Coloration rapide de Golgi pour la visualisation de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le cortex préfrontal

Résumé

Le protocole décrit une modification de la méthode rapide de Golgi, qui peut être adaptée à n’importe quelle partie du système nerveux, pour colorer les neurones de l’hippocampe et du cortex préfrontal médian du rat.

Résumé

L’imprégnation golgi, utilisant le kit de coloration Golgi avec des adaptations mineures, est utilisée pour imprégner les épines dendritiques dans l’hippocampe du rat et le cortex préfrontal médian. Cette technique est une amélioration marquée par rapport aux méthodes précédentes d’imprégnation de Golgi car les produits chimiques prémélangés sont plus sûrs à utiliser, les neurones sont toujours bien imprégnés, il y a beaucoup moins de débris de fond et, pour une région donnée, il existe des écarts extrêmement faibles dans la densité de la colonne vertébrale entre les expériences. De plus, les cerveaux peuvent être accumulés après un certain point et conservés congelés jusqu’à un traitement ultérieur. En utilisant cette méthode, toute région du cerveau d’intérêt peut être étudiée. Une fois tachée et recouverte glissée, la densité de la colonne vertébrale dendritique est déterminée en comptant le nombre d’épines pour une longueur de dendrite et exprimée en densité de colonne vertébrale par dendrite de 10 μm.

Introduction

La méthode d’utilisation du dichromate de potassium et du nitrate d’argent pour marquer les neurones a été décrite pour la première fois par Camillo Golgi ^1,2 et ensuite utilisée par Santiago Ramon y Cajal pour produire un immense corpus de travaux différenciant les sous-types neuronaux et gliaux. Un livre récemment publié avec ses illustrations est maintenant disponible³. Suite aux études de Ramon y Cajal, qui ont été publiées il y a plus de 100 ans, très peu d’imprégnation Golgi a été utilisée. L’imprégnation de Golgi est un processus laborieux qui permet la visualisation tridimension....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales sont approuvées par le Sacred Heart University Institutional Animal Care and Use Committee et sont conformes au NIH Guide for the Care and Use of Animals.

1. Isolement et infiltration du tissu cérébral

1. Prémélanger les solutions A et B du kit de coloration Golgi 24 h avant utilisation et conserver dans des bouteilles sombres et/ou dans l’obscurité. Faire environ 80 mL de solution A et B mélange qui est suffisant pour changer la solution après 24 h. Conserver dans des bouteilles hermétiques.
   REMARQUE: La perfusion avec une solution saline ou du paraformaldéhyde n’est pas néces....

Résultats

En utilisant la méthode rapide de Golgi, les cellules sont toujours bien imprégnées de sorte qu’il y a beaucoup de cellules à analyser. Il s’agit d’une nette amélioration par rapport aux méthodes précédentes où les expériences devaient être regroupées pour disposer de suffisamment de données pour l’analyse. Par conséquent, plus d’échantillons peuvent être traités à la fois et les cerveaux peuvent être conservés congelés jusqu’au traitement. Des exemples de cellules imprégnées de Golgi d.......

Discussion

Le présent protocole décrit une méthode d’imprégnation de Golgi qui permet un traitement simultané rapide de nombreuses sections. Il s’agit d’une amélioration par rapport aux⁵ méthodes plus intensives en main-d’œuvre décrites précédemment et donne systématiquement des neurones imprégnés pour l’analyse. En outre, il y a moins d’exposition aux produits chimiques toxiques utilisés dans l’imprégnation de Golgi. La partie la plus difficile du processus consiste à faire en.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardboard slides trays	Fisher Scientific	12-587-10
Coverslips 24 x 60mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit	FD Neurotechnologies	PK 401	Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	clearing agent
NCSS Software	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65	Used to mount brains on cryostat chuck