Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.

Zusammenfassung

Die Golgi-Imprägnierung unter Verwendung des Golgi-Färbesets mit geringfügigen Anpassungen wird verwendet, um dendritische Stacheln im Hippocampus der Ratte und im medialen präfrontalen Kortex zu imprägnieren. Diese Technik ist eine deutliche Verbesserung gegenüber früheren Methoden der Golgi-Imprägnierung, da die vorgemischten Chemikalien sicherer zu verwenden sind, Neuronen durchweg gut imprägniert sind, es viel weniger Hintergrundablagerungen gibt und für eine bestimmte Region extrem kleine Abweichungen in der Wirbelsäulendichte zwischen den Experimenten auftreten. Darüber hinaus können Gehirne ab einem bestimmten Punkt akkumuliert und bis zur Weiterverarbeitung eingefroren gehalten werden. Mit dieser Methode kann jede interessierende Hirnregion untersucht werden. Nach der Färbung und dem Verrutschen der Abdeckung wird die dendritische Wirbelsäulendichte bestimmt, indem die Anzahl der Stacheln für eine Länge von Dendrit gezählt und als Wirbelsäulendichte pro 10 μm Dendrit ausgedrückt wird.

Einleitung

Die Methode, Kaliumdichromat und Silbernitrat zur Markierung von Neuronen zu verwenden, wurde zuerst von Camillo Golgi^1,2 beschrieben und anschließend von Santiago Ramon y Cajal verwendet^, um eine immense Arbeit zur Unterscheidung neuronaler und glialer Subtypen zu produzieren. Ein kürzlich erschienenes Buch mit seinen Illustrationen ist jetzt^{erhältlich 3}. Nach den Studien von Ramon y Cajal, die vor mehr als 100 Jahren veröffentlicht wurden, wurde nur sehr wenig Golgi-Imprägnierung verwendet. Die Golgi-Imprägnierung ist ein mühsamer Prozess, der die dreidimensionale Visualisierung von Neuronen mit einem Lichtmikroskop ermöglicht. Es gab im Laufe der Jahre zahlreiche Modifikationen der Golgi-Methode, um die Methode zu erleichtern und die Färbung konsistenter^{zu machen 4}. 1984 beschrieben Gabbott und Somogyi⁵ das einteilige Golgi-Imprägnierverfahren, das eine schnellere Verarbeitung ermöglichte. Diese Golgi-Imprägniermethode erfordert eine Perfusion mit 4% Paraformaldehyd und 1,5% Picrinsäure, gefolgt von der Vibratom-Schnitt in ein Bad aus 3% Kaliumdichromat. Abschnitte werden auf Glasobjektträger montiert, die vier Ecken der Deckgläser so verklebt, dass beim Eintauchen in Silbernitrat die Diffusion allmählich erfolgt. Anschließend werden Deckgläser abgenommen, Abschnitte dehydriert und schließlich mit Montagemedium dauerhaft verrutscht. Diese Technik wurde erfolgreich eingesetzt, um Neuronen und Glia ^6,7,8 im Hippocampus zu markieren^. Die hier beschriebene schnelle Golgi-Methode ist eine Verbesserung, da sowohl Kaliumdichromat als auch Silbernitrat weitaus geringer ausgesetzt sind und kein Paraformaldehyd und keine Pikrinsäure verwendet werden. Obwohl Zellen, die mit Modifikationen der Gabbott- und^{Somogyi-5-Methode} imprägniert wurden, analysiert werden konnten, waren die Abschnitte während des Dehydratisierungsschritts oft über- oder unterbelichtet oder fielen von den Objektträgern und im Allgemeinen mussten mehrere Experimente gepoolt werden, um genügend Zellen für die Analyse zu haben.

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung des Golgi-Färbesets (siehe Materialtabelle) zur Kennzeichnung von Dendriten und dendritischen Stacheln im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex (mPFC) der Ratte. Die Vorteile dieser Methode gegenüber früheren sind, dass sie schnell ist, es weniger Exposition gegenüber schädlichen Chemikalien für den Forscher gibt und es eine konsistente Färbung von Neuronen gibt. Das unten beschriebene Protokoll wurde mit geringfügigen Modifikationen verwendet, um die dendritische Wirbelsäulendichte im Hippocampus und mPFC der Ratte in vielen Studien 9,10,11,12,13,14,15 zu beurteilen.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren sind vom Institutional Animal Care and Use Committee der Sacred Heart University genehmigt und entsprechen dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren.

1. Isolierung und Infiltration von Hirngewebe

1. Premixen Sie die Lösungen A und B des Golgi Färbesets 24 h vor Gebrauch und bewahren Sie sie in dunklen Flaschen und/oder im Dunkeln auf. Machen Sie ungefähr 80 ml Lösung A und B Mischung, die ausreicht, um die Lösung nach 24 h zu wechseln. In luftdichten Flaschen aufbewahren.
   HINWEIS: Eine Perfusion mit Kochsalzlösung oder Paraformaldehyd ist nicht erforderlich.
2. Opfere Ratten nach Kohlendioxid-Euthanasie mit der Guillotine und entferne Gehirne innerhalb von Sekunden. Spülen Sie Gehirne in Kochsalzlösung, wenn erforderlich, aber nicht notwendig.
   1. Platzieren Sie das Gehirn, den Kortex nach unten, so dass der Hypothalamus sichtbar ist, da die Schnitte vor und nach ihm auf einer nicht porösen Oberfläche erfolgen. Geschnitten in einen vorderen (enthält den präfrontalen Kortex) und hinteren (enthält den Hippocampus) Block, wie in Abbildung 1 gezeigt.
3. Platzieren Sie Blöcke in den vorgemischten Lösungen von A und B und stellen Sie sicher, dass sie gut in die Lösung eingetaucht sind. Stellen Sie sicher, dass das Volumen der Lösungen A und B ausreicht, um in die Blöcke einzutauchen. Lagern Sie Blöcke entweder in braunen Flaschen oder durchsichtigen Flaschen, die mit Folie bedeckt sind (um Licht draußen zu halten), im Dunkeln bei Raumtemperatur.
4. Ersetzen Sie die Lösung nach 24 h und halten Sie sie für weitere 13 Tage bei Raumtemperatur im Dunkeln.
   HINWEIS: Bei Verwendung mit Mäusegehirnen besteht keine Notwendigkeit zu blockieren, und das gesamte Gehirn kann in die Lösung eingebracht werden. Wenn Gehirnareale gefärbt werden, die unterschiedlich groß sind, muss die Zeit in den Lösungen A und B möglicherweise durch Versuch und Irrtum bestimmt werden.
5. Nach zwei Wochen wird das Gewebe mit den Lösungen A und B gut infiltriert, die Blöcke in die Kryoprotektionslösung (Lösung C im Golgi-Färbeset) überführt und 48-72 h bei 4 °C stehen gelassen.
   HINWEIS: Nach dem Kryoschutz können Blöcke bis zur Weiterverarbeitung eingefroren werden. Beachten Sie auch, dass alle Lösungen aus dem Kit gesammelt und als gefährlicher Abfall entsorgt werden.
6. Gehirn einfrieren, Kortex runter, auf einem Glasschieber auf Trockeneis. Nach dem Einfrieren entweder auf dem Kryostaten schneiden oder bei -80 °C lagern, bis es mit einem Kryostaten geschnitten wird.
   HINWEIS: Nicht in flüssigem Stickstoff einfrieren, da dies zu Rissen im Gewebe führt.

2. Schnitt von Hirngewebe

1. Legen Sie eine kleine Menge Gewebemedium auf ein vorgekühltes Kryostatenfutter. Montieren Sie Blöcke auf Kryostatenfuttern, indem Sie eine Seite des Blocks leicht in der Hand auftauen (behandschuht) und auf das Gewebemedium legen.
   HINWEIS: Es ist nicht notwendig, das Gewebe einzubetten. Der Block, der den Hippocampus enthält, ist etwas leichter zu schneiden als der Block mit dem präfrontalen Kortex, da dieser vor dem Corpus callosum liegt und die beiden Hälften getrennt sind.
2. Schneiden Sie 100 μm-Abschnitte auf einem Kryostaten bei -22 °C und montieren Sie sie auf Unterbettschienen. Es können Abschnitte mit einer Dicke von bis zu 150 μm verwendet werden. Versuchen Sie, 3-4 koronale Abschnitte pro Folie zu mounten, da dies die Anzahl der Folien verringert, die verarbeitet werden müssen. Verwenden Sie eine der folgenden Techniken, um die Abschnitte eingefroren zu halten, bis sie auf die Folie gelangen.
   HINWEIS: Diese Abschnitte sind nicht auf die übliche Weise fixiert und neigen daher dazu, schnell zu schmelzen. Lassen Sie die Abschnitte auf der Folie schmelzen. Wenn sie anfangen zu schmelzen, bevor sie auf die Rutsche gelegt werden, ist es unmöglich, sie dazu zu bringen, flach auf der Rutsche zu sein. Es gibt mehrere Techniken, um dies zu tun.
   1. Verwenden Sie ein Gefrierspray auf das Messer und den Block. Abhängig von der Temperatur und Luftfeuchtigkeit im Raum kann dies für jeden Abschnitt erforderlich sein. Verwenden Sie entweder die Antirollplatte oder eine Bürste, um den Abschnitt beim Schneiden flach zu halten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Gefrierspray haben. Beim Schneiden von 20 Blöcken können mehrere Dosen verwendet werden.
   2. Taumontieren, wenn möglich, mit einer Raumtemperaturschiene und schnell auf den Abschnitt aufbringen. Mit etwas Übung kann man mehrere Abschnitte gleichzeitig montieren. Wenn dies nicht funktioniert, halten Sie die Dias im Kryostaten, so dass sie sehr kalt sind, und übertragen Sie den Abschnitt mit einer kalten Pinzette oder einem kalten Pinsel und dann die Auftaumontage.
3. Reinigen Sie das Messer mit Papiertüchern zwischen den Scheiben. Wenn das Messer mehr Reinigung benötigt, verwenden Sie 100% Ethanol (EtOH) und lassen Sie es trocknen, bevor Sie die nächste Scheibe schneiden.
4. Nach der Montage auf dem Dia legen Sie den Schlitten flach auf Kartonschienen und lassen Sie die Abschnitte bei Raumtemperatur (für mehrere Stunden bis maximal 48 h) im Dunkeln trocknen. Decken Sie das Objektträgerfach nicht ab. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte vor der Golgi-Imprägnierung vollständig trocken sind. Flach, im Dunkeln, auf Schiebefächern bis zur Golgi-Imprägnierung aufbewahren.
   HINWEIS: Das Trocknen der Abschnitte verursacht keine Schäden.

3. Färbung und Austrocknung des Hirngewebes

1. Führen Sie das Färben in Glasfärbeschüsseln durch. Mischen Sie die Lösungen D und E unmittelbar vor dem Färben. Gemäß dem Protokoll fügen Sie einen Teil der Lösung D, einen Teil der Lösung E und zwei Teile destilliertes Wasser hinzu. Für Glasfleckenschüsseln stellen Sie eine 200-ml-Lösung her, um die Abschnitte vollständig einzutauchen. Für Koplin-Gläser erfordert dies weniger Volumen.
2. Platzieren Sie die Folien in Racks, die weit genug voneinander entfernt sind, um der Lösung den Zugriff auf Abschnitte zu ermöglichen.
3. Legen Sie Abschnitte für 4 min (2x) in destilliertes Wasser, bevor Sie sie für 10 min in die Golgi-Imprägnierlösung geben. Ändern Sie die Färbelösung alle 70 Abschnitte. Wechseln Sie das destillierte Wasser, wenn es gelb wird.
   HINWEIS: Das Timing für den Färbeschritt ist entscheidend. Zu kurz lässt nicht genügend Färbung zu und zu lange Ursachen für eine Färbung, wodurch die Dendriten bei der Analyse schwer zu trennen sind. Sobald Sie die Färbelösung verlassen haben, ist das Timing weniger kritisch.
4. Dehydrieren Sie die Abschnitte wie folgt: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), Clearing Agent (5 min; 3x). Wechseln Sie häufig alle Lösungen, insbesondere das 100% EtOH und das Clearingmittel, um sicherzustellen, dass die Abschnitte wasserfrei bleiben.
   HINWEIS: Es ist nicht notwendig, einen 50% EtOH-Schritt zu durchlaufen. Eine Gegenfärbung ist für die Zellvisualisierung nicht erforderlich, da die Golgi-Imprägnierung einen ausreichenden Kontrast bietet. Die Verwendung anderer Verrechnungsmittel hat nicht so gut funktioniert wie die hier verwendete (siehe Materialtabelle).
5. Deckglas mit Glasabdeckungen, die 60 mm lang sind und eine großzügige Menge an Montagemedium enthalten. Stellen Sie sicher, dass es so wenig Luftblasen wie möglich gibt. Entfernen Sie bei Bedarf vorsichtig das Deckblatt und wiederholen Sie es (kann auch Wochen später durchgeführt werden). Tun Sie dies sehr langsam, um den Abschnitt nicht zu beschädigen (kann aufgrund der großen Menge an Montagemedium durchgeführt werden).
   HINWEIS: Eine große Menge an Montagemedium ist etwas unordentlich, aber immer noch notwendig, da genügend Montagemedium verwendet werden muss, um die dicken 100-μm-Abschnitte abzudecken.
6. Um sicherzustellen, dass nur ein Deckglas auf den Abschnitten angebracht wird, trennen Sie die Deckgläser vor dem Prozess.
7. Sobald die Abdeckung verrutscht ist, rutscht der Trockenraum 3-5 Tage lang flach auf jedem nicht porösen Papier und bewegt sie leicht, besonders nach dem ersten Tag, um ein Verkleben zu vermeiden. Nach 3-5 Tagen werden die Objektträger mindestens 3 Wochen lang auf Diahalter und idealerweise auf Trockenschienen übertragen, bevor sie untersucht werden. Halten Sie die Folien flach, um die Möglichkeit der Bildung von Luftblasen zu verringern.

4. Bestimmung der dendritischen Wirbelsäulendichte

1. Zur Analyse der dendritischen Wirbelsäulendichte in pyramidalen Neuronen sowohl der mPFC- als auch der CA1-Region des Hippocampus sind die meisten lateralen sekundären basalen Dendriten und die meisten lateralen tertiären apikalen Dendriten zu untersuchen, wie in Schritt 4.1.1 beschrieben (Abbildung 2).
   1. Wählen Sie einen Dendriten, messen Sie die Länge des Dendriten mit einem Bildanalyseprogramm, zählen Sie die Stacheln auf den Dendriten mit einem Handzähler und zeichnen Sie sowohl die Länge als auch die Anzahl der Stacheln auf.
2. Untersuchen und analysieren Sie sechs Zellen pro Region (mPFC, CA1) pro Gehirn. Quantifizieren Sie mindestens sechs Gehirne pro Gruppe, wie zuvor beschrieben ^7,8. Wählen Sie Neuronen, die die folgenden Analysekriterien erfüllen: Zellkörper und Dendriten sind gut imprägniert; Dendriten sind von benachbarten Zellen unterscheidbar und kontinuierlich.
3. Zählen Sie die Stacheln bei 1000x (Öl-Immersion) durch Handzählung mit einem Lichtmikroskop und messen Sie die dendritische Länge mit einem Bildanalyseprogramm. Berechnen Sie die Wirbelsäulendichte, indem Sie die Wirbelsäulenzahl durch die Länge des Dendriten dividieren und die Daten als Anzahl der Stacheln / 10 μm Dendrit ausdrücken.
   HINWEIS: Es gibt weitaus ausgefeiltere Methoden zur Unterscheidung von Wirbelsäulensubtypen und dendritischer Architektur, die verwendet werden können, aber die Handzählung mit einem Lichtmikroskop bei 1000x kann ein schnelles Ergebnis liefern, das dann feststellen kann, ob weitere Untersuchungen erforderlich sind. Obwohl alle Anstrengungen unternommen werden, um ähnliche Dendriten konsistent zu beproben, gibt es Variationen in der Dicke, die die Zählung beeinflussen können.

Ergebnisse

Mit der schnellen Golgi-Methode werden Zellen durchweg gut imprägniert, so dass genügend Zellen zu analysieren sind. Dies ist eine deutliche Verbesserung gegenüber früheren Methoden, bei denen Experimente gepoolt werden mussten, um genügend Daten für die Analyse zu erhalten. Daher können mehr Proben auf einmal verarbeitet werden und Gehirne können bis zur Verarbeitung eingefroren gelagert werden. Beispiele für Golgi-imprägnierte Zellen in der CA1-Region des Hippocampus sind in Abbildung 3

Diskussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode der Golgi-Imprägnierung, die eine schnelle gleichzeitige Verarbeitung vieler Abschnitte ermöglicht. Es ist eine Verbesserung gegenüber zuvor beschriebenen⁵ arbeitsintensiveren Methoden und liefert durchweg imprägnierte Neuronen für die Analyse. Darüber hinaus ist die Exposition gegenüber giftigen Chemikalien, die bei der Golgi-Imprägnierung verwendet werden, geringer. Der schwierigste Teil des Prozesses besteht darin, die Abschnitte auf den...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardboard slides trays	Fisher Scientific	12-587-10
Coverslips 24 x 60mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit	FD Neurotechnologies	PK 401	Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	clearing agent
NCSS Software	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65	Used to mount brains on cryostat chuck