Szybkie barwienie Golgiego do wizualizacji dendrytycznego kręgosłupa w hipokampie i korze przedczołowej

Summary

Protokół opisuje modyfikację szybkiej metody Golgiego, która może być dostosowana do dowolnej części układu nerwowego, do barwienia neuronów w hipokampie i przyśrodkowej korze przedczołowej szczura.

Abstract

Impregnacja metodą Golgiego, przy użyciu zestawu do barwienia Golgiego z niewielkimi adaptacjami, służy do impregnacji kolców dendrytycznych w hipokampie szczura i przyśrodkowej korze przedczołowej. Technika ta jest wyraźnym postępem w stosunku do poprzednich metod impregnacji metodą Golgiego, ponieważ wstępnie zmieszane chemikalia są bezpieczniejsze w użyciu, neurony są konsekwentnie dobrze zapłodnione, jest znacznie mniej resztek tła, a dla danego regionu występują niezwykle małe odchylenia w gęstości kręgosłupa między eksperymentami. Co więcej, mózgi mogą być gromadzone po pewnym momencie i przechowywane w stanie zamrożonym do czasu dalszego przetwarzania. Za pomocą tej metody można badać dowolny obszar mózgu, który Cię interesuje. Po zabarwieniu i zsunięciu pokrywy gęstość kolców dendrytycznych określa się, zliczając liczbę kolców na długość dendrytu i wyrażając ją jako gęstość grzbietu na 10 μm dendrytu.

Introduction

Metoda użycia dwuchromianu potasu i azotanu srebra do oznaczania neuronów została po raz pierwszy opisana przez Camillo Golgi^1,2, a następnie wykorzystana przez Santiago Ramona y Cajala do stworzenia ogromnego dzieła różnicującego podtypy neuronów i gleju. Niedawno wydana książka z jego ilustracjami jest już dostępna³. Zgodnie z badaniami Ramona y Cajala, które zostały opublikowane ponad 100 lat temu, użyto bardzo mało impregnacji Golgiego. Impregnacja metodą Golgiego to pracochłonny proces, który pozwala na trójwymiarową wizualizację neuronów za pomocą mikroskopu świetlnego. Na przestrzeni lat dokonano licznych modyfikacji metody Golgiego, aby metoda była łatwiejsza, a barwienie bardziej spójne⁴. W 1984 roku Gabbott i Somogyi⁵ opisali jednosekcyjną procedurę impregnacji Golgiego, która pozwoliła na szybszą obróbkę. Ta metoda impregnacji Golgiego wymaga perfuzji z 4% paraformaldehydem i 1,5% kwasem pikrynowym, po utrwaleniu, a następnie podziału wibratomu do kąpieli z 3% dwuchromianem potasu. Sekcje są montowane na szkiełkach podstawowych, cztery rogi szkiełek nakrywkowych są klejone tak, aby po zanurzeniu w azotanie srebra dyfuzja była stopniowa. Szkiełka nakrywkowe są następnie odłupywane, sekcje są odwadniane, a ostatecznie pokrywane pokrywane na stałe nasuwane medium montażowym. Technika ta została z powodzeniem wykorzystana do oznaczania neuronów i gleju^6,7,8 w hipokampie. Opisana tutaj szybka metoda Golgiego jest ulepszeniem, ponieważ jest znacznie mniejsza ekspozycja zarówno na dichromian potasu, jak i azotan srebra i nie stosuje się paraformaldehydu i kwasu pikrynowego. Ponadto, mimo że można było analizować komórki, które zostały zaimpregnowane przy użyciu modyfikacji metody Gabbott i Somogyi⁵, często skrawki były prześwietlone lub niedoświetlone lub odpadały ze szkiełek podczas etapu odwodnienia i ogólnie rzecz biorąc, kilka eksperymentów musiało zostać połączonych, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do analizy.

Obecny protokół opisuje użycie zestawu do barwienia Golgiego (patrz Tabela materiałów) do oznaczania dendrytów i kolców dendrytycznych w hipokampie i przyśrodkowej korze przedczołowej (mPFC) szczura. Zaletą tej metody w porównaniu z poprzednimi jest to, że jest szybka, badacz jest mniej narażony na szkodliwe chemikalia i następuje konsekwentne barwienie neuronów. Opisany poniżej protokół został wykorzystany z niewielkimi modyfikacjami do oceny gęstości kolców dendrytycznych w hipokampie i mPFC szczura w wielu badaniach^{9,10,11,12,13,14,15}.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Wszystkie procedury eksperymentalne są zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Sacred Heart i są zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt.

1. Izolacja i infiltracja tkanki mózgowej

1. Roztwory premiksów A i B zestawu do barwienia Golgiego na 24 godziny przed użyciem i przechowywać w ciemnych butelkach i/lub w ciemności. Przygotować około 80 ml mieszaniny roztworu A i B, która jest wystarczająca do wymiany roztworu po 24 godzinach. Przechowywać w hermetycznych butelkach.
   UWAGA: Perfuzja z solą fizjologiczną lub paraformaldehydem nie jest konieczna.
2. Składaj szczury w ofierze za pomocą gilotyny po eutanazji dwutlenkiem węgla i usuwaj mózgi w ciągu kilku sekund. W razie potrzeby opłucz mózgi w soli fizjologicznej, ale nie jest to konieczne.
   1. Umieść mózg, korę w dół, tak aby podwzgórze było widoczne, ponieważ nacięcia są wykonane z przodu i z tyłu, na nieporowatej powierzchni. Pokrój na przedni (zawiera korę przedczołową) i tylną (zawiera hipokamp), jak pokazano na Rysunek 1.
3. Umieść bloki we wstępnie zmieszanych roztworach A i B, upewniając się, że są dobrze zanurzone w roztworze. Upewnij się, że objętość roztworów A i B jest wystarczająca do zanurzenia bloków. Przechowuj bloki w brązowych butelkach lub przezroczystych butelkach przykrytych folią (aby nie przepuszczać światła) w ciemności w temperaturze pokojowej.
4. Roztwór należy wymienić po 24 godzinach i przechowywać w ciemności przez kolejne 13 dni w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: W przypadku stosowania z mózgami myszy nie ma potrzeby blokowania, a cały mózg można umieścić w roztworze. W przypadku barwienia obszarów mózgu, które różnią się wielkością, może być konieczne określenie czasu w roztworach A i B metodą prób i błędów.
5. Po dwóch tygodniach tkanka jest dobrze naciekana roztworami A i B, przenieść bloki do roztworu krioprotektantu (roztwór C w zestawie do barwienia Golgiego) i pozostawić na 48-72 godziny w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Po krioprotekcji bloki można zamrozić do czasu dalszej obróbki. Należy również pamiętać, że wszystkie roztwory z zestawu są zbierane i utylizowane jako odpady niebezpieczne.
6. Zamroź mózg, korą mózgową w dół, na szklanym szkiełku na suchym lodzie. Po zamrożeniu pokroić na kriostacie lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu podziału na sekcje za pomocą kriostatu.
   UWAGA: Nie zamrażaj w ciekłym azocie, ponieważ powoduje to pęknięcia tkanki.

2. Cięcie tkanek mózgowych

1. Umieść niewielką ilość podłoża tkankowego na wstępnie schłodzonym uchwycie kriostatu. Zamontuj bloki na uchwytach kriostatowych, rozmrażając jedną stronę bloku lekko w dłoni (w rękawiczce) i umieszczając go na podłożu tkankowym.
   UWAGA: Nie jest konieczne osadzanie tkanki. Blok zawierający hipokamp jest nieco łatwiejszy do przecięcia niż blok z korą przedczołową, ponieważ ten ostatni jest przed ciałem modzelowatym, a dwie połówki są oddzielone.
2. Wyciąć odcinki 100 μm na kriostacie w temperaturze -22 °C i zamontować na prowadnicach z łożem. Można stosować sekcje o grubości do 150 μm. Spróbuj zamontować 3-4 sekcje koronalne na slajd, ponieważ zmniejsza to liczbę slajdów wymagających obróbki. Użyj jednej z poniższych technik, aby utrzymać sekcje zamrożone, dopóki nie znajdą się na zjeżdżalni.
   UWAGA: Te sekcje nie są mocowane w zwykły sposób i dlatego mają tendencję do szybkiego topnienia. Poczekaj, aż sekcje stopią się na szkiełku. Jeśli zaczną się topić przed umieszczeniem na szkiełku, nie można ich ustawić płasko na szkiełku. Można to zrobić za pomocą kilku technik.
   1. Użyj sprayu zamrażającego na nóż i blok. W zależności od temperatury i wilgotności w pomieszczeniu może to być konieczne dla każdej sekcji. Użyj płytki zabezpieczającej lub szczotki, aby utrzymać sekcję płasko podczas cięcia.
      UWAGA: Upewnij się, że masz wystarczającą ilość sprayu zamrażającego. Podczas cięcia 20 bloków można użyć kilku puszek.
   2. Rozmrozić moc, jeśli to możliwe, za pomocą suwaka o temperaturze pokojowej i szybko przymocuj go do sekcji. Przy nabraniu wprawy można zamontować kilka sekcji jednocześnie. Jeśli to nie zadziała, trzymaj szkiełka w kriostacie, aby były bardzo zimne i przenieś sekcję za pomocą zimnych kleszczy lub zimnego pędzla, a następnie rozmroź.
3. Wyczyść nóż papierowymi chusteczkami między plasterkami. Jeśli nóż wymaga więcej czyszczenia, użyj 100% etanolu (EtOH) i pozostaw do wyschnięcia przed pokrojeniem następnego plasterka.
4. Po zamontowaniu na szkiełku umieść szkiełko płasko na tekturowych tackach do slajdów i pozostaw sekcje do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (przez kilka godzin do maksymalnie 48 godzin) w ciemności. Nie zakrywaj tacki na prowadnice. Upewnij się, że sekcje są całkowicie suche przed impregnacją Golgiego. Przechowywać na płasko, w ciemności, na tackach na suwaki do momentu impregnacji metodą Golgiego.
   UWAGA: Suszenie sekcji nie powoduje żadnych uszkodzeń.

3. Barwienie i odwodnienie tkanki mózgowej

1. Wykonaj barwienie w szklanych naczyniach do barwienia. Wymieszać roztwory D i E bezpośrednio przed barwieniem. Zgodnie z protokołem dodaj jedną część roztworu D, jedną część roztworu E i dwie części wody destylowanej. W przypadku naczyń do barwienia szkła przygotuj 200 ml roztworu, aby całkowicie zanurzyć sekcje. W przypadku słoików z kopeliny wymaga to mniejszej objętości.
2. Umieść szkiełka w stojakach oddalonych od siebie na tyle daleko, aby umożliwić dostęp do sekcji rozwiązania.
3. Umieść skrawki w wodzie destylowanej na 4 minuty (2x) przed umieszczeniem ich w roztworze barwiącym do impregnacji Golgiego na 10 minut. Zmieniaj roztwór barwiący co 70 sekcji. Zmień wodę destylowaną, gdy zmieni kolor na żółty.
   UWAGA: Czas etapu barwienia ma kluczowe znaczenie. Zbyt krótki nie pozwala na wystarczające barwienie, a zbyt długi powoduje nadmierne barwienie, co utrudnia oddzielenie dendrytów podczas przeprowadzania analizy. Po wyjęciu z roztworu barwiącego czas jest mniej krytyczny.
4. Odwodnić skrawki w następujący sposób: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), środek czyszczący (5 min; 3x). Często zmieniaj wszystkie roztwory, zwłaszcza 100% EtOH i środek czyszczący, aby zapewnić, że sekcje pozostaną bezwodne.
   UWAGA: Nie jest konieczne przechodzenie przez etap 50% EtOH. Barwienie przeciwstawne nie jest potrzebne do wizualizacji komórek, ponieważ impregnacja Golgiego zapewnia wystarczający kontrast. Stosowanie innych środków czyszczących nie zadziałało tak dobrze, jak ten zastosowany tutaj (patrz tabela materiałów).
5. Szkiełko nakrywkowe ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi o długości 60 mm z dużą ilością środka montażowego. Upewnij się, że jest jak najmniej pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby ostrożnie usuń i ponownie wykonaj szkiełko nakrywkowe (można to zrobić nawet kilka tygodni później). Rób to bardzo powoli, aby nie uszkodzić sekcji (można to zrobić ze względu na dużą ilość medium montażowego).
   UWAGA: Duża ilość medium montażowego jest nieco kłopotliwa, ale nadal konieczna, ponieważ do pokrycia grubych odcinków 100 μm należy użyć wystarczającej ilości medium montażowego.
6. Aby upewnić się, że na sekcjach umieszczono tylko jedno szkiełko nakrywkowe, należy je oddzielić przed rozpoczęciem procesu.
7. Po zsunięciu się okładki suche ślizga się płasko na dowolnym nieporowatym papierze przez 3-5 dni, lekko je przesuwając, zwłaszcza po pierwszym dniu, aby uniknąć przywierania. Po 3-5 dniach przenieś szkiełka do uchwytów na szkiełka i najlepiej wysusz je przez co najmniej 3 tygodnie przed ich zbadaniem. Utrzymuj szkiełka płasko, aby zmniejszyć możliwość tworzenia się pęcherzyków powietrza.

4. Wyznaczanie gęstości kolców dendrytycznych

1. W celu analizy gęstości kolców dendrytycznych w neuronach piramidowych zarówno regionu mPFC, jak i CA1 hipokampa, należy zbadać najbardziej boczne drugorzędowe dendryty podstawne i najbardziej boczne dendryty wierzchołkowe trzeciorzędowe, jak opisano w kroku 4.1.1 (Rysunek 2).
   1. Wybierz dendryt, zmierz długość dendrytu za pomocą programu do analizy obrazu, policz kolce dendrytów za pomocą licznika ręcznego i zapisz zarówno długość, jak i liczbę kolców.
2. Badaj i analizuj sześć komórek na region (mPFC, CA1) na mózg. Określ ilościowo co najmniej sześć mózgów na grupę, jak opisano wcześniej^7,8. Wybierz neurony, które spełniają następujące kryteria analizy: ciała komórkowe i dendryty są dobrze zaimpregnowane; Dendryty można odróżnić od sąsiednich komórek i są ciągłe.
3. Policz kolce z prędkością 1000x (zanurzenie w oleju), licząc ręcznie za pomocą mikroskopu świetlnego i zmierz długość dendrytyczną za pomocą programu do analizy obrazu. Oblicz gęstość grzbietu, dzieląc liczbę grzbietów przez długość dendrytu i wyraź dane jako liczbę kolców/ dendryt 10 μm.
   UWAGA: Istnieją znacznie bardziej wyrafinowane metody różnicowania podtypów kręgosłupa i architektury dendrytycznej, które można zastosować, ale liczenie ręczne za pomocą mikroskopu świetlnego z prędkością 1000x może dać szybki wynik, który może następnie określić, czy konieczne są dalsze badania. Chociaż dokłada się wszelkich starań, aby konsekwentnie pobierać próbki podobnych dendrytów, istnieją różnice w grubości, które mogą mieć wpływ na liczenie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Korzystając z szybkiej metody Golgiego, komórki są konsekwentnie dobrze impregnowane, tak że jest ich mnóstwo do analizy. Jest to wyraźna poprawa w porównaniu z wcześniejszymi metodami, w których eksperymenty musiały być łączone, aby uzyskać wystarczającą ilość danych do analizy. Dzięki temu można przetwarzać więcej próbek jednocześnie, a mózgi mogą być przechowywane w stanie zamrożonym do czasu przetworzenia. Przykłady komórek zaimpregnowanych metodą Golgiego w regionie CA1 hipokampa są p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Niniejszy protokół opisuje metodę impregnacji metodą Golgiego, która pozwala na szybką jednoczesną obróbkę wielu skrawków. Jest to ulepszenie w stosunku do wcześniej opisanych⁵ bardziej pracochłonnych metod i konsekwentnie daje zapłodnione neurony do analizy. Ponadto istnieje mniejsze narażenie na toksyczne chemikalia stosowane w impregnacji Golgiego. Najtrudniejszą częścią procesu jest ustawienie sekcji płasko na zjeżdżalniach, co wymaga sporej praktyki. Niezbędne jest utrzy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tacki na szkiełka kartonowe	Fisher Scientific	12-587-10
Szkiełka nakrywkowe 24 x 60 mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Zestaw Rapid GolgiStain	FD Neurotechnologies	PK 401	Stabilny w RT w ciemności przez miesiące; Zestaw do barwienia Golgiego
Spray do zamrażania	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	środek czyszczący
NCSS Software	Kaysville, UT, Stany Zjednoczone
Podłoże montażowe	Permount	Fisher Scientific	SP-15-100
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus Fisher	Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65	Służy do montażu mózgów na uchwycie kriostatowym