Monitoraggio della pressione intracranica nel modello di roditore emorragia intraventricolare non traumatico

Riepilogo

Il monitoraggio della pressione intracranica nei modelli di roditori di emorragia intraventricolare non traumatica non è comune nella letteratura corrente. Qui, dimostriamo una tecnica per misurare la pressione intracranica, la pressione arteriosa media e la pressione di perfusione cerebrale durante l'emorragia intraventricolare in un modello animale di ratto.

Abstract

I sopravvissuti all'emorragia intraventricolare sono spesso lasciati con una significativa compromissione della memoria a lungo termine; Pertanto, la ricerca che utilizza modelli animali di emorragia intraventricolare è essenziale. In questo studio, abbiamo cercato modi per misurare la pressione intracranica, la pressione arteriosa media e la pressione di perfusione cerebrale durante l'emorragia intraventricolare non traumatica nei ratti. Il progetto sperimentale includeva tre gruppi di Sprague Dawley: sham, emorragia intraventricolare standard da 200 μl e gruppi di controllo del veicolo. Con l'introduzione di un sensore di pressione intraparenchimale a fibre ottiche, sono state ottenute misurazioni precise della pressione intracranica in tutti i gruppi. Le pressioni di perfusione cerebrale sono state calcolate con la conoscenza della pressione intracranica e dei valori medi della pressione arteriosa. Come previsto, i gruppi di emorragia intraventricolare e di controllo del veicolo hanno entrambi sperimentato un aumento della pressione intracranica e un conseguente calo della pressione di perfusione cerebrale durante l'iniezione intraventricolare di sangue autologo e liquido cerebrospinale artificiale, rispettivamente. L'aggiunta di un sensore di pressione a fibre ottiche intraparenchimali è utile per monitorare precise variazioni della pressione intracranica.

Introduzione

L'emorragia intraventricolare (IVH), un tipo di emorragia intracranica (ICH), è una malattia devastante che comporta mortalità e morbilità significative. IVH è caratterizzato come l'accumulo di prodotti sanguigni all'interno dei ventricoli intracranici. L'IVH isolata non è comune e si verifica tipicamente negli adulti¹. Può essere associata a emorragia ipertensiva, rottura di aneurisma intracranico o un'altra malformazione vascolare, tumori o traumi¹. IVH porta a lesioni cerebrali secondarie e allo sviluppo di idrocefalo². I sopravvissuti all'IVH sono spesso lasciati con significativi disturbi funzionali, di memoria e cognitivi dopo la loro lesione. Questi deficit cognitivi e di memoria a lungo termine sono riportati nel 44% dei sopravvissuti all'ICH³. Nell'emorragia subaracnoidea (SAH), un altro tipo di ICH, è ben noto che circa la metà dei sopravvissuti avrà deficit di memoria, e per coloro che hanno IVH oltre a SAH, i risultati tendono ad essere significativamente peggiori ^4,5,6.

I meccanismi sottostanti della disfunzione della memoria dopo IVH rimangono da chiarire. La ricerca in vivo che utilizza modelli animali IVH non traumatici con disfunzione funzionale e della memoria è essenziale per scoprire potenziali bersagli terapeutici per tali pazienti. I modelli animali con memoria più grave e disfunzione funzionale dopo IVH sarebbero i migliori per studiare questi cambiamenti. Il laboratorio dell'autore senior ha anche studiato specificamente il ruolo dell'alta pressione intracranica (ICP) nello sviluppo di deficit di memoria in modelli di ratto IVH. Pertanto, i metodi per misurare con precisione i PIC durante l'IVH erano importanti da indagare. Qui riportiamo i metodi per misurare con precisione gli ICP in un modello di ratto IVH. Sebbene il monitoraggio ICP sia stato precedentemente utilizzato in modelli animali traumatici di ICH e di emorragia subaracnoidea, il monitoraggio ICP in modelli spontanei di roditori IVH non è come comunemente riportato in letteratura ^7,8. Quindi, il disegno sperimentale qui presentato includeva tre gruppi di ratti Sprague Dawley: sham, emorragia intraventricolare standard da 200 μl e controllo del veicolo. Per il gruppo IVH, è stato utilizzato un modello di iniezione di sangue intraventricolare autologo. Per gli animali di controllo del veicolo, è stata utilizzata l'iniezione intraventricolare della soluzione sterile di Ringer lattato. ICP, pressioni arteriose medie (MAP) e pressioni di perfusione cerebrale (CPP) sono state registrate intraoperatoriamente e i risultati sono riportati nel presente documento.

Protocollo

Tutti i metodi di ricerca e la cura / manutenzione degli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali dell'Università della California, Davis. L'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California, Davis, ha approvato tutti i protocolli di utilizzo degli animali e le procedure sperimentali (protocollo IACUC #21874).

1. Ricovero per animali

1. Ottenere ratti Sprague-Dawley di età 8-10 mesi. Prima di qualsiasi procedura sperimentale, ospitare i ratti in un vivaio e attendere almeno 1 settimana per l'adattamento generale nelle loro gabbie dopo un ciclo luce/buio di 12 ore con cibo e acqua ad libitum.

2. Anestesia e procedure preoperatorie

1. Anestetizzare il ratto con isoflurano al 4% per 4 min. Appendere il ratto per i denti in posizione supina su una piattaforma di intubazione e intubare endotrachealmente usando una cannula endotracheale e un laringoscopio.
2. Porre il ratto anestetizzato e intubato su un ventilatore (isoflurano al 2% e gas vettore O2/N2). Il ratto è adeguatamente anestetizzato se non si osserva alcuna risposta a uno stimolo doloroso come un pizzico della zampa posteriore.
3. Inserire un termometro rettale per monitorare continuamente la temperatura.
4. Eseguire tutte le procedure operative utilizzando la tecnica sterile. Tagliare i capelli sulla testa e sulla regione femorale e preparare la pelle con tre scrub alternati di Betadine e alcol al 70% prima dell'intervento chirurgico.
5. Aspirare le secrezioni respiratorie accumulate rimuovendo temporaneamente il ratto dal ventilatore e aspirando le secrezioni con un tubo PE-50 collegato a una siringa da 10 ml.
6. Proteggi gli occhi del ratto con sterili unguenti per gli occhi di lacrime artificiali.
7. Iniettare bupivacaina locale (~0,1 ml di soluzione allo 0,25%) nella pelle e nei tessuti sottocutanei prima dell'incisione del cuoio capelluto.

3. Protocollo chirurgico

1. Posizionamento dell'ago intraventricolare e del monitor della pressione intracranica (ICP)
   1. Posizionare il ratto in posizione prona in una cornice stereotassica e barra auricolare il ratto.
   2. Fare un'incisione del cuoio capelluto di 1,5 cm lungo la linea mediana con un bisturi a 15 lame.
   3. Applicare una leggera pressione con una garza per l'emostasi.
   4. Utilizzando un applicatore sterile di cotone, separare il periostio dal cranio fino a quando il punto di riferimento del bregma è visibile.
   5. Individuare e contrassegnare il bregma usando la stereotassi e contrassegnare la posizione di due fori di bava bilaterali, 1,4 mm laterali e 0,9 mm posteriormente al bregma.
   6. Utilizzando un trapano portatile, creare questi due piccoli fori di bava cranica (fino a 2 mm) negli emisferi destro e sinistro. Irrigare eventuali trucioli ossei in eccesso con la soluzione sterile di Ringer lattato.
   7. Nell'emisfero destro, posizionare una cannula guida 22-G a livello del foro di bava per inserire l'ago 28-G attraverso la cannula fino alla profondità del ventricolo laterale destro (4,6 mm rispetto al bregma) al fine di creare IVH.
   8. Collegare il sensore di pressione in fibra ottica all'unità di lettura. Accendere l'unità di lettura e assicurarsi che le unità selezionate siano in mmHg. Quindi innescare il sensore immergendo la sua punta in un piccolo becher con la soluzione di Ringer lattato fino a quando l'unità di lettura legge zero. Una volta azzerato nella soluzione Lactated Ringers, è tutto pronto per essere inserito.
   9. Nell'emisfero sinistro, inserire delicatamente il sensore di pressione a 2-3 mm di profondità nella corteccia per il monitoraggio ICP in tempo reale.
2. Annulamento dell'arteria femorale e inserimento del monitor della pressione arteriosa media (MAP)
   1. Dopo l'inserimento del monitor ICP, ruotare il tronco inferiore del ratto per un facile accesso alla coscia sinistra e alla zona inguinale.
   2. Dopo la preparazione sterile e la somministrazione locale di bupivacaina, praticare un'incisione cutanea di 1,5 cm sull'arto posteriore con un bisturi a 15 lame.
   3. Sezionare l'arteria femorale sinistra prima superficialmente con un emostatico e poi strati più profondi usando una pinza con punte sottili al microscopio. Identificare la vena femorale blu profondo per aiutare a localizzare l'arteria adiacente.
   4. Legare l'arteria femorale distale usando una sutura di seta 3-0 e posizionare una clip metallica temporanea sulla porzione prossimale dell'arteria femorale.
   5. Avere un secondo sensore di pressione a fibre ottiche collegato all'unità di lettura già innescata. Inserire il sensore di pressione nel tubo in polietilene (PE-50), che viene inserito in un Tuohy Borst che viene poi chiuso. Collegare il Tuohy Borst a un rubinetto a 3 vie collegato a una siringa da 1 mL a un'estremità e un ago da 22 G con tubo PE-50 all'altra estremità.
   6. Al microscopio, eseguire un'arteriotomia femorale di 2 mm con micro forbici e incannularla con tubi PE-50 collegati al resto della configurazione.
3. Iniezione intraventricolare
   1. Aspirare 500 μL di sangue utilizzando una siringa da 1 mL e ruotare il rubinetto a 3 vie per far leggere MAP al sensore di pressione.
   2. Innesca l'ago intraventricolare da 28 G collegato al tubo PE-50 con il sangue aspirato per gli animali IVH e il linger lattato per gli animali di controllo del veicolo. Quindi inserire questo ago nella cannula guida fino alla profondità del ventricolo laterale destro.
   3. Utilizzando una velocità di 100 μL/min, iniettare il sangue o la soluzione sterile di Ringer lattato (200 μL) nel ventricolo laterale destro pompando la siringa da 1 mL con il pollice. Prima di questo e durante l'iniezione intraventricolare, monitorare e registrare ICP, pressione arteriosa e temperatura rettale.
   4. Monitorare e registrare i valori ICP e MAP post-iniezione.
4. Chiusura
   1. Dopo il completamento dell'iniezione intraventricolare, prelevare il tubo PE-50 contenente il sensore di pressione inserito nell'arteria femorale e applicare la clip temporanea all'arteria femorale per prevenire il sanguinamento.
   2. Legare la porzione prossimale dell'arteria femorale usando la sutura di seta 3-0.
   3. Chiudere l'incisione femorale in modo interrotto usando la seta 3-0.
   4. Rimuovere la cannula guida con l'ago intraventricolare e il monitor ICP.
   5. Sigillare i fori di bava con cera ossea.
   6. Chiudere l'incisione cranica con sutura di seta 3-0 in modo interrotto.
   7. Applicare bupivacaina topica all'incisione e iniettare 0,35 ml di carprofen (5 mg/kg) dopo l'intervento. Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumenza sternale.
   8. Consentire ai ratti di riprendersi completamente dopo l'intervento chirurgico sotto supervisione e riportarli nelle loro gabbie di casa con libero accesso al cibo e all'acqua dopo il recupero.

4. Gestione postoperatoria

1. Controlla tutti gli animali postoperatori ogni giorno per sette giorni postoperatori per monitorare il loro recupero, lo stato neurologico, il comportamento, il peso e le incisioni.
2. Somministrare 0,35 ml di carprofen (5 mg/kg) mediante iniezione sottocutanea al momento dell'intervento chirurgico e nel 1^{° e 2} °^{giorno postoperatorio} .
3. Rimuovere le suture il 7^° giorno postoperatorio in modo sterile.

Risultati

Pressioni di perfusione intracranica, arteriosa media e cerebrale
Sia i PIC che i MAP sono stati monitorati intraoperatoriamente in tutti gli animali (figura 1). I ratti avevano 8-10 mesi con un peso medio di 495 ± 17 g. Sono stati raccolti anche grafici ICP in tempo reale (Figura 2). Escludendo il gruppo fittizio, gli ICP sono aumentati significativamente durante l'iniezione intraventricolare nell'IVH e nei gruppi di controllo del ...

Discussione

Questo studio ha studiato i meccanismi per misurare ICP, MAP e CPP in un modello animale di ratto IVH non traumatico. I risultati sono stati registrati dai seguenti gruppi: sham, VH 200 μL e animali di controllo del veicolo (iniezione intraventricolare di liquido cerebrospinale artificiale). Questo disegno sperimentale è stato scelto per studiare come le ICP possono essere monitorate durante l'iniezione IVH poiché abbiamo ipotizzato che il picco di ICP possa contribuire alla lesione cerebrale secondaria più significa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% bupivacaine	Hospira, Inc.	409115901
1 mL syringe	Covetrus	60734
10% providine iodine solution	Aplicare	MSD093947
20 mL syringe	Covidien	8881520657
22 G needles	Becton Dickinson	305155
28 G intraventricular needles	P technologies	8IC313ISPCXC	C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection
3-0 silk suture	Henry Schein, Inc.	SP116
3-way-stopcock	Merti Medical Systems	M3SNC
4% paraformaldehyde	Fisher Chemical	30525-89-4
AnyMaze software	Any-Maze behavioral tracking software		Stoelting CO, USA
Artificial ointment	Covetrus	48272
Blood collection vials with EDTA	Becton Dickinson	367856
Bone wax	CP Medical, Inc.	CPB31A
Carprofen	Zoetis, Inc.	54771-8507-1
Centrifuge	Beckman	BE-GS6R	Model GS-6R
Cotton tip applicators	Covetrus	71214
Drill	Dremel	1600A011JA
Fiberoptic pressure sensors with readout units	Opsens Medical	OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC	Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system
Forceps		11923-13, 11064-07
Gauze	Covetrus	71043
Guillotine	World Precision Instruments	51330
Heating pad with rectal thermometer	CWE, Inc.	08-13000 ,08-13014	TC1000 Temperature controller
Hemostats		13013-14,  13008-12
Isoflurane	Covetrus	29405
Lactated ringers	Baxter Healthcare Corp.	Y345583
Laryngoscope	American Diagnostic Corporation	4080
Metal clip	Fine Scientic Tools	18056-14
Micro scissors	Fine Scientic Tools	15007-08
Microscope	Leica	model L2
Needle driver		12003-15
Polyethylene tubing	Thermo Fisher Scientific	14-170-12B	PE-50 tubing
Rats	Envigo		Sprague Dawley rats 8–10 months old
Scalpel		10010-00
Scissors		14090-11
Stereotaxic instrument	Kopf instruments		Model 940 with ear bars
Syringe pump	KD Scientific	780100	Model 100 series
Tuohy Borst	Abbott	23242
Ventilator	Harvard rodent ventilator	55-0000	Model 683