JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نصف عزل وتضخيم وتمايز الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية (HNE) في واجهة الهواء السائل وبروتوكول البنوك الحيوية الذي يسمح بتجميد ومن ثم إذابة HNE المضخمة بنجاح. يحلل البروتوكول الخصائص الكهروفسيولوجية لخلايا HNE المتباينة وتصحيح إفراز الكلوريد المرتبط ب CFTR على علاجات معدلة مختلفة.

Abstract

من السهل جمع الخلايا الظهارية الأنفية البشرية (HNE) عن طريق تنظيف الأنف بالفرشاة البسيطة وغير الغازية. يمكن تضخيم خلايا HNE الأولية المشتقة من المريض وتمييزها إلى ظهارة طبقية زائفة في ظروف الواجهة الهوائية السائلة لتحديد كمية نقل الكلوريد الدوري بوساطة AMP (Cl-) كمؤشر لوظيفة منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR). إذا تم تنفيذ الخطوات الحاسمة مثل جودة تنظيف الأنف بالفرشاة وكثافة الخلايا عند الحفظ بالتبريد بكفاءة ، فيمكن إجراء خلايا HNE بنجاح في البنوك الحيوية. علاوة على ذلك، تظهر دراسات تيار الدائرة القصيرة أن ذوبان الجليد لا يعدل بشكل كبير الخصائص الكهروفسيولوجية لخلايا HNE واستجابتها لمعدلات CFTR. في ظروف الثقافة المستخدمة في هذه الدراسة ، عندما يتم تجميد أقل من 2 × 106 خلايا لكل تبريد ، يكون معدل الفشل مرتفعا جدا. نوصي بتجميد ما لا يقل عن 3 × 106 خلايا لكل تبريد. لقد أظهرنا أن العلاجات المزدوجة التي تجمع بين مصحح CFTR و CFTR المقوي لها فعالية تصحيح مماثلة لنشاط CFTR في خلايا HNE F508del-homozygous. العلاج الثلاثي VX-445 + VX-661 + VX-770 زاد بشكل كبير من تصحيح نشاط CFTR مقارنة بالعلاج المزدوج VX-809 + VX-770. يعد مقياس نشاط CFTR في خلايا HNE مؤشرا حيويا واعدا قبل السريرية مفيدا لتوجيه العلاج بمغير CFTR.

Introduction

التليف الكيسي (CF) هو اضطراب صبغي جسدي متنحي ناتج عن طفرات في جين منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR) مما يؤدي إلى غياب أو خلل وظيفي في بروتين CFTR ، وهي قناة أنيون تقع على السطح القمي للظهارة 1,2. أدت التطورات الحديثة في علاج CFTR إلى تحسين تشخيص المرض ، وأدت آخر الأدوية المعتمدة التي تجمع بين مصححات CFTR ومحفزات CFTR إلى تحسينات كبيرة في وظائف الرئة ونوعية الحياة لمرضى CF الذين يحملون الطفرة الأكثر شيوعا p.Phe508del طفرة (F508del)3,4. على الرغم من هذا التقدم العلاجي الواعد ، فإن حوالي 10٪ من مرضى التليف الكيسي غير مؤهلين لأنهم يحملون طفرات لا يمكن إنقاذها بواسطة معدلات CFTR هذه. بالنسبة لهؤلاء المرضى ، هناك حاجة لاختبار أدوية أخرى أو مجموعات أدوية للعثور على التركيبة الأكثر كفاءة لطفرات محددة ، مما يسلط الضوء على أهمية العلاجات الشخصية.

من السهل جمع الخلايا الظهارية الأنفية البشرية (HNE) عن طريق تنظيف الأنف بالفرشاة البسيطة وغير الغازية وتسمح بتحديد كمية انتقال الكلوريد الدوري بوساطة AMP (Cl−) كمؤشر لوظيفة CFTR. تنتج خلايا HNE نموذجا دقيقا للمجرى الهوائي البشري ، لكن عمرها محدود في الثقافة. بفضل تحسين تقنيات الاستزراع، يمكن إعادة برمجة خلايا HNE الأولية المشتقة من المريض بشكل مشروط باستخدام مثبط كيناز المرتبط ب Rho (ROCKi)، وتضخيمها، وتمييزها إلى ظهارة طبقية زائفة في ظروف الواجهة البينية السائلة الهوائية (ALI) على المرشحات المسامية الدقيقة 5,6. توجد العديد من بروتوكولات الاستزراع لزراعة HNE (متاحة تجاريا ، خالية من المصل ، "محلية الصنع" ، زراعة مشتركة مع الخلايا المغذية ، وما إلى ذلك) ، وقد تم وصف اختيار الوسائط وظروف الثقافة للتأثير على النمو ، وتمايز عدد الخلايا والوظيفة الظهارية 7,8. يقدم البروتوكول هنا طريقة تضخيم ROCKi مبسطة وخالية من وحدة التغذية تسمح بالحصول بنجاح على عدد كبير من خلايا HNE التي يتم تمييزها بعد ذلك في ALI لفحوصات وظيفة CFTR.

لقد أثبتنا أنه في خلايا HNE المتباينة ، يكفي العلاج لمدة 48 ساعة باستخدام معدلات CFTR للحث على التصحيح الكهروفسيولوجي لتيار Cl- الحالي المعتمد على CFTR وأن التصحيح الذي لوحظ في المختبر قد يكون مرتبطا بالتحسن السريري للمريض9. وبالتالي ، تمثل خلايا HNE نموذجا مناسبا ليس فقط لأبحاث CF الأساسية ولكن للدراسات قبل السريرية مع اختبار معدل CFTR الخاص بالمريض. في هذا السياق من العلاج الشخصي ، كان الهدف من البروتوكول هو التحقق من أن خلايا HNE المحفوظة بالتجميد من مرضى التليف الكيسي ، والتي نمت في ظروفنا ، كانت نموذجا مناسبا لدراسات تصحيح CFTR ، ويمكن توقع نتائج مماثلة عند مقارنة نقل Cl المعتمد على CFTR من الخلايا الطازجة والمجمدة المذابة. كما قيمت الدراسة فعالية مختلف معدلات CFTR عند استخدام العلاجات المزدوجة والثلاثية.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الموضحة في إعلان هلسنكي وقانون هوريت-سيروسكلات بشأن أخلاقيات البحوث البشرية.

1. إعداد القوارير والوسائط المختلفة

  1. قم بإعداد التضخيم والهواء السائل ووسط التجميد كما هو موضح في الجدول 1.
  2. تحضير محلول مخزون من الكولاجين البشري الرابع عن طريق إذابة 50 ملغ من الكولاجين في 100 مل من 0.2 ٪ من حمض الخليك الجليدي. اخلطي على مقلب مغناطيسي لمدة 1 ساعة على الأقل ، وقم بتصفية تعقيم المحلول. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر في زجاجة زجاجية محمية من الضوء.
  3. قم بإعداد محلول عملي من الكولاجين IV عن طريق تخفيف محلول المخزون 1: 5 في الماء المقطر المزدوج. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. قم بتغطية قوارير زراعة الخلايا البلاستيكية أو مرشحات transwell باستخدام محلول عمل الكولاجين. توزيع بالتساوي 100 ميكرولتر ل 0.33 سم 2 مرشحات transwell ، 500 ميكرولتر ل 25 سم 2 قوارير ، و 1 مل ل 75 سم2 قوارير على كامل سطح النمو من قارورة.
    ملاحظة: يمكن تحقيق ذلك عن طريق إمالة القارورة بلطف من جانب إلى آخر. بدلا من ذلك ، لتسهيل طلاء القوارير ، يمكن استخدام حجم متزايد ، وعندما يتم تغطية السطح بأكمله بالتساوي ، يتم شفط محلول الكولاجين لترك الحجم المشار إليه فقط. يمكن بعد ذلك استخدام محلول الكولاجين المستنشق على الفور لتغطية القارورة التالية (أي لثلاث قوارير 75 سم 2 ، قم بتوزيع 3 مل من محلول الكولاجين بالتساوي في القارورة الأولى ، وشفط2 مل ، والتي يتم استخدامها بعد ذلك للقارورة التالية ، وما إلى ذلك).
  5. اترك قوارير زراعة الخلايا في الحاضنة لمدة لا تقل عن 2 ساعة أو بين عشية وضحاها. استنشق الكولاجين جيدا واترك القوارير لتجف في الحاضنة أو تحت غطاء المحرك لمدة لا تقل عن 20 دقيقة أو بين عشية وضحاها.
  6. يغسل ب 10 مل من DPBS الخالي من Mg 2 + و Ca2 + ، ويترك ليجف في الحاضنة ، ويخزن في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء. قم بتخزين القوارير لمدة تصل إلى 6 أشهر في درجة حرارة الغرفة (RT).

2. تنظيف الأنف بالفرشاة

ملاحظة: تأكد من إجراء تنظيف الأنف بالفرشاة بينما لا يعاني المشارك من عدوى حادة. إذا كان مرضى التليف الكيسي يعانون من عدوى رئوية ، فراجع المضاد الحيوي للمريض وأضف مضادات حيوية إضافية إلى وسط التضخيم. تم جمع الخلايا الظهارية الأنفية البشرية عن طريق تنظيف الأنف بالفرشاة من مرضى F508del / F508del كما هو موضح سابقا9.

  1. اطلب من المريض نفخ أنفه ، ثم تخدير الغشاء المخاطي لكلا الخياشيم موضعيا باستخدام شبكات قطنية غارقة في xylocaine 5٪ بمحلول نافازولين.
  2. قم بتنظيف الجدار الإنسي والتوربينات السفلية لكلا الفتحتين برفق باستخدام فرشاة علم الخلايا. انقع الفرشاة في أنبوب 15 مل مع 2 مل من وسط التنظيف المتاح تجاريا ؛ رج بلطف لفصل الخلايا. كرر تنظيف الأسنان بالفرشاة في فتحة الأنف الثانية.
  3. أضف المضادات الحيوية التالية إلى وسط التنظيف: البنسلين (100 U / mL) ، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) ، Tazocillin (10 ميكروغرام / مل) ، الأمفوتريسين B (2.5 ميكروغرام / مل) والكوليميسين (16 ميكروغرام / مل).
    ملاحظة: يمكن شحن فرشاة الأنف في RT إلى مختبرات مخصصة للتوسع والثقافة ويمكن بذورها حتى 72 ساعة بعد تنظيف الأسنان بالفرشاة.

3. عزل ال HNE

ملاحظة: تم عزل HNE من فرشاة علم الخلايا ، وغسلها باستخدام DPBS الخالي من Mg2 + و Ca 2+ ، وفصلها مع 0.25٪ Trypsin ، وزرعها على قارورة بلاستيكية 25 سم2 كما هو موضح سابقا10.

  1. افصل الخلايا عن فرشاة علم الخلايا عن طريق تمرير الفرشاة بشكل متكرر من خلال مخروط ماصة 1000 ميكرولتر وشطفها ب 2 مل من DPBS الخالي من Mg2 + و Ca2+. جهاز طرد مركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant.
  2. أعد تعليق الكريات في 0.25٪ تريبسين لمدة 8-12 دقيقة لفصل الخلايا. أوقف التفاعل الإنزيمي بإضافة 5 مل من وسط التضخيم.
  3. جهاز طرد مركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant. أعد تعليق الكريات في 8 مل من وسط التضخيم والبذور على قارورة مغلفة بالكولاجين25 سم 2 . تنمو عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. وهذا يتوافق مع المقطع 0.
  4. في اليوم التالي ، استبدل الوسط ب 5 مل من وسط التضخيم الطازج وراقب الخلايا يوميا للتعلق ، والتشكل (يجب أن يكون للخلايا مظهر مرصوف بالحصى متماسك) ، والعدد.
    ملاحظة: تختلف كثافة البذر الأولية اعتمادا على جودة تنظيف الأنف بالفرشاة ونسبة الخلايا الظهارية. عادة ما تصل خلايا HNE المعزولة حديثا إلى 80٪ -90٪ من الالتقاء في غضون 3-10 أيام. يشير معدل النمو البطيء إلى عدم كفاية الخلايا الظهارية في العينة ويجب التخلص منها.

4. تضخيم وتمرير الخلايا الظهارية الأنفية البشرية

  1. تنمو الخلايا الظهارية الأنفية البشرية في وسط التضخيم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 على قوارير مغلفة بالكولاجين حتى 80٪ -90٪ التقاء ، مع تغيير الوسط كل 48-72 ساعة. بالنسبة للقوارير25 سم 2 ، استخدم 5 مل من وسط التضخيم و 10 مل لقوارير 75 سم2 .
  2. عندما تصل الخلايا إلى 80٪ -90٪ من الالتقاء ، اغسل الخلايا ب 10 مل من DPBS الخالي من Mg2 + و Ca2 + ، وقم بالشفط ، وتخلص منه.
  3. أضف 1 مل من التريبسين بنسبة 0.25٪ لقارورة25 سم 2 (أو 2 مل من التربسين لقارورة 75 سم 2) والعودة إلى الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 8-12 دقيقة.
  4. اضغط على القارورة بإحكام ، براحة اليد ، لمساعدة الخلايا على الانفصال.
  5. أضف 10 مل من وسط التضخيم لإيقاف التفاعل الإنزيمي. اشطف القارورة بقوة، باستخدام ماصة سعة 10 مل لسحب وطرد وسط التضخيم فوق سطح القارورة لشطف الخلايا وفصلها.
  6. جهاز طرد مركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant.
  7. أعد تعليق الكريات في 5-10 مل من وسط التضخيم.
  8. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    ملاحظة: يمكن تجميد الخلايا في هذه المرحلة (راجع الخطوات من 5.1 إلى 5.3). إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من التضخيم ، فأعد البذر على قوارير مغلفة بالكولاجين (يمكن توسيع قارورة25 سم 2 إلى ثلاث قوارير 75 سم2 ، ولا ينصح بتخفيف أكبر).

5. الحفظ بالتبريد للخلايا الظهارية الأنفية الأولية

ملاحظة: تنمو خلايا HNE حتى المرور 1 قبل البنوك الحيوية للحصول على ما يكفي من الخلايا لتسهيل نمو الخلايا عند إذابتها. ومع ذلك ، فإن البنوك الحيوية ممكنة في المقطع الأولي 0 أو المقطع 2. يتم تكييف خطوات الحفظ بالتبريد التالية مع جميع المقاطع.

  1. بعد عد الخلايا ، قم بجهاز طرد مركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من supernatant
  2. أعد تعليق الكريات في وسط التجميد المخصب (الجدول 1) للحصول على 3 × 10 6-5 × 106 خلايا لكل مل ولكل تبريد.
  3. قم بتجميد الخلايا ببطء عن طريق تقليل درجة الحرارة عند ~ 1 درجة مئوية في الدقيقة في حاوية تجميد مناسبة بالتبريد عند -80 درجة مئوية. في اليوم التالي ، انقل العينة المحفوظة إلى حاوية تخزين النيتروجين للتخزين على المدى الطويل (تقتصر هذه الدراسة على تخزين 17 شهرا).

6. إذابة خلايا HNE المضخمة المجمدة

  1. قم بتسخين الحمام المائي إلى 37 درجة مئوية. تحضير وسط التضخيم كما هو موضح في الجدول 1 وتسخين الوسط إلى 37 درجة مئوية.
  2. قم بإزالة الكريوفيات من خزان تخزين النيتروجين ووضعها بسرعة في الحمام المائي ، مع الحرص على عدم غمر القارورة بأكملها في الماء. قم بإزالة الكريوفيالات من الحمام المائي عندما تبقى قطرة صغيرة مجمدة فقط. امسح القارورة بالكحول بنسبة 70٪ ، وجففها ، وضعها تحت غطاء المحرك.
  3. باستخدام ماصة 1 مل ، انقل الخلايا المذابة إلى أنبوب فارغ سعة 15 مل.
  4. بطريقة قطرة ، أضف 1 مل من وسط التضخيم الدافئ. بعد 1 دقيقة ، أضف 1 مل أخرى من وسط التضخيم وانتظر دقيقة إضافية.
  5. أضف 10 مل من وسط التضخيم وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة عند 500 × جم.
  6. شفط والتخلص من supernatant. أعد تعليق بيليه الخلية في حجم وسط التضخيم المطلوب لتحقيق كثافة خلية لا تقل عن 1 × 106 خلايا/مل.
  7. زرع الخلايا على قارورة مغلفة بالكولاجين تحتوي على وسط التضخيم.
    1. إذا كان التبريد يحتوي على أكثر من 4 × 106 خلايا، البذور على قارورة 75 سم2 ، في 10 مل من وسط التضخيم
    2. إذا كان التبريد يحتوي على أقل من 4 × 106 خلايا، فإن خلايا البذور على قارورة25 سم 2 ، في 5 مل من وسط التضخيم
  8. احتضان في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 ، ومراقبة بصريا توسع الخلايا على مدى 2-3 أيام القادمة.
  9. ثم قم بإجراء تضخيم الخلية كما هو مفصل في القسم 4.
    ملاحظة: إذا تم حصاد عدد قليل من الخلايا في الخطوة 4.7. (أي إذا تجمد عند المقطع 0 قبل التوسع)، الخطوات 6.5. و 6.6. يمكن حذفها ، ويمكن زرع الخلايا مباشرة على قارورة مغلفة بالكولاجين25 سم 2 دون طرد مركزي. يجب بعد ذلك تغيير الوسط في اليوم التالي لإزالة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).

7. تمايز الخلايا الظهارية الأنفية البشرية في واجهة الهواء السائل

ملاحظة: تم تمييز HNE في واجهة الهواء السائل كما هو موضح سابقا10.

  1. زرع الخلايا بكثافة 330000 خلية / مرشح على 0.33 سم2 مرشحات مسامية مغلفة بالكولاجين واستكمال مع 300 ميكرولتر من وسط التضخيم في الجانب القمي و 900 ميكرولتر من الوسط السائل الهوائي في الجانب القاعدي.
  2. بعد 3 أيام ، قم بشفط الوسط القمي واستزرع الخلايا في واجهة الهواء السائل لمدة 3-4 أسابيع في الوسط السائل الهوائي لإنشاء ظهارة متباينة. تغيير الوسط القاعدي كل 48-72 ساعة.

8. معدلات CFTR

  1. تحضير وسط الهواء السائل الذي يحتوي على معدلات CFTR. استخدم VX-445 و VX-661 و VX-809 بتركيز نهائي قدره 3 ميكرومتر و VX-770 عند 100 نانومتر. استخدم المصحح ABBV-2222 عند التركيز النهائي 1 ميكرومتر والمقوي ABBV-974 عند 10 ميكرومتر.
  2. تحضير وسط الهواء السائل يحتوي على نفس الكمية من DMSO 100٪ كما هو الحال في وسط المصحح.
  3. أضف الوسط الذي يحتوي على أدوية أو DMSO إلى الجانب القاعدي لخلايا HNE المستقطبة المزروعة في واجهة هوائية سائلة واحتضنها لمدة 24 ساعة في 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
  4. بعد 24 ساعة ، قم بشفط الوسط والتخلص منه واستبداله بوسط طازج تم إعداده كما هو الحال في الخطوات 8.1-8.2 ، واحتضان لفترة 24 ساعة في 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.

9. استخدام دراسات الغرفة

  1. قم بقياس قياسات تيار الدائرة القصيرة (Isc) تحت ظروف مشبك الجهد كما هو موضح سابقا9.
    ملاحظة: تم قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER) للمزارع باستخدام فولتميتر عيدان تناول الطعام، ولم يتم النظر إلا في الثقافات التي تصل إلى 200 Ω سم2 على الأقل للتجارب التالية. تم تركيب مرشحات خلايا HNE المستقطبة في غرف Ussing ، وتم قياس قياسات تيار الدائرة القصيرة (Isc) في ظل ظروف الجهد المشبك.

10. الكيمياء المناعية

  1. إجراء الكشف المناعي كما هو موضح سابقا9.
    ملاحظة: تم إجراء الكشف المناعي CFTR باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل CFTR C-terminal (24-1) بين عشية وضحاها عند تخفيف 1/100. تم إجراء تلطيخ Zona-occludens-1 (ZO-1) (تخفيف 1/500) ، ألفا توبولين (تخفيف 1/300) ، Muc 5AC (تخفيف 1/250) و cytokeratin 8 (تخفيف 1/250) على مرشحات إضافية. بعد الغسيل باستخدام PBS-Triton-X100 0.1٪ ، تمت إضافة الأجسام المضادة الثانوية للماعز المترافقة مع Alexa 488 أو 594 لمدة 30 دقيقة في مصل الماعز بنسبة 10٪ (تخفيف 1/1000). بعد الغسيل النهائي ، تم قطع المرشحات من الدعم وتركيبها مع وسيط تركيب Vectashield يحتوي على DAPI. تم استخدام مجهر متحد البؤرة (63x / 1.4 تباين التداخل التفاضلي للنفط λ Blue PL APO الهدف) لالتقاط الصور ، والتي تم تحليلها باستخدام برنامج ImageJ.

11. التحليل الإحصائي

  1. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرامج المناسبة.
    ملاحظة: تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج S.A.S. نظرا لأنه تم الحصول على العديد من مرشحات HNE لكل مريض ولكل حالة ، تم التعبير عن المعلمات الكمية كقيم وسيطة (± SEM) لكل مريض. تم إجراء المقارنات (متوسط ± SD) باستخدام اختبار الرتبة الموقعة على أزواج Wilcoxon أو اختبار t غير المقترن.

النتائج

تعرض خلايا HNE الطازجة المستزرعة في واجهة الهواء السائل ميزات نموذجية للظهارة التنفسية المستقطبة والمتباينة كما تم تقييمها بواسطة التلطيخ المناعي (الشكل 1). تعيد خلايا HNE التمايز إلى طبقة غير متجانسة من الخلايا الظهارية (تلطيخ مناعي إيجابي للكيراتين 8) تحاكي الوضع الحي ...

Discussion

تم اقتراح استخدام الخلايا الظهارية الأنفية المشتقة من المريض كبدائل للخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية (HBE) لقياس نشاط CFTR في سياق الطب الشخصي حيث تقوم HNE بإعادة إنتاج خصائص الخلايا في الثقافة 9,11. الميزة القوية ل HNE على مزارع خلايا HBE هي أنه يتم أخذ عينات ...

Disclosures

لم يبلغ المؤلفون عن أي مصالح مالية متنافسة تتعلق بهذا المنشور أو إنتاج الفيديو العلمي.

Acknowledgements

نشكر بحرارة جميع المرضى وعائلاتهم على المشاركة في الدراسة. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من الرابطة الفرنسية Vaincre la Mucoviscidose. الجمعية الفرنسية ABCF 2 وجوائز فيرتكس للابتكار في مجال الأدوية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ABBV-2222SelleckchemS8535
ABBV-974SelleckchemS8698
Advanced DMEM/F-12Life Technologies12634010
Alexa 488 goat secondary antibodyInvitrogenA11001
Alexa 594 goat secondary antibodyInvitrogenA11012
Amphotericin BLife Technologies15290026
Anti-alpha-tubulin antibodyAbcamab80779
Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)R&D SystemsMAB25031
Anti-cytokeratin 8 antibodyProgen61038
Anti-Muc5AC antibodySanta Cruz Biotechsc-20118
Anti-ZO-1 antibodySanta Cruz Biotechsc-10804
Ciprofloxacinprovided by Necker Hospital Pharmacy
ColimycinSanofiprovided by Necker Hospital Pharmacy
Collagen type IVSigma-Aldrich MerckC-7521
cytology brushLaboratory GYNEAS02.104
DMSOSigma-Aldrich MerckD2650
EGFLife TechnologiesPHG0311
EpinephrinSigma-Aldrich MerckE4375
F12-Nutrient MixtureLife Technologies11765054
FBSLife Technologies10270106
FerticultFertipro NVFLUSH020
Flasks 25Thermo Scientific156.367
Flasks 75Thermo Scientific156.499
Glacial acetic acidVWR20104.298
HEPESSigma-Aldrich MerckH3375
HydrocortisoneSigma-Aldrich MerckSLCJ0893
InsulinSigma-Aldrich MerckI0516
Mg2+ and Ca2+-free DPBSLife Technologies14190094
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140130
TazocillinMylanprovided by Necker Hospital Pharmacy
Transwell FiltersSigma-Aldrich MerckCLS3470-48EA
Triton-X100Sigma-Aldrich MerckT8787
Trypsin 0,25%Life Technologies25200056
Vectashield mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
VX-445SelleckchemS8851
VX-661SelleckchemS7059
VX-770SelleckchemS1144
VX-809SelleckchemS1565
Xylocaine naphazoline 5%Aspen Franceprovided by Necker Hospital Pharmacy
Y-27632SelleckchemS1049

References

  1. Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
  2. Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
  3. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
  4. Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
  5. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
  6. Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
  7. Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
  8. Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
  9. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
  10. Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
  11. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
  12. Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
  13. de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
  14. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
  15. McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
  16. Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
  17. Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
  18. Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
  19. Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
  20. Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
  21. Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
  22. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
  23. Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
  24. Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
  25. Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
  26. Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
  27. Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
  28. Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
  29. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
  30. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).
  31. Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182 CFTR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved