Hipokampus ve Prefrontal Kortekste Dendritik Omurga Görselleştirme için Hızlı Golgi Lekesi

Özet

Protokol, hipokampustaki nöronları ve sıçanın medial prefrontal korteksi boyamak için sinir sisteminin herhangi bir bölümüne uyarlanabilen hızlı Golgi yönteminin bir modifikasyonunu açıklar.

Özet

Golgi emprenyesi, küçük adaptasyonlarla Golgi boyama kitini kullanarak, sıçan hipokampüsü ve medial prefrontal korteksteki dendritik dikenleri emprenye etmek için kullanılır. Bu teknik, önceki Golgi emprenye yöntemlerine göre belirgin bir gelişmedir, çünkü önceden karıştırılmış kimyasalların kullanımı daha güvenlidir, nöronlar sürekli olarak iyi emprenye edilir, çok daha az arka plan enkazı vardır ve belirli bir bölge için, deneyler arasında omurga yoğunluğunda son derece küçük sapmalar vardır. Dahası, beyinler belirli bir noktadan sonra biriktirilebilir ve bir sonraki işleme kadar dondurulmuş halde tutulabilir. Bu yöntemi kullanarak, ilgilenilen herhangi bir beyin bölgesi incelenebilir. Lekelendikten ve örtü kaydıktan sonra, dendritik omurga yoğunluğu, bir dendrit uzunluğu için diken sayısının sayılmasıyla belirlenir ve 10 μm dendrit başına omurga yoğunluğu olarak ifade edilir.

Giriş

Nöronları etiketlemek için potasyum dikromat ve gümüş nitrat kullanma yöntemi ilk olarak Camillo Golgi ^1,2 tarafından tanımlanmış ve daha sonra Santiago Ramon y Cajal tarafından nöronal ve glial alt tipleri farklılaştıran muazzam bir çalışma gövdesi üretmek için kullanılmıştır. İllüstrasyonlarıyla yakın zamanda yayınlanmış bir kitap şimdi mevcuttur³. Ramon y Cajal'ın 100 yıldan daha uzun bir süre önce yayınlanan çalışmalarını takiben, çok az Golgi emprenye kullanıldı. Golgi emprenyesi, nöronların ışık mikroskobu ile üç boyutlu olarak görselleştirilmesini sağlayan zahmetli bir süreçtir. Yöntemi daha kolay ve boyama işlemini daha tutarlı hale getirmek için yıllar içinde Golgi yönteminde çok sayıda değişiklik^{yapılmıştır 4}. 1984 yılında Gabbott ve Somogyi⁵, daha hızlı işlemeye izin veren tek bölümlü Golgi emprenye prosedürünü tanımladı. Bu Golgi emprenye yöntemi,% 4 paraformaldehit ve% 1.5 pikrik asit ile perfüzyon, fiksasyon sonrası,% 3 potasyum dikromat banyosuna vibratom kesiti gerektirir. Bölümler cam slaytlara monte edilir, kapakların dört köşesi yapıştırılır, böylece gümüş nitrata daldırıldığında difüzyon kademeli olur. Kapaklar daha sonra atılır, bölümler kurutulur ve sonunda kapak montaj ortamı ile kalıcı olarak kaydırılır. Bu teknik, hipokampustaki nöronları ve glia ^6,7,8'i etiketlemek için başarıyla kullanıldı. Burada açıklanan hızlı Golgi yöntemi bir gelişmedir, çünkü hem potasyum dikromat hem de gümüş nitrata çok daha az maruz kalınır ve paraformaldehit ve pikrik asit kullanılmaz. Ek olarak, Gabbott ve Somogyi⁵ yönteminin modifikasyonları kullanılarak emprenye edilen hücreler analiz edilebilse de, çoğu zaman bölümler dehidrasyon adımı sırasında slaytlardan aşırı veya az maruz kaldı veya düştü ve genel olarak, analiz için yeterli hücreye sahip olmak için birkaç deneyin bir araya getirilmesi gerekiyordu.

Mevcut protokol, hipokampustaki dendritleri ve dendritik dikenleri etiketlemek için Golgi boyama kitinin (bkz. malzeme tablosu) ve sıçanın medial prefrontal korteksinin (mPFC) kullanımını açıklamaktadır. Bu yöntemin öncekilere göre avantajları, hızlı olması, araştırmacı için zararlı kimyasallara daha az maruz kalması ve nöronların tutarlı bir şekilde boyanmasıdır. Aşağıda açıklanan protokol, 9,10,11,12,13,14,15 sayılı çalışmada sıçanın hipokampüsündeki ve mPFC'sindeki dendritik omurga yoğunluğunu değerlendirmek için küçük modifikasyonlarla kullanılmıştır.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler Sacred Heart Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır ve NIH Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygundur.

1. Beyin dokusunun izolasyonu ve infiltrasyonu

1. Golgi boyama kitinin A ve B ön karışım çözeltilerini kullanmadan 24 saat önce koyu renkli şişelerde ve/veya karanlıkta saklayın. 24 saat sonra çözeltiyi değiştirmek için yeterli olan yaklaşık 80 mL çözelti A ve B karışımı yapın. Hava geçirmez şişelerde saklayın.
   NOT: Salin veya paraformaldehit ile perfüzyon gerekli değildir.
2. Sıçanları karbondioksit ötenazisini takiben giyotin ile kurban edin ve saniyeler içinde beyinleri çıkarın. Gerekirse beyinleri tuzlu suda durulayın, ancak gerekli değildir.
   1. Beyni, korteksi hipotalamusun görünür olması için aşağı yerleştirin, çünkü kesikler gözeneksiz bir yüzeyde ön ve arka kısımda yapılır. Şekil 1'de gösterildiği gibi bir anterior (prefrontal korteks içerir) ve posterior (hipokampus içerir) bloğuna bölünür.
3. Blokları A ve B'nin önceden karıştırılmış çözeltilerine yerleştirin ve çözeltiye iyice daldırıldıklarından emin olun. A ve B çözeltilerinin hacminin blokları batırmak için yeterli olduğundan emin olun. Blokları kahverengi şişelerde veya folyo kaplı şeffaf şişelerde (ışığı dışarıda tutmak için) oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
4. Çözeltiyi 24 saat sonra değiştirin ve oda sıcaklığında 13 gün daha karanlıkta tutun.
   NOT: Fare beyinleriyle birlikte kullanılırsa, bloke etmeye gerek yoktur ve tüm beyin çözeltiye yerleştirilebilir. Büyüklükleri farklı olan beyin bölgelerinin boyanması durumunda, A ve B çözeltilerindeki sürenin deneme yanılma ile belirlenmesi gerekebilir.
5. İki hafta sonra doku, A ve B çözeltileri ile iyice infiltre edilir, blokları kriyoprotektan çözeltiye (Golgi boyama kitindeki C çözeltisi) aktarın ve 4 ° C'de 48-72 saat bekletin.
   NOT: Kriyoproteksiyondan sonra, bloklar bir sonraki işleme kadar dondurulabilir. Ayrıca, kitten gelen tüm çözeltilerin toplandığını ve tehlikeli atık olarak bertaraf edildiğini unutmayın.
6. Beyni dondurun, korteksi aşağı indirin, kuru buz üzerinde bir cam slayt üzerinde. Dondurulduktan sonra kriyostatı kesin veya bir kriyostat kullanarak kesitleyene kadar -80 ° C'de saklayın.
   NOT: Sıvı azotta dondurmayın, çünkü bu dokuda çatlaklara neden olur.

2. Beyin dokularının bölümlenmesi

1. Önceden soğutulmuş bir kriyostat mandren üzerine az miktarda doku ortamı yerleştirin. Bloğun bir tarafını hafifçe elde çözerek (eldivenli) ve doku ortamına yerleştirerek kriyostatat kıkırdamaları üzerine bloklar monte edin.
   NOT: Dokunun gömülmesi gerekli değildir. Hipokampüsü içeren bloğun kesilmesi, prefrontal korteksli bloktan biraz daha kolaydır, çünkü ikincisi korpus kallozumun önündedir ve iki yarısı ayrıdır.
2. Bir kriyostat üzerinde -22 °C'de 100 μm kesitler kesin ve alt yatak kızaklarına monte edin. 150 μm kalınlığa kadar olan bölümler kullanılabilir. Slayt başına 3-4 koronal bölüm monte etmeye çalışın, çünkü bu, işlenmesi gereken slaytların sayısını azaltır. Bölümleri slayta girene kadar donmuş halde tutmak için aşağıdaki tekniklerden birini kullanın.
   NOT: Bu bölümler her zamanki gibi sabitlenmemiştir ve bu nedenle hızlı bir şekilde erime eğilimindedirler. Bölümlerin slaytta erimesine izin verin. Slayta yerleştirilmeden önce erimeye başlarlarsa, slaytta düz olmalarını sağlamak mümkün değildir. Bunu yapmak için birkaç teknik vardır.
   1. Bıçağın ve bloğun üzerine dondurucu bir sprey kullanın. Odadaki sıcaklığa ve neme bağlı olarak, bu her bölüm için gerekli olabilir. Kesim sırasında bölümü düz tutmak için antiroll plaka veya fırça kullanın.
      NOT: Yeterli dondurucu sprey bulunduğundan emin olun. 20 blok kesilirken birkaç kutu kullanılabilir.
   2. Mümkünse, oda sıcaklığında bir slayt kullanarak dikin ve hızlı bir şekilde bölüme yerleştirin. Uygulamayla, aynı anda birkaç bölüm monte edilebilir. Bu işe yaramazsa, slaytları kriyostatta tutun, böylece çok soğuk olurlar ve bölümü soğuk forseps veya soğuk bir boya fırçası ile aktarın ve ardından montajı çözün.
3. Bıçağı dilimler arasında kağıt mendillerle temizleyin. Bıçak daha fazla temizlik gerektiriyorsa,% 100 etanol (EtOH) kullanın ve bir sonraki dilimi kesmeden önce kurumasını bekleyin.
4. Slayta monte edildikten sonra, slaytı düz bir şekilde karton slayt tepsilerine yerleştirin ve bölümlerin karanlıkta oda sıcaklığında (birkaç saat ila maksimum 48 saat) kurumasını bekleyin. Slayt tepsisini kapatmayın. Golgi emprenye işleminden önce bölümlerin tamamen kuru olduğundan emin olun. Karanlıkta, Golgi emprenye edene kadar düz bir şekilde slayt tepsilerinde saklayın.
   NOT: Bölümlerin kurutulması herhangi bir hasara neden olmaz.

3. Beyin dokusunun boyanması ve dehidrasyonu

1. Cam boyama tabaklarında boyama yapın. D ve E çözeltilerini boyamadan hemen önce karıştırın. Protokole göre, D çözeltisinin bir parçasını, E çözeltisinin bir kısmını ve iki parça damıtılmış suyu ekleyin. Cam vitray tabaklar için, bölümleri tamamen suya batırmak için 200 mL'lik bir çözelti yapın. Koplin kavanozları için bu daha az hacim gerektirir.
2. Slaytları, çözümlerin bölümlere erişmesine izin verecek kadar uzağa yerleştirilmiş raflara yerleştirin.
3. Bölümleri 10 dakika boyunca Golgi emprenye boyama çözeltisine yerleştirmeden önce 4 dakika (2x) damıtılmış suya yerleştirin. Boyama solüsyonunu her 70 bölümde bir değiştirin. Damıtılmış suyu sarardığında değiştirin.
   NOT: Boyama adımının zamanlaması kritiktir. Çok kısa boyama yeterli boyamaya izin vermez ve çok uzun boyama nedenleri, analiz yaparken dendritlerin ayrılmasını zorlaştırır. Boyama çözeltisinden çıktıktan sonra zamanlama daha az kritiktir.
4. Bölümleri aşağıdaki gibi kurutun:% 70 EtOH (5 dakika),% 95 EtOH (5 dakika; 2x),% 100 EtOH (5 dakika; 2x), temizleme maddesi (5 dakika; 3x). Bölümlerin susuz kalmasını sağlamak için tüm çözeltileri, özellikle %100 EtOH ve temizleme maddesini sık sık değiştirin.
   NOT: %50 EtOH adımından geçmek gerekli değildir. Hücre görselleştirmesi için karşı boyama gerekli değildir, çünkü Golgi emprenyesi yeterli kontrast sağlar. Diğer takas ajanlarının kullanımı, burada kullanılanlar kadar işe yaramadı (bkz.
5. Bol miktarda montaj ortamına sahip 60 mm uzunluğunda cam kapaklı kapaklar. Mümkün olduğunca az hava kabarcığı olduğundan emin olun. Gerekirse, kapak fişini dikkatlice çıkarın ve tekrarlayın (haftalar sonra bile yapılabilir). Bölüme zarar vermemek için bunu çok yavaş yapın (çok miktarda montaj ortamı nedeniyle yapılabilir).
   NOT: Büyük miktarda montaj ortamı biraz dağınıktır, ancak yine de gereklidir, çünkü kalın 100 μm kesitleri örtmek için yeterli montaj ortamı kullanılmalıdır.
6. Bölümlere yalnızca bir kapak fişi yerleştirildiğinden emin olmak için, işlemden önce kapak fişlerini ayırın.
7. Kapak kaydıktan sonra, kuru slaytlar gözeneksiz herhangi bir kağıda 3-5 gün boyunca düz bir şekilde kayar ve yapışmayı önlemek için özellikle ilk günden sonra hafifçe hareket ettirir. 3-5 gün sonra slaytları slayt tutuculara aktarın ve ideal olarak slaytları incelemeden önce en az 3 hafta kuru bırakın. Hava kabarcıkları oluşma olasılığını azaltmak için slaytları düz tutun.

4. Dendritik omurga yoğunluğunun belirlenmesi

1. Hipokampusun hem mPFC hem de CA1 bölgesinin piramidal nöronlarındaki dendritik omurga yoğunluğunun analizi için, adım 4.1.1'de açıklandığı gibi en lateral sekonder bazal dendritleri ve en lateral üçüncül apikal dendritleri inceleyin (Şekil 2).
   1. Bir dendrit seçin, bir görüntü analiz programı kullanarak dendritin uzunluğunu ölçün, bir el sayacı kullanarak dendritlerdeki dikenleri sayın ve dikenlerin hem uzunluğunu hem de sayısını kaydedin.
2. Beyin başına bölge başına altı hücreyi (mPFC, CA1) inceleyin ve analiz edin. Daha önce tarif edildiği gibi grup başına en az altı beyni sayısallaştırın ^7,8. Analiz için aşağıdaki kriterleri karşılayan nöronları seçin: hücre gövdeleri ve dendritler iyi emprenye edilir; Dendritler bitişik hücrelerden ayırt edilebilir ve süreklidir.
3. Işık mikroskobu ile elle sayarak dikenleri 1000x'te (yağ daldırma) sayın ve bir görüntü analiz programı kullanarak dendritik uzunluğu ölçün. Omurga sayısını dendritin uzunluğuna bölerek omurga yoğunluğunu hesaplayın ve verileri diken sayısı / 10 μm dendrit olarak ifade edin.
   NOT: Omurga alt tiplerini ve dendritik mimariyi ayırt etmek için kullanılabilecek çok daha karmaşık yöntemler vardır, ancak 1000x'te bir ışık mikroskobu ile elle sayma, daha sonra daha fazla araştırmanın gerekli olup olmadığını belirleyebilecek hızlı bir sonuç verebilir. Benzer dendritleri tutarlı bir şekilde örneklemek için her türlü çaba gösterilmesine rağmen, sayımı etkileyebilecek kalınlıkta farklılıklar vardır.

Sonuçlar

Hızlı Golgi yöntemini kullanarak, hücreler sürekli olarak iyi emprenye edilir, böylece analiz edilecek çok sayıda hücre vardır. Bu, deneylerin analiz için yeterli veriye sahip olması için bir araya getirilmesi gereken önceki yöntemlere göre belirgin bir gelişmedir. Bu nedenle, aynı anda daha fazla örnek işlenebilir ve beyinler işlenene kadar dondurulmuş olarak saklanabilir. Hipokampusun CA1 bölgesindeki Golgi emprenye edilmiş hücrelerin örnekleri Şekil 3'te düşü...

Tartışmalar

Mevcut protokol, birçok bölümün hızlı bir şekilde eşzamanlı olarak işlenmesini sağlayan bir Golgi emprenye yöntemini açıklamaktadır. Daha önce tarif edilen⁵ daha fazla emek yoğun yönteme göre bir gelişmedir ve analiz için sürekli olarak emprenye edilmiş nöronlar verir. Ek olarak, Golgi emprenyesinde kullanılan toksik kimyasallara daha az maruz kalınır. Sürecin en zorlu kısmı, bölümlerin slaytlarda düz olmasını sağlamaktır, bu da önemli bir uygulama gerektirir....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardboard slides trays	Fisher Scientific	12-587-10
Coverslips 24 x 60mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit	FD Neurotechnologies	PK 401	Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	clearing agent
NCSS Software	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65	Used to mount brains on cryostat chuck