快速高尔基染色用于海马体和前额叶皮层树突状脊柱可视化

摘要

该协议描述了快速高尔基体方法的修改，该方法可以适应神经系统的任何部分，用于染色大鼠海马体和内侧前额叶皮层中的神经元。

摘要

高尔基体浸渍，使用具有轻微适应的高尔基染色试剂盒，用于浸渍大鼠海马体和内侧前额叶皮层中的树突状棘。这种技术比以前的高尔基体浸渍方法有了显着的改进，因为预混合的化学物质使用起来更安全，神经元始终浸渍良好，背景碎片少得多，并且对于给定的区域，实验之间的脊柱密度存在极小的偏差。此外，大脑可以在某一点后积累并保持冷冻，直到进一步处理。使用这种方法可以研究任何感兴趣的大脑区域。一旦染色并覆盖滑动，树突状脊柱密度通过计算树突长度的棘数量来确定，并表示为每10μm树突的脊柱密度。

引言

使用重铬酸钾和硝酸银标记神经元的方法首先由Camillo Golgi^1，2 描述，随后由Santiago Ramon y Cajal使用，以产生大量区分神经元和神经胶质亚型的工作。最近出版的一本附有他的插图的书现已出版³.在100多年前发表的Ramon y Cajal的研究之后，很少使用高尔基体浸渍。高尔基体浸渍是一个费力的过程，允许用光学显微镜对神经元进行三维可视化。多年来，高尔基体方法进行了多次修改，使方法更容易，染色更一致⁴。1984年，Gabbott和Somogyi⁵ 描述了单段高尔基体浸渍程序，该程序允许更快速的加工。这种高尔基体浸渍方法需要用4%多聚甲醛和1.5%苦味酸灌注，固定后，然后振动切片到3%重铬酸钾浴中。切片安装在载玻片上，盖玻片的四个角粘合在一起，以便当浸入硝酸银中时，扩散是渐进的。然后将盖玻片弹出，部分脱水，并最终用安装介质永久滑落盖板。该技术被成功地用于标记海马体中的神经元和神经胶质细胞^6，7，8 。这里描述的快速高尔基体方法是一种改进，因为重铬酸钾和硝酸银的暴....

研究方案

所有实验程序均由圣心大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合NIH动物护理和使用指南。

1. 脑组织的分离和浸润

1. 使用前24小时高尔基体染色试剂盒的预混溶液A和B，并保存在深色瓶中和/或黑暗中。制作约80 mL溶液A和B混合物，足以在24小时后更换溶液。存放在密封瓶中。
   注意：不需要用盐水或多聚甲醛灌注。
2. 在二氧化碳安乐死后通过断头台处死老鼠，并在几秒钟内切除大脑。如果需要，用盐水冲洗大脑，但不是必需的。
   1. 将大脑皮层向下放置，使下丘脑可见，因为切口是在无孔表面上的前后部形成的。切成前部（包含前额叶皮层）和后部（包含海马体）块，如图 1所示。
3. 将块放入A和B的预混合溶液中，确保它们很好地浸入溶液中。确保溶液 A 和 B 的体积足以浸入块中。将块存放在棕色瓶子或覆盖有铝箔的透明瓶子中（以保持光线昏暗）在室温下。
4. 24小时后更换溶液，并在室温下在黑暗中再保持13天。
   注意：如果与小鼠大脑一起使用，则无需阻塞，并且可以将整个大脑放置在溶液中。如果染色大小不同的大脑区域，则溶液A和B中的时间可能必须通过反复试验来确定。
5. 两周后，组织用溶液A和B很好地浸润，将块转移到冷冻保护剂溶液（高尔基体染色试剂盒中的溶液C）中，并在4°C下放置48-72小....

结果

使用快速高尔基体方法，细胞始终被很好地浸渍，以便有足够的细胞进行分析。与以前的方法相比，这是一个显着的改进，在以前的方法中，必须将实验合并以具有足够的数据进行分析。因此，可以一次处理更多的样品，并且可以冷冻储存大脑直到处理。 图3显示了海马体CA1区域中高尔基体浸渍细胞在低功率和高功率下的例子。对给定区域中的棘进行计数可以产生具有小标?.......

讨论

本方案描述了一种高尔基体浸渍方法，该方法允许快速同时处理许多切片。这是对前面描述的⁵ 种劳动密集型方法的改进，并且始终产生浸渍神经元进行分析。此外，接触高尔基体浸渍中使用的有毒化学物质较少。该过程中最具挑战性的部分是使切片在幻灯片上保持平坦，这需要大量的练习。使用冷冻喷雾保持所有东西尽可能冷是至关重要的。

一旦载玻片干.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardboard slides trays	Fisher Scientific	12-587-10
Coverslips 24 x 60mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit	FD Neurotechnologies	PK 401	Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	clearing agent
NCSS Software	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65	Used to mount brains on cryostat chuck