Tinción rápida de Golgi para la visualización de la columna dendrítica en el hipocampo y la corteza prefrontal

Resumen

El protocolo describe una modificación del método rápido de Golgi, que se puede adaptar a cualquier parte del sistema nervioso, para teñir las neuronas en el hipocampo y la corteza prefrontal medial de la rata.

Resumen

La impregnación de Golgi, utilizando el kit de tinción de Golgi con adaptaciones menores, se utiliza para impregnar espinas dendríticas en el hipocampo de la rata y la corteza prefrontal medial. Esta técnica es una mejora notable con respecto a los métodos anteriores de impregnación de Golgi porque los productos químicos premezclados son más seguros de usar, las neuronas están consistentemente bien impregnadas, hay muchos menos desechos de fondo y, para una región determinada, hay desviaciones extremadamente pequeñas en la densidad de la columna vertebral entre los experimentos. Además, los cerebros se pueden acumular después de un cierto punto y mantenerse congelados hasta su posterior procesamiento. Usando este método se puede estudiar cualquier región del cerebro de interés. Una vez teñida y cubierta deslizada, la densidad de la columna dendrítica se determina contando el número de espinas para una longitud de dendrita y se expresa como densidad de la columna vertebral por dendrita de 10 μm.

Introducción

El método de uso de dicromato de potasio y nitrato de plata para etiquetar las neuronas fue descrito por primera vez por Camillo Golgi ^1,2 y posteriormente utilizado por Santiago Ramón y Cajal para producir un inmenso cuerpo de trabajo diferenciando subtipos neuronales y gliales. Un libro recientemente publicado con sus ilustraciones ya está disponible³. Siguiendo los estudios de Ramón y Cajal, que se publicaron hace más de 100 años, se utilizó muy poca impregnación de Golgi. La impregnación de Golgi es un proceso laborioso que permite la visualización tridimensional de las neuronas con un microscopio de luz. Ha habido numerosas modificaciones del método golgi a lo largo de los años para facilitar el método y la tinción más consistente⁴. En 1984, Gabbott y Somogyi⁵ describieron el procedimiento de impregnación de Golgi de sección única que permitió un procesamiento más rápido. Este método de impregnación de Golgi requiere perfusión con 4% de paraformaldehído y 1,5% de ácido pícrico, después de la fijación seguida de seccionamiento de vibratomo en un baño de dicromato de potasio al 3%. Las secciones se montan en toboganes de vidrio, las cuatro esquinas de los cubrehojas se pegan para que cuando se sumergen en nitrato de plata, la difusión sea gradual. Los cubrehojas se desprenden, las secciones se deshidratan y, finalmente, la cubierta se desliza permanentemente con el medio de montaje. Esta técnica se utilizó con éxito para etiquetar neuronas y ^{glía 6,7,8} en el hipocampo. El método rápido de Golgi descrito aquí es una mejora porque hay mucha menos exposición tanto al dicromato de potasio como al nitrato de plata y no se utilizan paraformaldehído ni ácido pícrico. Además, aunque las células que se impregnaron utilizando modificaciones del método Gabbott y Somogyi⁵ pudieron analizarse, a menudo las secciones estaban sobreexpuestas o subexpuestas o se caían de los toboganes durante la etapa de deshidratación y, en general, se tuvieron que agrupar varios experimentos para tener suficientes células para el análisis.

El presente protocolo describe el uso del kit de tinción de Golgi (ver Tabla de materiales) para etiquetar dendritas y espinas dendríticas en el hipocampo y la corteza prefrontal medial (mPFC) de la rata. Las ventajas de este método sobre los anteriores son que es rápido, hay menos exposición a sustancias químicas nocivas para el investigador y hay una tinción constante de neuronas. El protocolo descrito a continuación se ha utilizado con modificaciones menores para evaluar la densidad de la columna dendrítica en el hipocampo y mPFC de la rata en muchos estudios 9,10,11,12,13,14,15.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales están aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sagrado Corazón y están de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales.

1. Aislamiento e infiltración del tejido cerebral

1. Soluciones de premezcla A y B del kit de tinción Golgi 24 h antes de su uso y conservar en botellas oscuras y/o en oscuro. Haga aproximadamente 80 ml de mezcla de solución A y B, que es suficiente para cambiar la solución después de 24 h. Almacenar en botellas herméticas.
   NOTA: La perfusión con solución salina o paraformaldehído no es necesaria.
2. Sacrifica ratas con guillotina después de la eutanasia con dióxido de carbono y elimina los cerebros en cuestión de segundos. Enjuague los cerebros con solución salina si es necesario pero no es necesario.
   1. Coloque el cerebro, la corteza hacia abajo para que el hipotálamo sea visible porque los cortes se hacen anteriores y posteriores a él, sobre una superficie no porosa. Corte en un bloqueo anterior (contiene la corteza prefrontal) y posterior (contiene el hipocampo) como se muestra en la Figura 1.
3. Coloque los bloques en las soluciones premezcladas de A y B, asegurándose de que estén bien inmersos en la solución. Asegúrese de que el volumen de soluciones A y B sea suficiente para sumergir los bloques. Guarde los bloques en botellas marrones o botellas transparentes cubiertas con papel de aluminio (para mantener la luz apagada) en la oscuridad a temperatura ambiente.
4. Reemplace la solución después de 24 h y manténgala en la oscuridad durante otros 13 días a temperatura ambiente.
   NOTA: Si se usa con cerebros de ratón, no hay necesidad de bloquear, y todo el cerebro se puede colocar en la solución. Si se tiñen áreas cerebrales, que son diferentes en tamaño, el tiempo en las soluciones A y B puede tener que determinarse por ensayo y error.
5. Después de dos semanas, el tejido se infiltra bien con las soluciones A y B, transfiera los bloques a la solución crioprotectora (solución C en el kit de tinción Golgi) y déjelos durante 48-72 h a 4 ° C.
   NOTA: Después de la crioprotección, los bloques pueden congelarse hasta su posterior procesamiento. Además, tenga en cuenta que todas las soluciones del kit se recogen y eliminan como residuos peligrosos.
6. Congela el cerebro, la corteza hacia abajo, en un portaobjetos de vidrio sobre hielo seco. Una vez congelado, corte el criostato o guárdelo a -80 °C hasta seccionar con un criostato.
   NOTA: No congele en nitrógeno líquido ya que esto produce grietas en el tejido.

2. Seccionamiento de los tejidos cerebrales

1. Coloque una pequeña cantidad de tejido mediano en un mandril de criostato preenfriado. Monte bloques en mandriles de criostato descongelando un lado del bloque ligeramente en la mano (enguantado) y colocándolo en el medio de tejido.
   NOTA: No es necesario incrustar el tejido. El bloque que contiene el hipocampo es algo más fácil de cortar que el bloque con la corteza prefrontal porque este último es anterior al cuerpo calloso y las dos mitades están separadas.
2. Cortar secciones de 100 μm en un criostato a -22 °C y montar en portaobjetos subtitulados. Se pueden utilizar secciones de hasta 150 μm de espesor. Intente montar 3-4 secciones coronales por diapositiva, ya que esto disminuye el número de diapositivas que requieren procesamiento. Utilice una de las siguientes técnicas para mantener las secciones congeladas hasta que suban a la diapositiva.
   NOTA: Estas secciones no se fijan de la manera habitual y, por lo tanto, tienden a derretirse rápidamente. Permita que las secciones se derritan en la diapositiva. Si comienzan a derretirse antes de colocarse en el tobogán, es imposible conseguir que estén planos en el tobogán. Hay varias técnicas para hacer esto.
   1. Use un aerosol de congelación en el cuchillo y el bloque. Dependiendo de la temperatura y la humedad en la habitación, esto puede ser necesario para cada sección. Use la placa antivuelco o un cepillo para mantener la sección plana mientras corta.
      NOTA: Asegúrese de tener suficiente aerosol de congelación. Se pueden usar varias latas al cortar 20 bloques.
   2. Descongele el soporte, si es posible, mediante el uso de un tobogán a temperatura ambiente y adjúntelo rápidamente a la sección. Con la práctica, uno puede montar varias secciones a la vez. Si esto no funciona, mantenga las diapositivas en el criostato para que estén muy frías y transfiera la sección con pinzas frías o un pincel frío y luego descongele el soporte.
3. Limpie el cuchillo con toallitas de papel entre rodajas. Si el cuchillo requiere más limpieza, use etanol 100% (EtOH) y déjelo secar antes de cortar la siguiente rebanada.
4. Una vez montado en el tobogán, coloque el portaobjetos plano sobre bandejas deslizantes de cartón y deje que las secciones se sequen a temperatura ambiente (durante varias horas hasta un máximo de 48 h) en la oscuridad. No cubra la bandeja deslizante. Asegúrese de que las secciones estén completamente secas antes de la impregnación de Golgi. Conservar plano, en la oscuridad, en bandejas deslizantes hasta la impregnación de Golgi.
   NOTA: El secado de las secciones no causa ningún daño.

3. Tinción y deshidratación del tejido cerebral

1. Realizar tinción en platos de tinción de vidrio. Mezcle las soluciones D y E inmediatamente antes de la tinción. Según el protocolo, agregue una parte de la solución D, una parte de la solución E y dos partes de agua destilada. Para platos de tinción de vidrio, haga una solución de 200 ml para sumergir completamente las secciones. Para los frascos Koplin, esto requiere menos volumen.
2. Coloque las correderas en bastidores lo suficientemente separados como para permitir el acceso de la solución a las secciones.
3. Coloque las secciones en agua destilada durante 4 min (2x) antes de colocarlas en la solución de tinción por impregnación de Golgi durante 10 min. Cambie la solución de tinción cada 70 secciones. Cambie el agua destilada cuando se vuelva amarilla.
   NOTA: El momento para el paso de tinción es crítico. Demasiado corto no permite suficiente tinción y demasiado largo causa sobremanchas, lo que hace que las dendritas sean difíciles de separar al hacer análisis. Una vez fuera de la solución de tinción, el momento es menos crítico.
4. Deshidrate las secciones de la siguiente manera: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), agente de compensación (5 min; 3x). Cambie todas las soluciones con frecuencia, especialmente el EtOH 100% y el agente de compensación para garantizar que las secciones permanezcan anhidras.
   NOTA: No es necesario pasar por un paso de EtOH del 50%. La contratinción no es necesaria para la visualización celular porque la impregnación de Golgi proporciona suficiente contraste. El uso de otros agentes de compensación no ha funcionado tan bien como el utilizado aquí (ver Tabla de materiales).
5. Funda con fundas de vidrio de 60 mm de largo con una generosa cantidad de medio de montaje. Asegúrese de que haya la menor cantidad de burbujas de aire posible. Si es necesario, retire con cuidado y vuelva a hacer el deslizamiento (se puede hacer incluso semanas después). Haga esto muy lentamente para no dañar la sección (se puede hacer debido a la gran cantidad de medio de montaje).
   NOTA: Una gran cantidad de medio de montaje es algo desordenado, pero sigue siendo necesario porque se debe usar suficiente medio de montaje para cubrir las secciones gruesas de 100 μm.
6. Para asegurarse de que solo se coloque una cubierta en las secciones, separe las cubiertas antes del proceso.
7. Una vez deslizada la cubierta, se desliza en seco sobre cualquier papel no poroso durante 3-5 días, moviéndolos ligeramente, especialmente después del primer día, para evitar que se peguen. Después de 3-5 días, transfiera los portaobjetos a soportes de diapositivas e, idealmente, en seco durante al menos 3 semanas antes de examinarlos. Mantenga los toboganes planos para disminuir la posibilidad de que se formen burbujas de aire.

4. Determinación de la densidad de la columna dendrítica

1. Para el análisis de la densidad de la columna dendrítica en neuronas piramidales tanto del mPFC como de la región CA1 del hipocampo, examine las dendritas basales secundarias más laterales y las dendritas apicales terciarias más laterales como se describe en el paso 4.1.1 (Figura 2).
   1. Elija una dendrita, mida la longitud de la dendrita utilizando un programa de análisis de imágenes, cuente las espinas de las dendritas con un contador de manos y registre tanto la longitud como el número de espinas.
2. Estudiar y analizar seis células por región (mPFC, CA1) por cerebro. Cuantificar un mínimo de seis cerebros por grupo como se describió anteriormente ^7,8. Elija neuronas que cumplan con los siguientes criterios para el análisis: los cuerpos celulares y las dendritas están bien impregnados; las dendritas son distinguibles de las celdas adyacentes y son continuas.
3. Cuente las espinas a 1000x (inmersión en aceite) contando a mano con un microscopio de luz y mida la longitud dendrítica utilizando un programa de análisis de imágenes. Calcule la densidad de la columna vertebral dividiendo el número de la columna vertebral por la longitud de la dendrita y exprese los datos como el número de espinas / 10 μm de dendrita.
   NOTA: Hay métodos mucho más sofisticados para diferenciar los subtipos de columna vertebral y la arquitectura dendrítica que se pueden usar, pero contar a mano con un microscopio de luz a 1000x puede dar un resultado rápido que luego puede determinar si es necesaria una mayor investigación. Aunque se hace todo lo posible para muestrear consistentemente dendritas similares, hay variaciones en el grosor que pueden afectar el conteo.

Resultados

Usando el método rápido de Golgi, las células están consistentemente bien impregnadas para que haya muchas células para analizar. Esta es una mejora notable con respecto a los métodos anteriores en los que los experimentos tenían que agruparse para tener suficientes datos para el análisis. Por lo tanto, se pueden procesar más muestras a la vez y los cerebros se pueden almacenar congelados hasta su procesamiento. Ejemplos de células impregnadas de Golgi en la región CA1 del hipocampo se muestran a baja y alta p...

Discusión

El presente protocolo describe un método de impregnación de Golgi que permite el procesamiento simultáneo rápido de muchas secciones. Es una mejora con respecto a^{los 5} métodos más intensivos en mano de obra descritos anteriormente y produce constantemente neuronas impregnadas para su análisis. Además, hay menos exposición a productos químicos tóxicos utilizados en la impregnación de Golgi. La parte más desafiante del proceso es lograr que las secciones sean planas en las diapositivas,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardboard slides trays	Fisher Scientific	12-587-10
Coverslips 24 x 60mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit	FD Neurotechnologies	PK 401	Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	clearing agent
NCSS Software	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65	Used to mount brains on cryostat chuck