En outre, un flux de travail est décrit pour la préparation de tissu artériel humain pour la transcriptomique spatiale, en particulier pour une plate-forme disponible dans le commerce, bien que cette méthode convienne également à d’autres techniques de profilage du transcriptome spatial. Cette méthodologie peut être appliquée à différents vaisseaux collectés auprès d’une variété de donneurs dans des états de santé ou de maladie pour mieux comprendre la régulation transcriptionnelle et épigénétique de la CE, un aspect central de la biologie des cellules endothéliales.

Introduction

Tapissant la lumière des vaisseaux sanguins, les cellules endothéliales (CE) sont des régulateurs cruciaux du tonus vasculaire et de la perfusion tissulaire. Les CE sont remarquables dans leur capacité à réagir à l’environnement extracellulaire et à s’adapter aux changements dans la dynamique et la composition du flux sanguin. Ces réponses dynamiques sont médiées par un réseau d’événements de signalisation intracellulaire, y compris des modulations transcriptionnelles et post-transcriptionnelles avec une résolution spatio-temporelle. Le dérèglement de ces réponses est impliqué dans de nombreuses pathologies, y compris, mais sans s’y limiter, les maladies cardiovasculaires, le diabète et le cancer ^1,2.

Une grande partie des études utilisent des lignées cellulaires ou des modèles animaux pour interroger le transcriptome EC. Le premier est un outil utile, compte tenu de la relative facilité d’utilisation et du faible coût. Cependant, la culture en série peut introduire des altérations phénotypiques des CE, telles que des caractéristiques fibroblastiques et un manque de polarisation, les déconnectant de leur état in vivo ³. Les cellules primaires, par exemple la veine ombilicale humaine EC (HUVEC) ont été un choix populaire depuis les années 1980, mais sont dérivées d’un lit vasculaire développemental qui n’existe pas chez les adultes, donc peu susceptible de représenter pleinement les CE matures. Les animaux, en particulier les modèles murins, représentent mieux l’environnement physiologique ou physiopathologique des CE et permettent l’interrogation des transcriptomes à la suite d’une perturbation génétique. Les CE murins peuvent être isolés de divers tissus, y compris l’aorte, les poumons et les tissus adipeux à l’aide de procédures à base d’enzymes ^4,5,6,7. Cependant, les cellules isolées ne peuvent pas être utilisées pour plusieurs passages à moins d’être transformées⁶ et sont souvent limitées en nombre, ce qui nécessite une mise en commun de plusieurs animaux ^5,8,9.

L’avènement de nouvelles technologies explorant l’architecture des vaisseaux au niveau transcriptomique, en particulier avec la résolution unicellulaire, a permis une nouvelle ère de la biologie endothéliale en révélant de nouvelles fonctions et propriétés des CE 5,10,11,12,13,14. Une riche ressource construite par les chercheurs de Tabula Muris a recueilli des profils transcriptomiques unicellulaires de 100 000 cellules, y compris des CE, dans 20 organes murins différents¹⁵, qui ont révélé à la fois des gènes marqueurs EC communs et des signatures transcriptomiques uniques avec des différences inter-tissus et intra-tissulaires ^5,13. Néanmoins, il existe des différences claires entre la souris et l’homme dans le génome, l’épigénome et le transcriptome, en particulier dans les régions non codantes 16,17,18. Ces inconvénients susmentionnés soulignent l’importance de l’analyse des CE à l’aide d’échantillons humains afin d’obtenir un profil fidèle des CE dans leur état d’origine en matière de santé et de maladie.

La plupart des méthodes d’isolement EC reposent sur la dissociation physique par homogénéisation, coupe fine et hachage du tissu avant l’incubation avec des enzymes protéolytiques pendant des périodes différentes. Les enzymes et les conditions varient également considérablement d’un type de tissu à l’autre, de la trypsine à la collagénase, utilisée seule ou en combinaison 19,20,21. D’autres enrichissements ou purifications à base d’anticorps sont souvent inclus pour augmenter la pureté des CE. En règle générale, les anticorps dirigés contre les marqueurs membranaires EC, par exemple CD144 et CD31, sont conjugués à des billes magnétiques et ajoutés à la suspension cellulaire^22,23. Une telle stratégie peut généralement être adaptée pour l’isolement EC de plusieurs tissus humains et murins, y compris les techniques introduites dans ce protocole.

Dans leur état natif, les CE interagissent avec plusieurs types de cellules et peuvent exister dans des niches vasculaires où la proximité cellulaire est cruciale pour la fonction. Bien que les études sur le séquençage de l’ARN unicellulaire et mononucléaire (scRNA et snRNA-seq) aient été primordiales pour les récentes percées dans la description de l’hétérogénéité EC, le processus de dissociation perturbe le contexte tissulaire et le contact cellule-cellule, qui sont également importants pour comprendre la biologie EC. Développé en 2012 et nommé Méthode de l’année en 2020²⁴, le profilage du transcriptome spatial a été utilisé pour profiler l’expression globale des gènes tout en conservant les caractéristiques spatiales dans divers tissus, notamment le cerveau²⁵, la tumeur²⁶ et le tissu adipeux²⁷. Les technologies peuvent être ciblées, en utilisant des sondes spécialisées spécifiques pour des séquences d’ARN particulières attachées à des réactifs d’affinité ou à des étiquettes fluorescentes, détectant ainsi des gènes sélectionnés à une résolution subcellulaire ^28,29,30,31. Ils peuvent également être non ciblés^32,33, utilisant généralement des oligonucléotides à code-barres spatiaux pour capturer l’ARN, qui sont convertis en ADNc pour la préparation ultérieure de la bibliothèque seq et ont donc l’avantage de déduire l’expression des gènes des tissus entiers de manière impartiale. Cependant, la résolution spatiale n’est actuellement pas atteinte à un seul niveau cellulaire avec les technologies disponibles dans le commerce. Cela peut être surmonté dans une certaine mesure avec l’intégration des données avec les données scRNA-seq, permettant finalement la cartographie du transcriptome unicellulaire dans un contexte tissulaire complexe tout en conservant ses informations spatiales d’origine³⁴.

Ici, un flux de travail est décrit pour profiler le transcriptome EC en utilisant l’artère mésentérique supérieure humaine, une artère périphérique qui a été utilisée pour étudier la vasodilatation, le remodelage vasculaire, le stress oxydatif et l’inflammation 35,36,37. Deux techniques sont décrites: 1) isoler et enrichir les CE à partir de l’intima des vaisseaux sanguins combinant dissociation mécanique et digestion enzymatique adaptée au séquençage du transcriptome unicellulaire ou à la culture in vitro ultérieure; 2) préparer des sections artérielles pour le profilage du transcriptome spatial (Figure 1). Ces deux techniques peuvent être réalisées indépendamment ou de manière complémentaire pour profiler les CE et leurs cellules environnantes. De plus, ce flux de travail peut être adapté pour une utilisation sur n’importe quelle artère moyenne ou grande.

Protocole

Des études sur les tissus humains ont été menées sur des spécimens désidentifiés obtenus au Southern California Islet Cell Resource Center à City of Hope. Les autorisations de recherche pour l’utilisation de tissus humains post-mortem ont été obtenues auprès des plus proches parents des donneurs, et l’approbation éthique de cette étude a été accordée par le Conseil d’examen institutionnel de City of Hope (CISR no 01046).

1. Dissociation physique (temps estimé: 1-2 h)

1. Placez une artère fraîche sur un plat de 10 cm et lavez-la avec la solution saline tamponnée au phosphate (D-PBS) stérile de Dulbecco.
2. Avec une pince stérile et des ciseaux à dissection, retirez la graisse et les tissus conjonctifs externes jusqu’à ce que le vaisseau soit propre. Mesurez la longueur du récipient avec une règle placée à l’extérieur du plat et prenez des photos pour les enregistrer (Figure 1A).
3. Tampon de digestion approprié préchauffé à 37 °C: pour scRNA-seq utiliser l’enzyme de dissociation cellulaire; pour les essais de culture cellulaire, utiliser 1-6 mg/mL de collagénase D, 3 mg/mL de protéase dérivée de bactéries, 100 mM de HEPES, 120 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 5 mM de glucose, avec 1 mM de CaCl₂ ^6,38 (pH 7,0, ne nécessite pas d’ajustement) ajouté 5 min avant utilisation.
4. Prenez l’artère mésentérique (généralement d’un diamètre de 6 à 8 mm) et coupez-la dans le sens de la longueur avec des ciseaux pour ouvrir la lumière du vaisseau verticalement.
5. À l’aide d’aiguilles, fixez le récipient sur de la cire noire aux quatre coins, en laissant l’intima exposée (figure 1B).
6. Ajouter 1 mL de tampon de digestion préchauffé à intima. Prenez un scalpel stérile et grattez doucement la lumière du vaisseau deux fois.
   REMARQUE: Le but de cette procédure est de dissocier la couche intimale, ce qui peut nécessiter de la pratique. Une force suffisante doit être exercée pour éliminer l’endothélium, mais pas au point que les couches plus profondes de tissu soient également enlevées, ce qui réduira la représentation de la CE.
7. Transférer le tampon de digestion dans un tube de 5 mL. Ajouter 1 mL de tampon de digestion à l’intima et pipeter soigneusement de haut en bas pour recueillir les cellules restantes et ajouter au tube de 5 mL. Incuber les cellules à 37 °C, en tournant à 150 tr/min pendant 5 min.
8. Ajouter 2 mL de milieu M199 (ou D-PBS si vous procédez avec scRNA-seq) à la suspension cellulaire pour éteindre la réaction enzymatique. Mélanger doucement et centrifuger à 4 °C, 600 x g pendant 5 min.
9. Retirez le surnageant et stockez-le séparément pour le mettre en culture afin de contrôler si toutes les cellules sont capturées dans la pastille à l’étape 1.8. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de milieu M199 (ou D-PBS si vous procédez avec scRNA-seq).
10. Évaluer la viabilité cellulaire en mélangeant 10 μL de bleu de trypan avec 10 μL de stock cellulaire. Observez la morphologie cellulaire et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    REMARQUE: À ce stade, les cellules peuvent être utilisées pour la quantification des protéines ou de l’ARN ou cultivées in vitro à l’aide de milieux de culture EC selon les protocoles standard³⁹. Alternativement, ils peuvent être préparés pour le séquençage comme décrit dans la section suivante.
11. Pour la culture, recouvrir deux puits d’une plaque de 6 puits en pipetant 500 μL de réactif de fixation dans des puits pendant 30 min à température ambiante. Après avoir retiré le réactif d’attachement et lavé avec du D-PBS stérile, distribuer le stock cellulaire complet dans un puits et le surnageant conservé comme témoin dans le deuxième puits.

2. Préparation aux études scRNA-seq (durée estimée : 3-4 h)

1. Centrifuger le stock de cellules à partir de l’étape 1.11 à 4 °C, 600 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension doucement avec une pipette P1000 et une pointe à large alésage dans 1 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 0,04 % dans le D-PBS. Bien mélanger pour assurer une suspension à cellule unique.
2. Faire passer la solution à travers une passoire de 40 μm pour éliminer les débris cellulaires. S’il reste des débris, passer à travers une deuxième passoire dans 4 mL de 0,04% BSA dans D-PBS.
3. Centrifuger à 4 °C, 600 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 500 μL de 0,04 % de BSA dans le D-PBS à l’aide d’une pipette P1000 avec une pointe de pipette à large alésage. Bien mélanger pour assurer une suspension à cellule unique.
4. Évaluer la viabilité cellulaire en mélangeant 10 μL de stock cellulaire avec 10 μL de bleu de trypan. À l’aide d’un hémocytomètre, observez la morphologie, déterminez s’il existe une suspension unicellulaire sans grappes, vérifiez la présence de débris tissulaires et calculez le nombre de cellules vivantes et mortes.
5. Si les cellules sont regroupées ou s’il reste des débris, répétez le lavage avec 0,04 % de BSA dans du D-PBS ou passez à nouveau à travers une passoire de 40 μm.
   REMARQUE: Bien que cela réduise le rendement, il est important que les cellules existent dans une suspension monocellulaire propre pour un séquençage optimal.
6. La suspension monocellulaire peut être utilisée pour scRNA-seq.

3. Profilage du transcriptome spatial (temps estimé: 3-4 h)

1. Ajouter l’isopentane (2-méthylbutane) à une cartouche métallique et refroidir dans de l’azote liquide (LN₂) ou de la glace carbonique (LN₂ est préférable car il abaissera la température à celle de la glace carbonique). Versez le composé à température de coupe optimale (OCT) dans les puits de cryomoulages en plastique étiquetés en prenant soin de ne pas créer de bulles et d’enlever celles qui apparaissent. Laisser le cryomoulage sur de la glace carbonique pour refroidir.
2. Couper au moins deux sections coronales, de 1 cm de longueur du récipient. À l’aide de pinces longues (12 pouces), immergez le tissu dans l’isopentane jusqu’à ce qu’il soit congelé. Immergez rapidement le tissu dans l’OCT à l’orientation avec la lumière visible au centre. Prenez soin d’enlever les bulles, en particulier celles à côté du tissu.
3. À l’aide de longues pinces (12 pouces), saisissez les cryomoules et maintenez-les dans la boîte métallique. Bien que la base des moules doive être dans le liquide, elle ne doit pas être trop profonde pour permettre à l’isopentane de s’écouler sur le tissu. Observez le gel, l’OCT deviendra blanc progressivement de l’extérieur en 1-2 min.
4. Conservez ces sections dans un récipient scellé à -80 °C pendant 6 mois.
   REMARQUE : Conservez les échantillons sur de la glace carbonique en tout temps et ne permettez pas plus d’un cycle de gel-dégel. Ce tissu peut être utilisé pour l’analyse histologique, l’hybridation in situ par fluorescence ARN/ADN (FISH), ou la transcriptomique spatiale, qui sera décrite maintenant.
5. Réglez la température du cryostat à -20 °C pour la chambre et à -10 °C pour la tête de l’échantillon. Équilibrez les sections de récipients, les couteaux, les brosses et les glissières encastrés octo jusqu’à -20 °C dans le cryostat pendant environ 30 minutes. Lors de l’équilibrage, nettoyez la machine et tous les équipements susceptibles de toucher les sections, y compris la lame, avec de l’éthanol à 70% suivi d’une solution de décontamination par RNase.
6. Fixez l’échantillon en distribuant une petite quantité d’OCT sur le bloc de cryostat circulaire et en plaçant l’échantillon sur le dessus avant qu’il ne gèle. Placez le bloc au centre de la tête de l’échantillon et vissez le bloc en place à l’aide d’une grande poignée noire sur la gauche. Éliminez tout excès d’OCT entourant le navire.
7. Réglez l’épaisseur de coupe à 10 μm sur le cryostat, coupez environ 60 sections et placez-les dans un tube pré-refroidi de 1,5 mL. Ces sections seront utilisées pour évaluer la qualité de l’ARN. Lors du retrait du cryostat, ajouter immédiatement 1 mL de réactif d’extraction d’ARN et de vortex jusqu’à ce que les sections soient complètement dissoutes.
8. Ajouter 200 μL de chloroforme et mélanger jusqu’à ce que la solution ressemble à un milkshake à la fraise. Centrifuger à 11 200 x g pendant 10 min à 4 °C.
9. Recueillir la phase aqueuse (phase claire sur les couches blanches et roses) et y ajouter 500 μL d’isopropanol. Mélanger en inversant les tubes plus de 10 fois et placer à -80 °C pendant au moins 20 min.
10. Centrifuger à 11 200 x g pendant 10 min à 4 °C. Dissoudre la pastille d’ARN purifiée dans 5 μL d’eau sans RNase. Examinez le numéro d’intégrité de l’ARN (RIN).
    REMARQUE: Les échantillons avec RIN ≥ 7 sont préférables, mais RIN ≥ 6 est acceptable. Le nombre de coupes tissulaires et le volume de solution pour la dissolution de l’ARN peuvent nécessiter une optimisation en fonction du système utilisé pour s’assurer que la concentration finale d’ARN se situe dans la plage de fonction RIN afin de permettre une évaluation précise de l’ARN.
11. Entraînez-vous à couper et à placer correctement les sections dans les cadres fiducial à l’aide de lames en verre ordinaire avant de procéder à l’optimisation des tissus ou aux lames d’expression génique disponibles dans le commerce. Cela peut être réalisé en dessinant des carrés de 6,5 mm x 6,5 mm sur une lame de verre ordinaire, en refroidissant à -20 ° C dans le cryostat et en plaçant des sections dans cette zone de capture.
12. Coupez des sections de 10 μm avec une plaque anti-roulis en place, retournez et aplatissez soigneusement en touchant doucement la section à travers l’OCT environnant.
13. À l’aide de brosses cryostat sans RNase, placez la section tissulaire dans le carré, en utilisant uniquement l’OCT environnant. Placez immédiatement un doigt (dans des gants) à l’arrière de la zone de capture pour faire fondre la section sur la lame.
14. Une fois que la section a adhéré, placez la glissière sur la cryobare pour permettre à la section de geler. Il faut veiller à éviter le pliage des tissus et le recouvrement des tissus sur les bords délimités du cadre fiducial. Si nécessaire, coupez le tissu en moitiés ou en quartiers le long de la lumière à l’aide d’une lame pour vous assurer que la section du vaisseau s’insère dans le cadre de 6,5 mm x 6,5 mm.
15. Couper des sections de tissu de 10 μm conformément aux points 3.12-3.14 sur des lames d’optimisation tissulaire ou d’expression génique. Transférez la diapositive dans un publipostage placé sur de la glace carbonique. Conservez les diapositives à -80 °C jusqu’à 4 semaines avant de procéder aux protocoles spatiaux publiés^33,34.

4. Analyse des données de séquençage (durée estimée: jusqu’à 1 semaine selon la familiarité avec le logiciel)

REMARQUE : Pour l’analyse transcriptomique spatiale uniquement, passez à l’étape 4.8. Les données scRNA-seq sont traitées à l’aide du pipeline standardisé aligné sur le transcriptome de référence hg38 humain. Le paquet R Seurat (v3.2.2) est utilisé pour analyser les données scRNA-seq conformément aux directives^{publiées 40}.

1. Filtrer à l’aide de mesures de contrôle de la qualité bien établies: les cellules rares avec un nombre très élevé de gènes (potentiellement multiplets) et les cellules avec des pourcentages mitochondriaux élevés (les cellules de mauvaise qualité ou mourantes présentent souvent une contamination mitochondriale) sont éliminées.
2. Normalisez les données à l’aide de « sctransform », une méthode permettant d’améliorer l’intégration des échantillons par rapport à la normalisation des journaux. Ces données normalisées sont utilisées pour la réduction de la dimensionnalité et le regroupement, tandis que les niveaux d’expression normalisés par logarithme sont utilisés pour l’analyse basée sur les niveaux d’expression des gènes, tels que la classification de type cellulaire⁴¹.
3. Sélectionner des gènes marqueurs par type de cellule, par exemple, la molécule d’adhésion des cellules endothéliales plaquettaires-1 (PECAM1) et le facteur de von Willebrand (VWF) pour les EC, le lumican (LUM) et le procollagène C-Endopeptidase Enhancer (PCOLCE) pour les fibroblastes, le gène de translocation des cellules B 1 (BTG1) et CD52 pour les macrophages, C1QA et C1QB pour les monocytes et la chaîne lourde de myosine 11 (MYH11) et transgéline (TAGLN) pour les cellules musculaires lisses vasculaires³⁶.
4. Calculez le niveau d’expression moyen sur des cellules individuelles entre chaque paire de marqueurs afin d’avoir un seul marqueur avec un niveau d’expression moyen associé à chaque type de cellule⁴².
5. Appliquez un modèle de mélange gaussien (GMM) avec deux composants aux données d’expression de chaque marqueur à travers des cellules individuelles afin de séparer les cellules en deux ensembles, à savoir, exprimer fortement le marqueur et exprimer faiblement le marqueur. De cette façon, pour chaque marqueur, chaque cellule est affectée à l’un des deux composants⁴².
6. Utilisez l’enrichissement statistique pour l’ensemble des gènes marqueurs, un test exact de Fisher, pour attribuer un type de cellule à chaque groupe. Ce faisant, un ensemble de valeurs p est obtenu par cluster, chacun correspondant à un type de cellule. Le type de cellule avec la valeur de p la plus faible est affecté à ce cluster.
7. Traiter les données transcriptomiques spatiales à l’aide des pipelines Space Ranger, ce qui entraîne un décodage géographique et la génération de mesures de contrôle de la qualité (QC), y compris les lectures totales alignées sur le transcriptome humain hg38, le nombre médian d’identificateurs moléculaires uniques (UMI) ou de gènes par point³⁵.
   REMARQUE: Le paquet R Seurat (v3.2.2) est utilisé pour analyser les données traitées par Space Ranger conformément aux directives^{publiées 40}.
8. Normaliser les données à l’aide de la « sctransforme », une méthode dont il a été démontré qu’elle améliore l’analyse en aval par rapport à la normalisation logarithmique compte tenu de l’hétérogénéité du tissu et de la variance très élevée des comptes entre les taches.

Résultats

L’analyse des CE de l’artère mésentérique à l’aide d’une combinaison de dissociation mécanique et enzymatique ou de cryoconservation pour une utilisation dans divers essais en aval est représentée ici (figure 1). Les CE peuvent être profilés dans les artères mésentériques en utilisant les étapes suivantes: A) dissociation mécanique de l’intima couplée à la digestion de la collagénase aux cellules de culture; B) génération d’une suspension unicellulaire pour scR...

Discussion

Le flux de travail présenté détaille un ensemble de techniques pour profiler les CE à partir d’un seul morceau d’artère humaine avec une résolution unicellulaire et spatiale. Il y a plusieurs étapes critiques et facteurs limitatifs dans le protocole. L’une des clés du profilage du transcriptome est la fraîcheur du tissu et l’intégrité de l’ARN. Il est important de maintenir les tissus sur la glace autant que possible avant le traitement afin de minimiser la dégradation de l’ARN. En règle généra...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL micro-centrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
23G needles	BD	305145
2-methylbutane	Thermo Fisher	AC327270010
40 µm strainer	Fisher	14100150
4200 TapeStation System	Agilent Technologies	G2991BA
5 mL tube	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
Attachment factor	Cell Applications	123-500	Attachment reagent in the protocol
Black wax			Any commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Chloroform	Fisher	C607
Collagenase D	Roche	11088866001
Cryostat	Leica
Cryostat brushes
D-Glucose	Fisher	D16-1
Dimethyl sulfoxide	Fisher	MT25950CQC
Dispase II	Roche	4942078001	Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
D-PBS	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Hemocytometer	Fisher	267110
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-100g
High sensitivity D1000 sample buffer	Agilent Technologies	5067-5603
High sensitivity D1000 screen tape	Agilent Technologies	5067-5584
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
Isopropanol	Fisher	BP26324
KCl	Fisher	P217-3
Liquid nitrogen
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Metal cannister
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Microvascular endothelial culture medium	Cell Applications	111-500
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
Optimal Cutting Temperature compound	Fisher	4585
Plastic cryomolds	Fisher	22363553
RNA screen tape	Agilent Technologies	5067-5576
RNA screen Tape sample buffer	Agilent Technologies	5067-5577
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B	RNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Superfrost PLUS Gold Slides	Fisher	1518848
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red	Thermo Fisher	12605010	Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns	10X Genomics	PN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns	10X Genomics	PN-1000184