비외상성 뇌실내 출혈 설치류 모델의 두개내압 모니터링

요약

비 외상성 뇌실 내 출혈의 설치류 모델에서 두개 내압을 모니터링하는 것은 현재 문헌에서 일반적이지 않습니다. 본원에서, 우리는 래트 동물 모델에서 뇌실내 출혈 동안 두개내압, 평균 동맥압, 및 뇌관류 압력을 측정하는 기술을 시연한다.

초록

뇌실내 출혈의 생존자는 종종 심각한 장기 기억 장애를 겪습니다. 따라서 뇌실내 출혈 동물 모델을 활용한 연구가 필수적이다. 이 연구에서 우리는 쥐의 비외상성 뇌실내 출혈 동안 두개내압, 평균 동맥압 및 뇌관류 압력을 측정하는 방법을 찾았습니다. 실험 설계에는 3개의 Sprague Dawley 그룹이 포함되었습니다: 가짜, 표준 200μl 뇌실내 출혈 및 비히클 대조군. Intraparenchymal 광섬유 압력 센서를 도입하여 모든 그룹에서 정확한 두개 내 압력 측정을 얻었습니다. 대뇌 관류 압력은 두개 내압 및 평균 동맥압 값에 대한 지식으로 계산되었습니다. 예상대로, 뇌실내 출혈 및 비히클 대조군은 각각 자가 혈액 및 인공 뇌척수액의 뇌실내 주사 동안 두개내압의 상승 및 그에 따른 뇌관류 압력의 감소를 경험하였다. 트라파렌치 광섬유 압력 센서를 추가하면 정확한 두개내압 변화를 모니터링하는 데 유용합니다.

서문

두개내 출혈(ICH)의 일종인 뇌실내 출혈(IVH)은 심각한 사망률과 이환율을 수반하는 치명적인 질병입니다. IVH는 두개 내 심실 내부에 혈액 제제가 축적되는 것을 특징으로합니다. 격리된 IVH는 흔하지 않으며^{일반적으로 성인에서} 발생합니다1. 고혈압 출혈, 파열 된 두개 내 동맥류 또는 다른 혈관 기형, 종양 또는 외상¹과 관련 될 수 있습니다. IVH는 이차성 뇌 손상과 뇌수종²의 발달로 이어집니다. IVH의 생존자는 종종 부상 후 심각한 기능, 기억 및인지 장애를 겪습니다. 이러한 장기간의 인지 및 기억력 결핍은 무형유산³ 생존자의 44%에서 보고됩니다. ICH의 또 다른 유형인 지주막하 출혈(SAH)에서는 생존자의 약 절반이 기억력 결핍을 겪는 것으로 잘 알려져 있으며, SAH 외에 IVH가 있는 사람들의 경우 결과가 훨씬 더 악화되는 경향이 있습니다 ^4,5,6.

IVH 후 기억 기능 장애의 기본 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 기능 및 기억 기능 장애가 있는 비외상성 IVH 동물 모델을 활용하는 생체 내 연구는 이러한 환자에 대한 잠재적인 치료 표적을 발견하는 데 필수적입니다. IVH 후 더 심각한 기억력과 기능 장애를 가진 동물 모델이 이러한 변화를 연구하는 것이 가장 좋습니다. 수석 저자의 연구실은 또한 IVH 쥐 모델에서 기억력 결핍 발달에서 높은 두개 내압 (ICP)의 역할을 구체적으로 조사하고 있습니다. 따라서 IVH 동안 ICP를 정확하게 측정하는 방법을 조사하는 것이 중요했습니다. 여기에서는 IVH 쥐 모델에서 ICP를 정밀하게 측정하는 방법에 대해 보고합니다. ICP 모니터링은 이전에 외상성 ICH 및 지주막 하 출혈 동물 모델에서 사용되었지만 자발적인 IVH 설치류 모델에서 ICP 모니터링은 문헌 ^7,8에서 일반적으로보고되지 않았습니다. 따라서, 본원에 제시된 실험 설계는 Sprague Dawley 쥐의 세 그룹, 즉 가짜, 표준 200 μl 뇌실내 출혈 및 비히클 제어를 포함하였다. IVH 그룹의 경우, 자가 뇌실내 혈액 주입 모델을 사용하였다. 비히클 대조 동물의 경우, 멸균 젖 링거 용액의 뇌실내 주사가 사용되었다. ICP, 평균 동맥압(MAP) 및 뇌관류압(CPP)을 수술 중에 기록하였고, 그 결과가 여기에 보고되었다.

프로토콜

모든 연구 방법과 동물 관리 / 유지 관리는 캘리포니아 대학교 데이비스 (Davis)의 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)는 모든 동물 사용 프로토콜 및 실험 절차(IACUC 프로토콜 #21874)를 승인했습니다.

1. 동물 주거

1. 8-10 개월 된 Sprague-Dawley 쥐를 구하십시오. 실험 절차를 수행하기 전에 쥐를 동물 사육장에 수용하고 음식과 물로 12 시간의 명암 사이클 후 케이지에서 일반적인 적응을 위해 최소 12 주일을 허용합니다.

2. 마취 및 수술 전 절차

1. 쥐를 4 % 이소 플루 란으로 4 분 동안 마취시킵니다. 삽관 플랫폼의 앙와위 자세로 쥐를 이빨로 매달고 기관 내 캐뉼라와 후두경을 사용하여 기관 내 삽관을하십시오.
2. 마취되고 삽관된 쥐를 인공호흡기(2% 이소플루란 및 O2/N2 운반 가스)에 놓습니다. 쥐는 뒷다리 꼬집음과 같은 고통스러운 자극에 대한 반응이 관찰되지 않으면 적절하게 마취됩니다.
3. 직장 온도계를 삽입하여 온도를 지속적으로 모니터링하십시오.
4. 멸균 기술을 사용하여 모든 수술 절차를 수행하십시오. 수술 전에 머리와 대퇴골 부위의 머리카락을 자르고 베타 딘과 70 % 알코올을 번갈아 가며 피부를 준비하십시오.
5. 인공호흡기에서 쥐를 일시적으로 제거하고 50mL 주사기에 연결된 PE-10 튜브로 분비물을 흡인하여 축적된 호흡기 분비물을 흡인합니다.
6. 멸균 인공 눈물 눈 연고로 쥐의 눈을 보호하십시오.
7. 두피 절개 전에 국소 부피바카인(0.25% 용액 ~0.1mL)을 피부와 피하 조직에 주사합니다.

3. 수술 프로토콜

1. 뇌실내 바늘 및 두개내압(ICP) 모니터 배치
   1. 쥐를 입체 프레임에 엎드린 위치에 놓고 쥐를 이어 바에 넣으십시오.
   2. 15 날 메스로 정중선을 따라 1.5cm의 두피 절개를하십시오.
   3. 지혈을 위해 거즈로 약한 압력을 가하십시오.
   4. 멸균면 팁 애플리케이터를 사용하여 브레그마 랜드 마크가 보일 때까지 골막과 두개골을 분리하십시오.
   5. 스테레오택시를 사용하여 브레그마를 찾아 표시하고 브레그마의 측면 1.4mm와 후방 0.9mm의 두 개의 양측 버 구멍의 위치를 표시합니다.
   6. 휴대용 드릴을 사용하여 오른쪽 및 왼쪽 반구에 두 개의 작은 (최대 2mm) 두개골 버 구멍을 만듭니다. 멸균 젖산 링거 용액으로 과도한 뼈 조각을 씻어냅니다.
   7. 오른쪽 반구에서 버 구멍 높이에 22-G 가이드 캐뉼러를 배치하여 캐뉼러를 통해 28-G 바늘을 오른쪽 측심실 깊이 (브레그마와 관련하여 4.6mm)에 삽입하여 IVH를 생성합니다.
   8. 광섬유 압력 센서를 판독 장치에 연결합니다. 판독 장치를 켜고 선택한 단위가 mmHg 단위인지 확인하십시오. 그런 다음 판독 장치가 0을 읽을 때까지 젖산 링거 용액이 있는 작은 비커에 팁을 담그고 센서를 프라이밍합니다. 젖산 링거 용액에서 영점이 되면 모두 삽입되도록 설정됩니다.
   9. 왼쪽 반구에서 실시간 ICP 모니터링을 위해 압력 센서를 피질에 2-3mm 깊이까지 부드럽게 삽입합니다.
2. 대퇴 동맥 캐뉼러 및 평균 동맥압 (MAP) 모니터 삽입
   1. ICP 모니터를 삽입 한 후 왼쪽 허벅지와 사타구니 부위에 쉽게 접근 할 수 있도록 쥐의 아래쪽 몸통을 돌립니다.
   2. 멸균 준비 및 국소 부피 바카 인 투여 후 15 날 메스로 뒷다리 위에 1.5cm 피부 절개를하십시오.
   3. 왼쪽 대퇴 동맥을 먼저 지혈제로 표면적으로 해부 한 다음 현미경으로 미세한 팁이있는 집게를 사용하여 더 깊은 층을 해부합니다. 인접한 동맥을 찾는 데 도움이 되도록 깊고 푸른 대퇴 정맥을 식별합니다.
   4. 3-0 실크 봉합사를 사용하여 원위 대퇴 동맥을 묶고 대퇴 동맥의 근위 부분에 임시 금속 클립을 놓습니다.
   5. 두 번째 광섬유 압력 센서를 판독 장치에 이미 프라이밍했습니다. 압력 센서를 폴리에틸렌(PE-50) 튜브에 삽입한 다음 Tuohy Borst에 삽입한 다음 닫습니다. Tuohy Borst를 한쪽 끝의 3mL 주사기에 연결된 1방향 스톱콕과 다른 쪽 끝에 PE-22 튜브가 있는 50G 바늘에 연결합니다.
   6. 현미경으로 마이크로 가위로 2mm 대퇴 동맥 절개술을 만들고 나머지 설정에 연결된 PE-50 튜브로 캐뉼레이션합니다.
3. 뇌실내 주사
   1. 1mL 주사기를 사용하여 500μL의 혈액을 흡입하고 3방향 스톱콕을 돌려 압력 센서가 MAP을 읽도록 합니다.
   2. PE-28 튜브에 연결된 50-G 뇌실내 바늘을 IVH 동물용 흡인 혈액과 차량 제어 동물용 젖산 링거로 프라이밍합니다. 그런 다음이 바늘을 오른쪽 측심실 깊이까지 가이드 캐뉼러에 삽입하십시오.
   3. 100μL/min 속도를 사용하여 엄지손가락으로 1mL 주사기를 펌핑하여 혈액 또는 멸균 젖산 링거 용액(200μL)을 우측 측심실에 주입합니다. 그 전과 뇌실내 주사 중에 ICP, 동맥 혈압 및 직장 온도를 모니터링하고 기록합니다.
   4. 주입 후 ICP 및 MAP 값을 모니터링하고 기록합니다.
4. 폐쇄
   1. 뇌실내 주사가 완료되면 대퇴 동맥에 삽입된 압력 센서가 포함된 PE-50 튜브를 빼내고 임시 클립을 대퇴 동맥에 적용하여 출혈을 방지합니다.
   2. 3-0 실크 봉합사를 사용하여 대퇴 동맥의 근위 부분을 묶습니다.
   3. 3-0 실크를 사용하여 중단 된 방식으로 대퇴골 절개를 닫습니다.
   4. 뇌실내 바늘과 ICP 모니터로 가이드 캐뉼러를 제거합니다.
   5. 버 구멍을 뼈 왁스로 밀봉하십시오.
   6. 중단 된 방식으로 3-0 실크 봉합사로 두개골 절개를 닫습니다.
   7. 국소 부피바카인을 절개 부위에 바르고 수술 후 카프로펜 0.35mL(5mg/kg)를 주사합니다. 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
   8. 쥐가 감독하에 수술 후 완전히 회복 할 수 있도록하고 회복 후 음식과 물을 자유롭게 이용할 수있는 집 케이지로 되돌립니다.

4. 수술 후 관리

1. 수술 후 7 일 동안 매일 모든 수술 후 동물을 검사하여 회복, 신경 학적 상태, 행동, 체중 및 절개를 모니터링하십시오.
2. 0.35 mL의 카프로펜(5 mg/kg)을 수술 시와^{수술 후 1일 및 2}일에 피하 주사로 투여합니다.
3. 수술 후 7^일에 봉합사를 멸균 방식으로 제거하십시오.

결과

두개내, 평균 동맥 및 뇌 관류 압력
ICP와 MAP는 모두 모든 동물에서 수술 중 모니터링되었습니다(그림 1). 쥐는 8-10 개월이었고 평균 체중은 495± 17g이었습니다. 실시간 ICP 그래프도 수집되었습니다(그림 2). 가짜 그룹을 제외하고 ICP는 IVH 및 비히클 대조군에서 뇌실내 주사 중에 크게 증가했습니다(그림 3). ICP는...

토론

이 연구는 비외상성 IVH 쥐 동물 모델에서 ICP, MAPP 및 CPP를 측정하는 메커니즘을 조사했습니다. 결과는 다음의 그룹으로부터 기록되었다: 가짜, VH 200 μL, 및 비히클 대조군 (인공 뇌척수액 뇌실내 주사) 동물. 이 실험 설계는 ICP의 급증이 IVH 동물 모델에서 더 심각한 2차 뇌 손상 및 따라서 기억력 결핍에 기여할 수 있다는 가설을 세웠기 때문에 IVH 주사 중에 ICP를 모니터링할 수 있는 방법을 조사하기...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% bupivacaine	Hospira, Inc.	409115901
1 mL syringe	Covetrus	60734
10% providine iodine solution	Aplicare	MSD093947
20 mL syringe	Covidien	8881520657
22 G needles	Becton Dickinson	305155
28 G intraventricular needles	P technologies	8IC313ISPCXC	C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection
3-0 silk suture	Henry Schein, Inc.	SP116
3-way-stopcock	Merti Medical Systems	M3SNC
4% paraformaldehyde	Fisher Chemical	30525-89-4
AnyMaze software	Any-Maze behavioral tracking software		Stoelting CO, USA
Artificial ointment	Covetrus	48272
Blood collection vials with EDTA	Becton Dickinson	367856
Bone wax	CP Medical, Inc.	CPB31A
Carprofen	Zoetis, Inc.	54771-8507-1
Centrifuge	Beckman	BE-GS6R	Model GS-6R
Cotton tip applicators	Covetrus	71214
Drill	Dremel	1600A011JA
Fiberoptic pressure sensors with readout units	Opsens Medical	OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC	Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system
Forceps		11923-13, 11064-07
Gauze	Covetrus	71043
Guillotine	World Precision Instruments	51330
Heating pad with rectal thermometer	CWE, Inc.	08-13000 ,08-13014	TC1000 Temperature controller
Hemostats		13013-14,  13008-12
Isoflurane	Covetrus	29405
Lactated ringers	Baxter Healthcare Corp.	Y345583
Laryngoscope	American Diagnostic Corporation	4080
Metal clip	Fine Scientic Tools	18056-14
Micro scissors	Fine Scientic Tools	15007-08
Microscope	Leica	model L2
Needle driver		12003-15
Polyethylene tubing	Thermo Fisher Scientific	14-170-12B	PE-50 tubing
Rats	Envigo		Sprague Dawley rats 8–10 months old
Scalpel		10010-00
Scissors		14090-11
Stereotaxic instrument	Kopf instruments		Model 940 with ear bars
Syringe pump	KD Scientific	780100	Model 100 series
Tuohy Borst	Abbott	23242
Ventilator	Harvard rodent ventilator	55-0000	Model 683