مراقبة الضغط داخل الجمجمة في نموذج القوارض النزفية داخل البطينات غير الرضحية

Summary

مراقبة الضغط داخل الجمجمة في نماذج القوارض من النزف داخل البطيني غير الرضحي ليست شائعة في الأدبيات الحالية. هنا ، نوضح تقنية لقياس الضغط داخل الجمجمة ، ومتوسط الضغط الشرياني ، وضغط التروية الدماغية أثناء النزف داخل البطيني في نموذج الفئران.

Abstract

غالبا ما يترك الناجون من النزف داخل البطيني مع ضعف كبير في الذاكرة على المدى الطويل. وبالتالي ، فإن البحث باستخدام نماذج حيوانية للنزيف داخل البطيني أمر ضروري. في هذه الدراسة ، بحثنا عن طرق لقياس الضغط داخل الجمجمة ، ومتوسط الضغط الشرياني ، وضغط التروية الدماغية أثناء النزف داخل البطيني غير الرضحي في الفئران. تضمن التصميم التجريبي ثلاث مجموعات Sprague Dawley: الوهمية ، والنزف القياسي داخل البطيني 200 ميكرولتر ، ومجموعات التحكم في المركبات. من خلال إدخال مستشعر ضغط الألياف البصرية داخل متني ، تم الحصول على قياسات دقيقة للضغط داخل الجمجمة في جميع المجموعات. تم حساب ضغوط التروية الدماغية بمعرفة الضغط داخل الجمجمة ومتوسط قيم الضغط الشرياني. كما هو متوقع ، شهدت كل من مجموعات النزف داخل البطيني والتحكم في المركبات ارتفاعا في الضغط داخل الجمجمة وانخفاضا لاحقا في ضغط التروية الدماغية أثناء الحقن داخل البطيني للدم الذاتي والسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي ، على التوالي. تعد إضافة مستشعر ضغط الألياف الضوئية داخل المتني مفيدة في مراقبة التغيرات الدقيقة في الضغط داخل الجمجمة.

Introduction

النزف داخل البطيني (IVH) ، وهو نوع من النزف داخل الجمجمة (ICH) ، هو مرض مدمر يحمل وفيات ومراضة كبيرة. يتميز IVH بأنه تراكم منتجات الدم داخل البطينين داخل الجمجمة. IVH معزول في غير شائع ويحدث عادة في البالغين¹. قد يترافق مع نزيف ارتفاع ضغط الدم أو تمدد الأوعية الدموية داخل الجمجمة أو تشوه آخر في الأوعية الدموية أو أورام أو صدمة¹. IVH يؤدي إلى إصابة دماغية ثانوية وكذلك تطور استسقاء الرأس². غالبا ما يترك الناجون من IVH مع إعاقات وظيفية وذاكرة وإدراكية كبيرة بعد إصابتهم. تم الإبلاغ عن هذا العجز المعرفي والذاكرة على المدى الطويل بنسبة تصل إلى 44٪ من الناجين من ICH³. في النزف تحت العنكبوتية (SAH) ، وهو نوع آخر من التراث الثقافي غير المادي ، من المعروف أن ما يقرب من نصف الناجين سيعانون من عجز في الذاكرة ، وبالنسبة لأولئك الذين لديهم IVH بالإضافة إلى SAH ، تميل النتائج إلى أن تكون أسوأ بكثير⁴،^5،6.

لا يزال يتعين توضيح الآليات الأساسية لضعف الذاكرة بعد IVH. يعد البحث في الجسم الحي باستخدام نماذج حيوانية IVH غير مؤلمة مع خلل وظيفي وذاكرة أمرا ضروريا لاكتشاف الأهداف العلاجية المحتملة لمثل هؤلاء المرضى. النماذج الحيوانية ذات الذاكرة الأكثر حدة والخلل الوظيفي بعد IVH ستكون الأفضل لدراسة هذه التغييرات. كما قام مختبر المؤلف الرئيسي بالتحقيق على وجه التحديد في دور الضغط العالي داخل الجمجمة (ICP) في تطوير عجز الذاكرة في نماذج الفئران IVH. ومن ثم ، كانت طرق قياس ICPs بدقة خلال IVH مهمة للتحقيق. هنا ، نقدم تقريرا عن طرق قياس ICPs بدقة في نموذج الفئران IVH. على الرغم من أن رصد برنامج المقارنات الدولية قد استخدم سابقا في ICH الرضحي وكذلك النماذج الحيوانية النزفية تحت العنكبوتية ، إلا أن مراقبة برنامج المقارنات الدولية في نماذج القوارض IVH العفوية لم يتم الإبلاغ عنها بشكل شائع في الأدبيات ^7,8. ومن ثم ، تضمن التصميم التجريبي المقدم هنا ثلاث مجموعات من فئران Sprague Dawley: الوهمية ، والنزف القياسي داخل البطيني 200 ميكرولتر ، والتحكم في السيارة. بالنسبة لمجموعة IVH ، تم استخدام نموذج حقن الدم داخل البطينات الذاتية. بالنسبة لحيوانات التحكم في المركبات ، تم استخدام الحقن داخل البطيني لمحلول Lactated Ringer المعقم. تم تسجيل ICPs ومتوسط الضغوط الشريانية (MAPs) وضغوط التروية الدماغية (CPPs) أثناء الجراحة ، وتم الإبلاغ عن النتائج هنا.

Protocol

تم إجراء جميع طرق البحث ورعاية / صيانة الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية في جامعة كاليفورنيا ، ديفيس. وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة كاليفورنيا ، ديفيس ، على جميع بروتوكولات استخدام الحيوانات والإجراءات التجريبية (بروتوكول IACUC # 21874).

1. إسكان الحيوانات

1. الحصول على الفئران Sprague-Dawley من سن 8-10 أشهر. قبل أي إجراء تجريبي ، قم بإيواء الفئران في حظيرة والسماح لمدة أسبوع واحد على الأقل للتكيف العام في أقفاصها بعد دورة ضوء / مظلمة مدتها 12 ساعة مع الطعام والماء حسب الطلب.

2. التخدير وإجراءات ما قبل الجراحة

1. تخدير الجرذ بنسبة 4٪ إيزوفلوران لمدة 4 دقائق. الجرذ من أسنانه في وضع ضعيف على منصة التنبيب ، وقم بالتنبيب داخل القصبة الهوائية باستخدام قنية القصبة الهوائية ومنظار الحنجرة.
2. ضع الجرذ المخدر والمتنبب على جهاز التنفس الصناعي (2٪ إيزوفلوران وغاز حامل O2 / N2). يتم تخدير الفئران بشكل كاف إذا لم يلاحظ أي استجابة لمحفز مؤلم مثل قرصة عائق.
3. أدخل مقياس حرارة المستقيم لمراقبة درجة الحرارة باستمرار.
4. تنفيذ جميع الإجراءات الجراحية باستخدام تقنية معقمة. قص الشعر على الرأس ومنطقة الفخذ وتحضير الجلد بثلاثة مقشرات متناوبة من Betadine و 70٪ كحول قبل الجراحة.
5. استنشاق أي إفرازات تنفسية متراكمة عن طريق إزالة الفئران مؤقتا من جهاز التنفس الصناعي واستنشاق الإفرازات باستخدام أنبوب PE-50 المتصل بحقنة سعة 10 مل.
6. حماية عيون الفئران مع مرهم العين الدموع الاصطناعية المعقمة.
7. حقن بوبيفاكايين المحلي (~ 0.1 مل من محلول 0.25٪) في الجلد والأنسجة تحت الجلد قبل شق فروة الرأس.

3. بروتوكول الجراحة

1. وضع إبرة داخل البطينات ومراقبة الضغط داخل الجمجمة (ICP)
   1. ضع الجرذ في وضعية الانبطاح في إطار تجسيمي وشريط الأذن الفأر.
   2. قم بعمل شق فروة رأس 1.5 سم على طول خط الوسط باستخدام مشرط مكون من 15 شفرة.
   3. تطبيق ضغط خفيف مع الشاش للإرقاء.
   4. باستخدام قضيب طرف قطني معقم ، افصل السمحاق عن الجمجمة حتى يصبح معلم bregma مرئيا.
   5. حدد موقع bregma وقم بتمييزه باستخدام stereotaxis وحدد موقع فتحتين ثنائيتين ، 1.4 مم جانبية و 0.9 مم خلفية للبريغما.
   6. باستخدام مثقاب محمول باليد ، قم بإنشاء هذين الثقبين الصغيرين (حتى 2 مم) في نصفي الكرة الأيمن والأيسر. قم بري أي رقائق عظمية زائدة بمحلول Lactated Ringer المعقم.
   7. في نصف الكرة الأيمن ، ضع قنية توجيه 22-G على مستوى ثقب الأزيز لإدخال إبرة 28-G عبر القنية إلى عمق البطين الجانبي الأيمن (4.6 مم بالنسبة إلى bregma) من أجل إنشاء IVH.
   8. قم بتوصيل مستشعر ضغط الألياف الضوئية بوحدة القراءة. قم بتشغيل وحدة القراءة وتأكد من أن الوحدات المحددة بالمم زئبق. ثم قم بتجهيز المستشعر عن طريق غمر طرفه في دورق صغير بمحلول Lactated Ringer حتى تقرأ وحدة القراءة الصفر. بمجرد أن يتم تصفيره في محلول Lactated Ringers ، يتم ضبطه بالكامل ليتم إدخاله.
   9. في نصف الكرة الأيسر ، أدخل مستشعر الضغط برفق على عمق 2-3 مم في القشرة لمراقبة برنامج المقارنات الدولية في الوقت الفعلي.
2. قنية الشريان الفخذي وإدخال جهاز مراقبة الضغط الشرياني المتوسط (MAP)
   1. بعد إدخال جهاز مراقبة برنامج المقارنات الدولية ، أدر الجذع السفلي للفأر لسهولة الوصول إلى منطقة الفخذ والفخذ الأيسر.
   2. بعد التحضير المعقم وإدارة البوبيفاكايين المحلي ، قم بعمل شق جلدي 1.5 سم فوق الطرف الخلفي بمشرط ذو 15 شفرة.
   3. تشريح الشريان الفخذي الأيسر أولا بشكل سطحي باستخدام مرقئ ثم طبقات أعمق باستخدام ملقط مع أطراف دقيقة تحت المجهر. حدد الوريد الفخذي الأزرق العميق للمساعدة في تحديد موقع الشريان المجاور.
   4. اربط الشريان الفخذي البعيد باستخدام خياطة حريرية 3-0 وضع مشبكا معدنيا مؤقتا على الجزء القريب من الشريان الفخذي.
   5. قم بتوصيل مستشعر ضغط ألياف ضوئية ثان بوحدة القراءة المعدة بالفعل. أدخل مستشعر الضغط في أنبوب البولي إيثيلين (PE-50) ، والذي يتم إدخاله في Tuohy Borst الذي يتم إغلاقه بعد ذلك. قم بتوصيل Tuohy Borst بمحبس ثلاثي الاتجاهات متصل بحقنة سعة 1 مل في أحد طرفيه وإبرة 22-G مع أنبوب PE-50 في الطرف الآخر.
   6. تحت المجهر ، قم بعمل بضع الشريان الفخذي 2 مم باستخدام مقص دقيق وقم بتثبيته باستخدام أنبوب PE-50 متصل ببقية الإعداد.
3. الحقن داخل البطيني
   1. قم بشفط 500 ميكرولتر من الدم باستخدام حقنة سعة 1 مل وقم بتدوير محبس ثلاثي الاتجاهات لجعل مستشعر الضغط يقرأ MAP.
   2. قم بتجهيز الإبرة داخل البطينية 28-G المتصلة بأنابيب PE-50 بالدم المستنشق لحيوانات IVH و Lactated Ringer لحيوانات التحكم في السيارة. ثم أدخل هذه الإبرة في قنية التوجيه إلى عمق البطين الجانبي الأيمن.
   3. باستخدام معدل 100 ميكرولتر / دقيقة ، قم بحقن الدم أو محلول رينغر المعقم (200 ميكرولتر) في البطين الجانبي الأيمن عن طريق ضخ حقنة 1 مل بالإبهام. قبل ذلك وأثناء الحقن داخل البطيني ، يجب مراقبة وتسجيل برنامج المقارنات الدولية وضغط الدم الشرياني ودرجة حرارة المستقيم.
   4. مراقبة وتسجيل قيم ICP و MAP بعد الحقن.
4. اغلاق
   1. بعد الانتهاء من الحقن داخل البطينات ، اسحب أنبوب PE-50 الذي يحتوي على مستشعر الضغط الذي تم إدخاله في الشريان الفخذي وقم بتطبيق المشبك المؤقت على الشريان الفخذي لمنع النزيف.
   2. اربط الجزء القريب من الشريان الفخذي باستخدام خياطة الحرير 3-0.
   3. أغلق شق الفخذ بطريقة متقطعة باستخدام 3-0 حرير.
   4. قم بإزالة قنية التوجيه باستخدام الإبرة داخل البطينية وجهاز مراقبة برنامج المقارنات الدولية.
   5. أغلق ثقوب الأزيز بشمع العظام.
   6. أغلق شق الجمجمة بخياطة حريرية 3-0 بطريقة متقطعة.
   7. ضع بوبيفاكايين الموضعي على الشق وحقن 0.35 مل من كاربروفين (5 مجم / كجم) بعد الجراحة. لا تترك الحيوانات دون مراقبة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على راقد القص.
   8. السماح للفئران بالتعافي التام بعد الجراحة تحت الإشراف وإعادتها إلى أقفاصها المنزلية مع حرية الوصول إلى الطعام والماء بعد الشفاء.

4. إدارة ما بعد الجراحة

1. افحص جميع الحيوانات بعد الجراحة يوميا لمدة سبعة أيام بعد الجراحة لمراقبة تعافيها وحالتها العصبية وسلوكها ووزنها وشقوقها.
2. يتم تطبيق 0.35 مل من كاربروفين (5 ملغ/ كغ) عن طريق الحقن تحت الجلد في وقت الجراحة وفي الأيام^{1 و 2 بعد} الجراحة.
3. إزالة الغرز في يوم 7^عشر بعد الجراحة بطريقة معقمة.

النتائج

ضغوط التروية داخل الجمجمة والمتوسط الشرياني والدماغي
تم رصد كل من ICPs و MAPs أثناء الجراحة في جميع الحيوانات (الشكل 1). كانت الفئران من 8-10 أشهر بمتوسط وزن 495 ± 17 جم. كما تم جمع الرسوم البيانية لبرنامج المقارنات الدولية في الوقت الحقيقي (الشكل 2). با...

Discussion

بحثت هذه الدراسة في آليات قياس ICPs و MAPs و CPPs في نموذج حيواني لفئران IVH غير الصدمة. تم تسجيل النتائج من المجموعات التالية: الوهمية ، VH 200 μL ، والتحكم في المركبات (حقن السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي داخل البطيني). تم اختيار هذا التصميم التجريبي للتحقيق في كيفية مراقبة ICPs أثناء حقن IVH حيث افترضن?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% bupivacaine	Hospira, Inc.	409115901
1 mL syringe	Covetrus	60734
10% providine iodine solution	Aplicare	MSD093947
20 mL syringe	Covidien	8881520657
22 G needles	Becton Dickinson	305155
28 G intraventricular needles	P technologies	8IC313ISPCXC	C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection
3-0 silk suture	Henry Schein, Inc.	SP116
3-way-stopcock	Merti Medical Systems	M3SNC
4% paraformaldehyde	Fisher Chemical	30525-89-4
AnyMaze software	Any-Maze behavioral tracking software		Stoelting CO, USA
Artificial ointment	Covetrus	48272
Blood collection vials with EDTA	Becton Dickinson	367856
Bone wax	CP Medical, Inc.	CPB31A
Carprofen	Zoetis, Inc.	54771-8507-1
Centrifuge	Beckman	BE-GS6R	Model GS-6R
Cotton tip applicators	Covetrus	71214
Drill	Dremel	1600A011JA
Fiberoptic pressure sensors with readout units	Opsens Medical	OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC	Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system
Forceps		11923-13, 11064-07
Gauze	Covetrus	71043
Guillotine	World Precision Instruments	51330
Heating pad with rectal thermometer	CWE, Inc.	08-13000 ,08-13014	TC1000 Temperature controller
Hemostats		13013-14,  13008-12
Isoflurane	Covetrus	29405
Lactated ringers	Baxter Healthcare Corp.	Y345583
Laryngoscope	American Diagnostic Corporation	4080
Metal clip	Fine Scientic Tools	18056-14
Micro scissors	Fine Scientic Tools	15007-08
Microscope	Leica	model L2
Needle driver		12003-15
Polyethylene tubing	Thermo Fisher Scientific	14-170-12B	PE-50 tubing
Rats	Envigo		Sprague Dawley rats 8–10 months old
Scalpel		10010-00
Scissors		14090-11
Stereotaxic instrument	Kopf instruments		Model 940 with ear bars
Syringe pump	KD Scientific	780100	Model 100 series
Tuohy Borst	Abbott	23242
Ventilator	Harvard rodent ventilator	55-0000	Model 683