Células epiteliales nasales humanas primarias: biobancos en el contexto de la medicina de precisión

Resumen

Aquí describimos el aislamiento, la amplificación y la diferenciación de las células epiteliales nasales humanas primarias (HNE) en la interfaz aire-líquido y un protocolo de biobanco que permite congelar con éxito y luego descongelar la HNE amplificada. El protocolo analiza las propiedades electrofisiológicas de las células HNE diferenciadas y la corrección de la secreción de cloruro relacionada con CFTR en diferentes tratamientos moduladores.

Resumen

Las células epiteliales nasales humanas (HNE) son fáciles de recolectar mediante un cepillado nasal simple y no invasivo. Las células HNE primarias derivadas del paciente se pueden amplificar y diferenciar en un epitelio pseudoestratificado en condiciones de interfaz aire-líquido para cuantificar el transporte cíclico de cloruro (Cl^-) mediado por AMP como un índice de la función reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). Si los pasos críticos, como la calidad del cepillado nasal y la densidad celular tras la criopreservación, se pueden realizar de manera eficiente, las células HNE se pueden biobancar con éxito. Además, los estudios de corriente de cortocircuito demuestran que la congelación-descongelación no modifica significativamente las propiedades electrofisiológicas de las células HNE y la respuesta a los moduladores CFTR. En las condiciones de cultivo utilizadas en este estudio, cuando se congelan menos de 2 x 10⁶ células por criovial, la tasa de fracaso es muy alta. Recomendamos congelar al menos 3 x 10⁶ células por criovial. Demostramos que las terapias duales que combinan un corrector CFTR con un potenciador CFTR tienen una eficacia de corrección comparable para la actividad CFTR en células HNE F508del-homocigotas. La terapia triple VX-445 + VX-661 + VX-770 aumentó significativamente la corrección de la actividad de CFTR en comparación con la terapia dual VX-809 + VX-770. La medida de la actividad de CFTR en células HNE es un biomarcador preclínico prometedor útil para guiar la terapia con moduladores de CFTR.

Introducción

La fibrosis quística (FQ) es un trastorno autosómico recesivo resultante de mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) que conduce a la ausencia o disfunción de la proteína CFTR, un canal aniónico situado en la superficie apical de los epitelios ^1,2. Los recientes avances en la terapia CFTR han mejorado el pronóstico de la enfermedad, y los últimos fármacos aprobados que combinan correctores CFTR y potenciadores CFTR condujeron a mejoras importantes en la función pulmonar y la calidad de vida de los pacientes con FQ portadores de la mutación p.Phe508del más frecuente (F508del)^3,4. A pesar de este prometedor progreso terapéutico, alrededor del 10% de los pacientes con FQ no son elegibles ya que portan mutaciones que no son rescatables por estos moduladores CFTR. Para estos pacientes, existe la necesidad de probar otros medicamentos o combinaciones de medicamentos para encontrar la combinación más eficiente para mutaciones específicas, destacando la importancia de las terapias personalizadas.

Las células epiteliales nasales humanas (HNE) son fáciles de recolectar mediante un cepillado nasal simple y no invasivo y permiten cuantificar el transporte cíclico de cloruro mediado por AMP (Cl⁻) como un índice de la función CFTR. Las células HNE producen un modelo preciso de las vías respiratorias humanas, pero su vida útil es limitada en cultivo. Gracias a la optimización de las técnicas de cultivo, las células HNE primarias derivadas del paciente pueden reprogramarse condicionalmente con inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCKi), amplificarse y diferenciarse en un epitelio pseudoestratificado en condiciones de interfaz aire-líquido (ALI) en filtros microporosos ^5,6. Existen numerosos protocolos de cultivo para el cultivo de HNE (disponibles comercialmente, sin suero, "caseros", cocultivos con células alimentadoras, etc.), y se ha descrito que la elección de los medios y las condiciones de cultivo afectan el crecimiento, la diferenciación de la población celular y la función epitelial ^7,8. El protocolo aquí presenta un método de amplificación ROCKi simplificado, libre de alimentación, que permite obtener con éxito un gran número de células HNE que luego se diferencian en ALI para ensayos de función CFTR.

Hemos demostrado que, en células HNE diferenciadas, un tratamiento de 48 h con moduladores CFTR es suficiente para inducir la corrección electrofisiológica de la corriente Cl ^dependiente de CFTR y que la corrección observada in vitro puede estar correlacionada con la mejoría clínica del paciente⁹. Las células HNE, por lo tanto, representan un modelo apropiado no solo para la investigación fundamental de la FQ, sino también para estudios preclínicos con pruebas de modulador CFTR específicas del paciente. En este contexto de terapia personalizada, el objetivo del protocolo fue validar que las células HNE criopreservadas de pacientes con FQ, cultivadas en nuestras condiciones, eran un modelo apropiado para los estudios de corrección de CFTR, y se podían esperar resultados similares al comparar el transporte de Cl^- dependiente de CFTR de células frescas y congeladas-descongeladas. El estudio también evaluó la eficacia de diferentes moduladores CFTR cuando se utilizan terapias duales y triples.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron siguiendo las directrices y regulaciones descritas por la Declaración de Helsinki y la ley Huriet-Serusclat sobre ética de la investigación humana.

1. Preparación de matraces y diferentes soportes

1. Preparar la amplificación, el aire-líquido y el medio de congelación como se describe en la Tabla 1.
2. Prepare una solución madre de colágeno iv humano disolviendo 50 mg de colágeno en 100 ml de ácido acético glacial al 0,2%. Mezcle en un agitador magnético durante al menos 1 h y esterilice el filtro la solución. Conservar a 4 °C durante un máximo de 6 meses en una botella de vidrio, protegida de la luz.
3. Prepare una solución de trabajo de colágeno IV diluyendo la solución madre 1: 5 en agua doble destilada. Conservar a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
4. Cubra los matraces de cultivo celular de plástico o los filtros transwell con la solución de trabajo de colágeno. Distribuya uniformemente 100 μL para 0,33 cm² filtros transwell, 500 μL para^{matraces 2 cm 2} y 1 mL para matraces^{2 cm 75} cm en toda la superficie de crecimiento del matraz.
   NOTA: Esto se puede lograr inclinando suavemente el matraz de lado a lado. Alternativamente, para facilitar el recubrimiento de los matraces, se puede utilizar un mayor volumen, y cuando toda la superficie está cubierta uniformemente, se aspira la solución de colágeno para dejar solo el volumen indicado. La solución de colágeno aspirado se puede usar inmediatamente para recubrir el siguiente matraz (es decir, para tres matraces de 75 cm² , distribuir 3 ml de solución de colágeno uniformemente en el primer matraz, aspirar 2 ml, que luego se usan para el siguiente matraz, y así sucesivamente).
5. Deje los matraces de cultivo celular en la incubadora durante un mínimo de 2 h o durante la noche. Aspire el colágeno a fondo y deje que los matraces se sequen en la incubadora o debajo del capó durante un mínimo de 20 minutos o durante la noche.
6. Lavar con 10 ml de DPBS libres de Mg²⁺- y Ca²⁺, dejar secar en la incubadora y almacenar en papel de aluminio para proteger de la luz. Guarde los matraces durante un máximo de 6 meses a temperatura ambiente (RT).

2. Cepillado nasal

NOTA: Asegúrese de que el cepillado nasal se realiza mientras el participante no tiene una infección aguda. Si los pacientes con FQ presentan una infección pulmonar, consulte el antibiograma del paciente y agregue antibióticos adicionales al medio de amplificación. Las células epiteliales nasales humanas se recolectaron mediante cepillado nasal de pacientes con F508del/F508del como se describió anteriormente⁹.

1. Pida al paciente que se suene la nariz, luego anestesia tópicamente la mucosa de ambas fosas nasales utilizando mallas de algodón empapadas en xilocaína al 5% con solución de nafazolina.
2. Cepille suavemente la pared medial y el cornete inferior de ambas fosas nasales con un cepillo de citología. Remoje el cepillo en un tubo de 15 ml con 2 ml de medio de lavado disponible comercialmente; agitar suavemente para separar las células. Repita el cepillado en la segunda fosa nasal.
3. Añadir los siguientes antibióticos al medio de lavado: Penicilina (100 U/mL), Estreptomicina (100 μg/mL), Tazocilina (10 μg/mL), Anfotericina B (2,5 μg/mL) y Colimicina (16 μg/mL).
   NOTA: Los cepillados nasales se pueden enviar en RT a laboratorios dedicados para la expansión y el cultivo y se pueden sembrar hasta 72 h después del cepillado.

3. Aislamiento de HNE

NOTA: Las HNE se aislaron del cepillo de citología, se lavaron con DPBS libres de Mg 2⁺ y Ca²⁺, se disociaron con tripsina al 0,25% y se sembraron en un matraz de plástico de 25 cm² como se describió anteriormente¹⁰.

1. Separe las células del cepillo de citología pasando repetidamente el cepillo a través de un cono de pipeta de 1000 μL y enjuagando con² ml de DPBS libre de Mg^{2+ y Ca 2+}. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
2. Resuspend el pellet en tripsina al 0,25% durante 8-12 min para disociar las células. Detenga la reacción enzimática agregando 5 ml del medio de amplificación.
3. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 8 ml del medio de amplificación y sembrar en un matraz recubierto de colágeno^{de 25 cm 2} . Crecer a 37 °C y 5% CO₂. Esto corresponde al pasaje 0.
4. Al día siguiente, reemplace el medio con 5 ml de medio de amplificación fresco y monitoree las células diariamente para la unión, la morfología (las células deben tener una apariencia de adoquín cohesivo) y el número.
   NOTA: La densidad de siembra inicial varía dependiendo de la calidad del cepillado nasal y la proporción de células epiteliales. Las células HNE recién aisladas generalmente alcanzan una confluencia del 80% al 90% en 3-10 días. Una tasa de crecimiento más lenta sugiere insuficiencia de células epiteliales en la muestra y debe descartarse.

4. Amplificación y paso a través de células epiteliales nasales humanas

1. Cultivar células epiteliales nasales humanas en el medio de amplificación a 37 °C y 5% de CO₂ en matraces recubiertos de colágeno hasta una confluencia del 80%-90%, cambiando de medio cada 48-72 h. Para matraces^{de 25 cm 2} , utilice 5 ml de medio de amplificación y 10 ml para matraces de^{75 cm 2} .
2. Cuando las células alcancen una confluencia del 80% -90%, lave las células con 10 ml de DPBS libre de Mg 2⁺ y Ca²⁺, aspire y descarte.
3. Añadir 1 ml de tripsina al 0,25% para un matraz de 25 cm² (o 2 ml de tripsina para un matraz de 75 cm² ) y volver a la incubadora (37 °C, 5% CO₂) durante 8-12 min.
4. Golpee el matraz con firmeza, con la palma de la mano, para ayudar a que las células se desprendan.
5. Añadir 10 ml del medio de amplificación para detener la reacción enzimática. Enjuague vigorosamente el matraz, utilizando la pipeta de 10 ml para extraer y expulsar el medio de amplificación sobre la superficie del matraz para enjuagar y separar las células.
6. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
7. Resuspend el pellet en 5-10 mL del medio de amplificación.
8. Cuente las células usando un hemocitómetro.
   NOTA: Las celdas se pueden congelar en este punto (consulte los pasos 5.1-5.3). Si se requiere una amplificación adicional, vuelva a sembrar en matraces recubiertos de colágeno (un matraz^{de 25 cm 2} se puede expandir en tres matraces de 75 cm² , no se recomienda una mayor dilución).

5. Criopreservación de células epiteliales nasales primarias

NOTA: Cultive células HNE hasta el paso 1 antes del biobanco para obtener suficientes células para facilitar el crecimiento celular cuando se descongelan. Sin embargo, la biobanca es posible en el pasaje inicial 0 o en el pasaje 2. Los siguientes pasos de criopreservación se adaptan a todos los pasajes.

1. Después del recuento celular, centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante
2. Resuspendir el pellet en el medio de congelación enriquecido (Tabla 1) para obtener 3 x 10^6-5 x 10⁶ células por ml y por criovial.
3. Congele lentamente las células reduciendo la temperatura a ~ 1 ° C por minuto en un recipiente de criocongelación apropiado a -80 ° C. Al día siguiente, mueva la muestra preservada a un contenedor de almacenamiento de nitrógeno para su almacenamiento a largo plazo (el presente estudio está limitado a 17 meses de almacenamiento).

6. Descongelación de células HNE amplificadas congeladas

1. Calentar el baño de agua a 37 °C. Preparar el medio de amplificación como se describe en la Tabla 1 y calentar el medio a 37 °C.
2. Retire los crioviales del tanque de almacenamiento de nitrógeno y colóquelos rápidamente en el baño de agua, teniendo cuidado de no sumergir todo el vial en el agua. Retire los crioviales del baño de agua cuando solo quede una pequeña gota congelada. Limpie el vial con alcohol al 70%, seque y colóquelo debajo del capó.
3. Usando una pipeta de 1 ml, transfiera las celdas descongeladas a un tubo vacío de 15 ml.
4. De manera superficial, agregue 1 ml de medio de amplificación caliente. Después de 1 minuto, agregue otro medio de amplificación de 1 ml y espere un minuto adicional.
5. Añadir 10 ml del medio de amplificación y centrífuga durante 2 min a 500 x g.
6. Aspirar y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en un volumen de medio de amplificación necesario para lograr una densidad celular de al menos 1 x 10⁶ células/ml.
7. Sembra las células en un matraz recubierto de colágeno que contenga el medio de amplificación.
   1. Si el criovial contiene más de 4 x 10⁶ células, sembrar en un matraz de 75 cm² , en 10 mL del medio de amplificación
   2. Si criovial contiene menos de 4 x 10⁶ células, células de semilla en un matraz de^{25 cm 2} , en 5 ml del medio de amplificación
8. Incubar a 37 °C, 5% de CO_2, y observar visualmente la expansión celular durante los próximos 2-3 días.
9. A continuación, realice la amplificación celular como se detalla en la sección 4.
   NOTA: Si se cosecharon pocas células en el paso 4.7. (es decir, si se congela en el pasaje 0 antes de la expansión), pasos 6.5. y 6.6. se puede omitir, y las células se pueden sembrar directamente en un matraz recubierto de colágeno^{de 25 cm 2} sin centrifugación. El medio debe cambiarse al día siguiente para eliminar el dimetilsulfóxido (DMSO).

7. Diferenciación de las células epiteliales nasales humanas en la interfaz aire-líquido

NOTA: Las HNE se diferenciaron en la interfaz aire-líquido como se describió anteriormente¹⁰.

1. Sembrar las células a una densidad de 330.000 células/filtro en filtros porosos recubiertos de colágeno de 0,33 cm² y complementar con 300 μL del medio de amplificación en el lado apical y 900 μL del medio aire-líquido en el lado basolateral.
2. Después de 3 días, aspire el medio apical y cultive las células en la interfaz aire-líquido durante 3-4 semanas en el medio aire-líquido para establecer un epitelio diferenciado. Cambiar el medio basal cada 48-72 h.

8. Moduladores CFTR

1. Preparar medio aire-líquido que contenga moduladores CFTR. Utilice VX-445, VX-661 y VX-809 a una concentración final de 3 μM y VX-770 a 100 nM. Utilice el corrector ABBV-2222 a 1 μM de concentración final y el potenciador ABBV-974 a 10 μM. Utilice 100% DMSO para disolver todos los moduladores CFTR.
2. Preparar medio aire-líquido que contenga la misma cantidad de 100% DMSO que en el medio corrector.
3. Agregue el medio que contiene medicamentos o DMSO al lado basolateral de las células HNE polarizadas cultivadas en una interfaz aire-líquido e incube durante 24 h en 5% de CO₂ a 37 ° C.
4. Después de 24 h, aspire y deseche el medio y reemplácelo con medio fresco preparado como en los pasos 8.1-8.2., e incube aún más durante un período de 24 h en 5% de CO₂ a 37 ° C.

9. Estudios de la cámara de Ussing

1. Mida las mediciones de corriente de cortocircuito (Isc) en condiciones de abrazadera de voltaje como se describió anteriormente⁹.
   NOTA: La resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de los cultivos se midió con un voltímetro de palillo, y solo se consideraron cultivos que alcanzaran al menos 200 Ω·cm² para los siguientes experimentos. Los filtros de las celdas HNE polarizadas se montaron en las cámaras de Ussing, y las mediciones de corriente de cortocircuito (Isc) se midieron en condiciones de abrazadera de voltaje.

10. Inmunocitoquímica

1. Realizar la inmunodetección como se describió anteriormente⁹.
   NOTA: La inmunodetección de CFTR se realizó utilizando el anticuerpo monoclonal anti-CFTR C-terminal (24-1) durante la noche a una dilución de 1/100. La tinción de zona-ocludens-1 (ZO-1) (dilución 1/500), alfa-tubulina (dilución 1/300), Muc 5AC (dilución 1/250) y citoqueratina 8 (dilución 1/250) en filtros adicionales. Después del lavado con PBS-Triton-X100 0.1%, se agregaron anticuerpos secundarios de cabra conjugados a Alexa 488 o 594 durante 30 min en suero de cabra al 10% (dilución de 1/1000). Después de un lavado final, los filtros se cortaron del soporte y se montaron con el medio de montaje Vectashield que contenía DAPI. Se utilizó un microscopio confocal (contraste de interferencia diferencial de aceite 63x/1.4 λ objetivo azul PL APO) para capturar imágenes, que se analizaron con el software ImageJ.

11. Análisis estadístico

1. Realizar análisis estadísticos utilizando el software adecuado.
   NOTA: El análisis estadístico se realizó utilizando el software S.A.S. Como se obtuvieron varios filtros HNE por paciente y por condición, los parámetros cuantitativos se expresaron como valores medios (± SEM) por paciente. Las comparaciones (media ± de SD) se llevaron a cabo utilizando la prueba de rango firmado de pares emparejados de Wilcoxon o la prueba t no emparejada.

Resultados

Las células HNE frescas cultivadas en la interfaz aire-líquido muestran características típicas del epitelio respiratorio polarizado y diferenciado evaluado por inmunotinción (Figura 1). Las células HNE se vuelven a diferenciar en una capa heterogénea de células epiteliales (inmunotinción positiva de queratina 8) que imitan la situación in vivo de un epitelio respiratorio pseudoestratificado compuesto por células caliciformes productoras de moco ciliadas (tinción positiv...

Discusión

El uso de células epiteliales nasales derivadas del paciente como sustitutos de las células epiteliales bronquiales humanas (HBE) para medir la actividad de CFTR en el contexto de la medicina personalizada se ha propuesto como propiedades de reproducción de células HNE en cultivo ^9,11. La gran ventaja de la HNE sobre los cultivos de células HBE es que se muestrean de forma fácil y no invasiva. Las mediciones de corriente de cortocircuito en cultivos celular...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABBV-2222	Selleckchem	S8535
ABBV-974	Selleckchem	S8698
Advanced DMEM/F-12	Life Technologies	12634010
Alexa 488 goat secondary antibody	Invitrogen	A11001
Alexa 594 goat secondary antibody	Invitrogen	A11012
Amphotericin B	Life Technologies	15290026
Anti-alpha-tubulin antibody	Abcam	ab80779
Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)	R&D Systems	MAB25031
Anti-cytokeratin 8 antibody	Progen	61038
Anti-Muc5AC antibody	Santa Cruz Biotech	sc-20118
Anti-ZO-1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-10804
Ciprofloxacin		provided by Necker Hospital Pharmacy
Colimycin	Sanofi	provided by Necker Hospital Pharmacy
Collagen type IV	Sigma-Aldrich Merck	C-7521
cytology brush	Laboratory GYNEAS	02.104
DMSO	Sigma-Aldrich Merck	D2650
EGF	Life Technologies	PHG0311
Epinephrin	Sigma-Aldrich Merck	E4375
F12-Nutrient Mixture	Life Technologies	11765054
FBS	Life Technologies	10270106
Ferticult	Fertipro NV	FLUSH020
Flasks 25	Thermo Scientific	156.367
Flasks 75	Thermo Scientific	156.499
Glacial acetic acid	VWR	20104.298
HEPES	Sigma-Aldrich Merck	H3375
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich Merck	SLCJ0893
Insulin	Sigma-Aldrich Merck	I0516
Mg2+ and Ca2+-free DPBS	Life Technologies	14190094
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140130
Tazocillin	Mylan	provided by Necker Hospital Pharmacy
Transwell Filters	Sigma-Aldrich Merck	CLS3470-48EA
Triton-X100	Sigma-Aldrich Merck	T8787
Trypsin 0,25%	Life Technologies	25200056
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
VX-445	Selleckchem	S8851
VX-661	Selleckchem	S7059
VX-770	Selleckchem	S1144
VX-809	Selleckchem	S1565
Xylocaine naphazoline 5%	Aspen France	provided by Necker Hospital Pharmacy
Y-27632	Selleckchem	S1049