وصمة عار غولجي السريعة لتصور العمود الفقري الشجيري في الحصين والقشرة الجبهية

Summary

يصف البروتوكول تعديلا لطريقة Golgi السريعة ، والتي يمكن تكييفها مع أي جزء من الجهاز العصبي ، لتلطيخ الخلايا العصبية في الحصين والقشرة الجبهية الإنسية للفئران.

Abstract

يستخدم تشريب Golgi ، باستخدام مجموعة تلطيخ Golgi مع تعديلات طفيفة ، لتشريب العمود الفقري الشجيري في الحصين الفئران وقشرة الفص الجبهي الإنسية. هذه التقنية هي تحسن ملحوظ عن الطرق السابقة لتشريب غولجي لأن المواد الكيميائية المخلوطة مسبقا أكثر أمانا للاستخدام ، والخلايا العصبية مشربة بشكل جيد باستمرار ، وهناك حطام خلفية أقل بكثير ، وبالنسبة لمنطقة معينة ، هناك انحرافات صغيرة للغاية في كثافة العمود الفقري بين التجارب. علاوة على ذلك ، يمكن تجميع الأدمغة بعد نقطة معينة والاحتفاظ بها مجمدة حتى مزيد من المعالجة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن دراسة أي منطقة مثيرة للاهتمام في الدماغ. بمجرد تلطيخه وانزلاق الغطاء ، يتم تحديد كثافة العمود الفقري المتغصنة عن طريق حساب عدد العمود الفقري لطول التشعبات ويتم التعبير عنها ككثافة العمود الفقري لكل 10 ميكرومتر من التشعبات.

Introduction

تم وصف طريقة استخدام ثنائي كرومات البوتاسيوم ونترات الفضة لتسمية الخلايا العصبية لأول مرة من قبل كاميلو غولجي ^1,2 واستخدمها سانتياغو رامون إي كاخال لإنتاج مجموعة هائلة من العمل الذي يميز الأنواع الفرعية العصبية والدبقية. كتاب نشر مؤخرا مع رسوماته التوضيحية متاح الآن³. بعد دراسات رامون إي كاجال ، التي نشرت منذ أكثر من 100 عام ، تم استخدام القليل جدا من تشريب غولجي. تشريب Golgi هو عملية شاقة تسمح بالتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا العصبية باستخدام مجهر ضوئي. كانت هناك العديد من التعديلات على طريقة Golgi على مر السنين لجعل الطريقة أسهل والتلطيخ أكثر اتساقا⁴. في عام 1984 ، وصف Gabbott و Somogyi⁵ إجراء تشريب Golgi أحادي القسم الذي سمح بمعالجة أسرع. تتطلب طريقة تشريب Golgi هذه تروية بنسبة 4٪ من بارافورمالديهايد و 1.5٪ من حمض البيكريك ، بعد التثبيت تليها تقسيم الاهتزاز إلى حمام من 3٪ ثنائي كرومات البوتاسيوم. يتم تثبيت الأقسام على شرائح زجاجية ، ويتم لصق الزوايا الأربع للأغطية بحيث يكون الانتشار تدريجيا عند غمرها في نترات الفضة. ثم تنبثق الأغطية ، وتجف الأقسام ، وفي النهاية ينزلق الغطاء بشكل دائم مع وسط التركيب. تم استخدام هذه التقنية بنجاح لتسمية الخلايا العصبية والدبقية ^6,7,8 في الحصين. طريقة Golgi السريعة الموصوفة هنا هي تحسن لأن هناك تعرضا أقل بكثير لكل من ثنائي كرومات البوتاسيوم ونترات الفضة ولا يتم استخدام بارافورمالديهايد وحمض البيريكريك. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أنه يمكن تحليل الخلايا التي تم تشريبها باستخدام تعديلات طريقة Gabbott و Somogyi⁵ ، إلا أنه غالبا ما كانت الأقسام معرضة بشكل مفرط أو ناقص أو سقطت من الشرائح أثناء خطوة الجفاف وبشكل عام ، كان لا بد من تجميع العديد من التجارب للحصول على خلايا كافية للتحليل.

يصف هذا البروتوكول استخدام مجموعة تلطيخ غولجي (انظر جدول المواد) لوضع علامات على التشعبات والعمود الفقري التنغيري في الحصين والقشرة الفموية الإنسية (mPFC) للفئران. مزايا هذه الطريقة على الطرق السابقة هي أنها سريعة ، وهناك تعرض أقل للمواد الكيميائية الضارة للباحث وهناك تلطيخ ثابت للخلايا العصبية. تم استخدام البروتوكول الموصوف أدناه مع تعديلات طفيفة لتقييم كثافة العمود الفقري الشجيري في الحصين و mPFC للفئران في العديد من الدراسات⁹،^10،11،¹²،^13،14،15.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة القلب المقدس وهي متوافقة مع دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات.

1. عزل وتسلل أنسجة المخ

1. حلول الخلط المسبق A و B من مجموعة تلطيخ Golgi قبل 24 ساعة من الاستخدام والاحتفاظ بها في زجاجات داكنة و / أو في الظلام. اصنع ما يقرب من 80 مل من مزيج المحلول A و B وهو ما يكفي لتغيير المحلول بعد 24 ساعة. يخزن في زجاجات محكمة الإغلاق.
   ملاحظة: التروية مع المالحة أو بارافورمالديهايد ليست ضرورية.
2. التضحية بالفئران بالمقصلة بعد القتل الرحيم لثاني أكسيد الكربون وإزالة الأدمغة في غضون ثوان. شطف الأدمغة في محلول ملحي إذا لزم الأمر ولكن ليس ضروريا.
   1. ضع الدماغ والقشرة السفلية بحيث يكون ما تحت المهاد مرئيا لأن الجروح مصنوعة أماميا وخلفيا لها ، على سطح غير مسامي. مقطعة إلى كتلة أمامية (تحتوي على قشرة الفص الجبهي) وخلفية (تحتوي على الحصين) كما هو موضح في الشكل 1.
3. ضع الكتل في المحاليل المخلوطة مسبقا من A و B ، مع التأكد من أنها مغمورة جيدا في المحلول. تأكد من أن حجم المحاليل A و B كاف لغمر الكتل. قم بتخزين الكتل إما في زجاجات بنية اللون أو زجاجات شفافة مغطاة بورق القصدير (للحفاظ على الضوء) في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
4. استبدل المحلول بعد 24 ساعة واتركه في الظلام لمدة 13 يوما أخرى في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: إذا تم استخدامه مع أدمغة الفئران ، فليست هناك حاجة للحظر ، ويمكن وضع الدماغ بأكمله في المحلول. إذا كانت مناطق الدماغ ملطخة ، والتي تختلف في الحجم ، فقد يتعين تحديد الوقت في المحاليل A و B عن طريق التجربة والخطأ.
5. بعد أسبوعين ، يتم اختراق الأنسجة جيدا باستخدام المحاليل A و B ، ونقل الكتل إلى محلول cryoprotectant (الحل C في مجموعة تلطيخ Golgi) ، وتركها لمدة 48-72 ساعة عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: بعد الحماية بالتبريد، قد يتم تجميد الكتل حتى مزيد من المعالجة. لاحظ أيضا أن جميع الحلول من المجموعة يتم جمعها والتخلص منها كنفايات خطرة.
6. تجميد الدماغ ، القشرة السفلية ، على شريحة زجاجية على الثلج الجاف. بمجرد تجميدها ، إما أن تقطع على cryostat أو تخزن عند -80 درجة مئوية حتى يتم تقسيمها باستخدام cryostat.
   ملاحظة: لا تجمد في النيتروجين السائل لأن هذا ينتج تشققات في الأنسجة.

2. تقسيم أنسجة المخ

1. ضع كمية صغيرة من الأنسجة المتوسطة على تشاك كريوستات المبرد مسبقا. قم بتركيب الكتل على تشاك cryostat عن طريق إذابة جانب واحد من الكتلة قليلا في متناول اليد (مبشور) ووضعها على وسط الأنسجة.
   ملاحظة: ليس من الضروري تضمين الأنسجة. الكتلة التي تحتوي على الحصين أسهل إلى حد ما في القطع من الكتلة مع قشرة الفص الجبهي لأن الأخير أمامي للجسم الثفني والنصفان منفصلان.
2. قطع مقاطع 100 ميكرومتر على كريوستات عند -22 درجة مئوية وقم بتركيبها على شرائح تحت السرير. يمكن استخدام أقسام يصل سمكها إلى 150 ميكرومتر. حاول تركيب 3-4 مقاطع إكليلية لكل شريحة لأن هذا يقلل من عدد الشرائح التي تتطلب المعالجة. استخدم إحدى التقنيات التالية للحفاظ على الأقسام مجمدة حتى تصل إلى الشريحة.
   ملاحظة: لا يتم إصلاح هذه الأقسام بالطريقة المعتادة وبالتالي فهي تميل إلى الذوبان بسرعة. اسمح للأقسام بالذوبان على الشريحة. إذا بدأت في الذوبان قبل وضعها على الشريحة ، فمن المستحيل جعلها مسطحة على الشريحة. هناك العديد من التقنيات للقيام بذلك.
   1. استخدم رذاذ تجميد على السكين والكتلة. اعتمادا على درجة الحرارة والرطوبة في الغرفة ، قد يكون هذا ضروريا لكل قسم. استخدم إما اللوحة المضادة للتدحرج أو فرشاة للحفاظ على القسم مسطحا أثناء القطع.
      ملاحظة: تأكد من وجود ما يكفي من رذاذ التجميد. يمكن استخدام العديد من العلب عند قطع 20 كتلة.
   2. قم بإذابة التركيب ، إن أمكن ، باستخدام شريحة درجة حرارة الغرفة ووضعها بسرعة في القسم. مع الممارسة ، يمكن للمرء تركيب عدة أقسام في وقت واحد. إذا لم ينجح ذلك ، فاحتفظ بالشرائح في cryostat بحيث تكون باردة جدا وانقل القسم بملقط بارد أو فرشاة طلاء باردة ثم قم بإذابة التركيب.
3. نظف السكين بمناديل ورقية بين الشرائح. إذا كانت السكين تتطلب المزيد من التنظيف ، فاستخدم الإيثانول 100٪ (EtOH) ، واتركه يجف قبل قطع الشريحة التالية.
4. بمجرد تركيبها على الشريحة، ضع الشريحة بشكل مسطح على صواني شرائح من الورق المقوى واسمح للأقسام بالجفاف في درجة حرارة الغرفة (لعدة ساعات بحد أقصى 48 ساعة) في الظلام. لا تقم بتغطية درج الشرائح. تأكد من أن الأقسام جافة تماما قبل تشريب غولجي. يخزن بشكل مسطح ، في الظلام ، على صواني الشرائح حتى تشريب Golgi.
   ملاحظة: تجفيف الأقسام لا يسبب أي ضرر.

3. تلطيخ وجفاف أنسجة المخ

1. أداء تلطيخ في أطباق تلطيخ الزجاج. امزج المحاليل D و E مباشرة قبل التلطيخ. وفقا للبروتوكول ، أضف جزءا واحدا من المحلول D ، وجزءا واحدا من المحلول E ، وجزأين من الماء المقطر. بالنسبة لأطباق تلطيخ الزجاج ، قم بعمل محلول 200 مل لغمر الأقسام بالكامل. بالنسبة لجرار كوبلين ، يتطلب هذا حجما أقل.
2. ضع الشرائح في رفوف متباعدة بما فيه الكفاية للسماح للحل بالوصول إلى الأقسام.
3. ضع المقاطع في الماء المقطر لمدة 4 دقائق (2x) قبل وضعها في محلول تلطيخ تشريب Golgi لمدة 10 دقائق. تغيير حل تلطيخ كل 70 قسما. تغيير الماء المقطر عندما يتحول إلى اللون الأصفر.
   ملاحظة: توقيت خطوة التلطيخ أمر بالغ الأهمية. قصيرة جدا لا تسمح بما يكفي من التلطيخ وتسبب طويلة جدا على تلطيخ ، مما يجعل من الصعب فصل التشعبات عند إجراء التحليل. بمجرد الخروج من محلول التلطيخ ، يكون التوقيت أقل أهمية.
4. تجفيف الأقسام على النحو التالي: 70٪ EtOH (5 دقائق) ، 95٪ EtOH (5 دقائق ؛ 2x) ، 100٪ EtOH (5 دقائق ؛ 2x) ، عامل المقاصة (5 دقائق ؛ 3x). قم بتغيير جميع الحلول في كثير من الأحيان ، وخاصة 100٪ EtOH وعامل المقاصة لضمان بقاء الأقسام غير المائية.
   ملاحظة: ليس من الضروري المرور بخطوة EtOH بنسبة 50٪. ليست هناك حاجة إلى تلطيخ مضاد لتصور الخلايا لأن تشريب غولجي يوفر تباينا كافيا. ولم ينجح استخدام عوامل مقاصة أخرى مثل تلك المستخدمة هنا (انظر جدول المواد).
5. غطاء مع أغطية زجاجية بطول 60 مم مع كمية كبيرة من وسط التركيب. تأكد من وجود أقل عدد ممكن من فقاعات الهواء. إذا لزم الأمر ، قم بإزالة الغطاء بعناية وإعادة صياغته (يمكن القيام به حتى بعد أسابيع). قم بذلك ببطء شديد حتى لا تتلف القسم (يمكن القيام به بسبب الكمية الكبيرة من وسط التركيب).
   ملاحظة: كمية كبيرة من وسط التركيب فوضوية إلى حد ما ولكنها لا تزال ضرورية لأنه يجب استخدام وسط تركيب كاف لتغطية الأقسام السميكة التي تبلغ سعتها 100 ميكرومتر.
6. لضمان وضع غطاء واحد فقط على الأقسام ، افصل الأغطية قبل العملية.
7. بمجرد انزلاق الغطاء ، ينزلق الشرائح الجافة بشكل مسطح على أي ورق غير مسامي لمدة 3-5 أيام ، مع تحريكها قليلا ، خاصة بعد اليوم الأول ، لتجنب الالتصاق. بعد 3-5 أيام ، انقل الشرائح إلى حاملات الشرائح ، ومن الناحية المثالية ، قم بتجفيف الشرائح لمدة 3 أسابيع على الأقل قبل فحصها. حافظ على الشرائح مسطحة لتقليل احتمال تشكل فقاعات الهواء.

4. تحديد كثافة العمود الفقري المكدد

1. لتحليل كثافة العمود الفقري التنغمي في الخلايا العصبية الهرمية لكل من mPFC ومنطقة CA1 من الحصين ، افحص التشعبات القاعدية الثانوية الأكثر جانبية والتشعبات القمية الثالثة الجانبية كما هو موضح في الخطوة 4.1.1 (الشكل 2).
   1. اختر التشعبات ، وقم بقياس طول التشعبات باستخدام برنامج تحليل الصور ، وعد العمود الفقري على التشعبات باستخدام عداد اليد ، وسجل كل من طول وعدد العمود الفقري.
2. دراسة وتحليل ست خلايا لكل منطقة (mPFC، CA1) لكل دماغ. حدد ما لا يقل عن ستة أدمغة لكل مجموعة كما هو موضح سابقا ^7,8. اختر الخلايا العصبية التي تلبي المعايير التالية للتحليل: يتم تشريب أجسام الخلايا والتشعبات بشكل جيد ؛ يمكن تمييز التشعبات عن الخلايا المجاورة وهي مستمرة.
3. عد العمود الفقري عند 1000x (غمر الزيت) عن طريق العد اليدوي باستخدام المجهر الضوئي وقياس طول الشجيرات باستخدام برنامج تحليل الصور. احسب كثافة العمود الفقري بقسمة رقم العمود الفقري على طول التشعبات والبيانات الصريحة كعدد العمود الفقري / 10 ميكرومتر التشعب.
   ملاحظة: هناك طرق أكثر تطورا بكثير للتمييز بين الأنواع الفرعية للعمود الفقري والبنية المتغصنة التي يمكن استخدامها ، ولكن العد اليدوي باستخدام المجهر الضوئي عند 1000x يمكن أن يعطي نتيجة سريعة يمكنها بعد ذلك تحديد ما إذا كان من الضروري إجراء مزيد من التحقيق. على الرغم من بذل كل جهد ممكن لأخذ عينات من التشعبات المماثلة باستمرار ، إلا أن هناك اختلافات في السمك قد تؤثر على العد.

النتائج

باستخدام طريقة Golgi السريعة ، يتم تشريب الخلايا بشكل جيد باستمرار بحيث يكون هناك الكثير من الخلايا لتحليلها. وهذا تحسن ملحوظ مقارنة بالطرق السابقة حيث كان لا بد من تجميع التجارب للحصول على بيانات كافية للتحليل. لذلك ، يمكن معالجة المزيد من العينات في وقت واحد ويمكن تخزين الأدمغة مجمدة حتى ا...

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة تشريب غولجي التي تسمح بالمعالجة السريعة المتزامنة للعديد من الأقسام. إنه تحسن على⁵ طرق أخرى كثيفة العمالة موصوفة سابقا وينتج باستمرار خلايا عصبية مشربة للتحليل. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تعرض أقل للمواد الكيميائية السامة المستخدمة في تشريب غولجي. الجز?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardboard slides trays	Fisher Scientific	12-587-10
Coverslips 24 x 60mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit	FD Neurotechnologies	PK 401	Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	clearing agent
NCSS Software	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65	Used to mount brains on cryostat chuck