JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מתארים את הבידוד, ההגברה וההתמיינות של תאי אפיתל האף האנושיים העיקריים (HNE) בממשק האוויר-נוזלי ופרוטוקול ביו-בנקאי המאפשר להקפיא בהצלחה ולאחר מכן להפשיר HNE מוגבר. הפרוטוקול מנתח תכונות אלקטרופיזיולוגיות של תאי HNE ממוינים ותיקון הפרשת כלוריד הקשור ל-CFTR בטיפולי אפנון שונים.

Abstract

קל לאסוף תאי אפיתל האף האנושיים (HNE) על ידי צחצוח אף פשוט ולא פולשני. ניתן להגביר ולהבדיל תאי HNE ראשוניים שמקורם בחולה לאפיתל פסאודו-מרובד בתנאי ממשק אוויר-נוזל כדי לכמת הובלה מחזורית של כלוריד בתיווך AMP (Cl-) כמדד לתפקוד מווסת ההולכה של סיסטיק פיברוזיס טרנס-ממברנה (CFTR). אם שלבים קריטיים כגון איכות צחצוח האף וצפיפות התאים בעת שמירת ההקפאה מבוצעים ביעילות, תאי HNE יכולים להיות ביו-בנקאיים בהצלחה. יתר על כן, מחקרי זרם קצר-חשמלי מראים כי הפשרה בהקפאה אינה משנה באופן משמעותי את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תאי HNE ואת התגובה לאפנוני CFTR. בתנאי התרבית המשמשים במחקר זה, כאשר פחות מ-2 x 106 תאים מוקפאים לכל קריוביאל, שיעור הכשל גבוה מאוד. אנו ממליצים להקפיא לפחות 3 x 106 תאים לכל קריוביאל. אנו מראים שלטיפולים כפולים המשלבים מתקן CFTR עם פוטנציאטור CFTR יש יעילות תיקון דומה לפעילות CFTR בתאי HNE F508del-homozygous. טיפול משולש VX-445 + VX-661 + VX-770 הגדיל באופן משמעותי את התיקון של פעילות CFTR בהשוואה לטיפול כפול VX-809 + VX-770. המדד של פעילות CFTR בתאי HNE הוא סמן ביולוגי פרה-קליני מבטיח המשמש להנחיית טיפול במודולטור CFTR.

Introduction

סיסטיק פיברוזיס (CF) היא הפרעה אוטוזומלית רצסיבית הנובעת ממוטציות בגן ויסות ההולכה של סיסטיק פיברוזיס טרנס-ממברנה (CFTR) המובילות להיעדר או תפקוד לקוי של חלבון CFTR, תעלת אניון הממוקמת במשטח האפיקלי של אפיתליה 1,2. ההתקדמות האחרונה בטיפול ב- CFTR שיפרה את הפרוגנוזה של המחלה, והתרופות המאושרות האחרונות המשלבות מתקנים של CFTR ופוטנציאטורים של CFTR הובילו לשיפורים משמעותיים בתפקוד הריאות ובאיכות החיים של חולי CF הנושאים את המוטציה השכיחה ביותר p.Phe508del מוטציה (F508del)3,4. למרות ההתקדמות הטיפולית המבטיחה הזו, כ-10% מחולי ה-CF אינם כשירים מכיוון שהם נושאים מוטציות שאינן ניתנות להסרה על ידי מודולטורים אלה של CFTR. עבור חולים אלה, יש צורך לבדוק תרופות אחרות או שילובי תרופות כדי למצוא את השילוב היעיל ביותר עבור מוטציות ספציפיות, מה שמדגיש את החשיבות של טיפולים מותאמים אישית.

קל לאסוף תאי אפיתל אף אנושיים (HNE) על ידי צחצוח אף פשוט ולא פולשני ומאפשרים כימות של הובלת כלוריד מחזורית בתיווך AMP (Cl−) כמדד לתפקוד CFTR. תאי HNE מניבים מודל מדויק של דרכי הנשימה האנושיות, אך תוחלת החיים שלהם מוגבלת בתרבית. הודות לאופטימיזציה של טכניקות תרבית, תאי HNE ראשוניים שמקורם בחולה ניתנים לתכנות מחדש באופן מותנה עם מעכב קינאז הקשור ל-Rho (ROCKi), להגבירם ולהבדילם לאפיתל פסאודו-מרובד בתנאי ממשק אוויר-נוזל (ALI) על מסננים מיקרו-נקבוביים 5,6. קיימים פרוטוקולי תרביות רבים לתרבית HNE (זמינים מסחרית, ללא סרום, "תוצרת בית", תרבית משותפת עם תאי הזנה וכו'), ובחירת תנאי המדיה והתרבית תוארו כמשפיעים על הגדילה, התמיינות אוכלוסיית התאים ותפקוד האפיתל 7,8. הפרוטוקול כאן מציג שיטת הגברה פשוטה, נטולת מזינים, ROCKi המאפשרת להשיג בהצלחה מספר רב של תאי HNE שמתמיינים לאחר מכן ב- ALI עבור מבחני תפקוד CFTR.

הראינו כי בתאי HNE ממוינים, טיפול של 48 שעות עם מודולטורים של CFTR מספיק כדי לגרום לתיקון אלקטרופיזיולוגי של זרם Cl- תלוי CFTR, וכי התיקון שנצפה במבחנה עשוי להיות בקורלציה עם השיפור הקליני של המטופל9. תאי HNE, אם כן, מייצגים מודל מתאים לא רק למחקרי CF בסיסיים אלא למחקרים פרה-קליניים עם בדיקות אפנון CFTR ספציפיות למטופל. בהקשר זה של טיפול מותאם אישית, מטרת הפרוטוקול הייתה לאמת שתאי HNE בהקפאה מחולי CF, שגדלו בתנאים שלנו, היו מודל מתאים למחקרי תיקון CFTR, וניתן היה לצפות לתוצאות דומות כאשר משווים את הובלת Cl התלויה ב- CFTR מתאים טריים ומופשרים קפואים. המחקר גם העריך את היעילות של אפנון CFTR שונים בעת שימוש בטיפולים כפולים ומשולשים.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות שתוארו על ידי הצהרת הלסינקי וחוק Huriet-Serusclat על אתיקה של מחקר אנושי.

1. הכנת צלוחיות ומדיה שונה

  1. הכן הגברה, אוויר-נוזל ואמצעי הקפאה כמתואר בטבלה 1.
  2. הכינו תמיסת מלאי של קולגן IV אנושי על ידי המסת 50 מ"ג קולגן ב-100 מ"ל של 0.2% חומצה אצטית קרחונית. מערבבים על מערבל מגנטי למשך שעה לפחות, ומסננים מעקרים את התמיסה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים בבקבוק זכוכית, המוגן מפני אור.
  3. הכינו תמיסת עבודה של קולגן IV על ידי דילול תמיסת המלאי 1:5 במים מזוקקים כפולים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  4. מצפים צלוחיות תרבית תאי פלסטיק או מסנני טרנסוול בתמיסת העבודה של הקולגן. פיזור שווה של 100 μL עבור 0.33 ס"מ2 מסנני טרנסוול, 500 μL עבור 2 צלוחיות 2 ס"מ2 ס"מ, ו-1 מ"ל עבור 75 ס"מ2 צלוחיות על כל משטח הצמיחה של הבקבוקון.
    הערה: ניתן להשיג זאת על ידי הטיה עדינה של הבקבוקון מצד לצד. לחלופין, כדי להקל על ציפוי הצלוחיות, ניתן להשתמש בנפח מוגבר, וכאשר כל המשטח מכוסה באופן שווה, תמיסת הקולגן שואפת להשאיר רק את הנפח המצוין. לאחר מכן ניתן להשתמש בתמיסת הקולגן השואפת באופן מיידי כדי לצפות את הבקבוקון הבא (כלומר, עבור שלושה צלוחיות 75 ס"מ2 , לפזר 3 מ"ל של תמיסת קולגן באופן שווה בבקבוק הראשון, לשאוף 2 מ"ל, אשר משמשים לאחר מכן עבור הבקבוקון הבא, וכן הלאה).
  5. השאירו את צלוחיות תרבית התאים באינקובטור למשך שעתיים לפחות או לילה. שאפו את הקולגן ביסודיות והשאירו את הצלוחיות לייבוש באינקובטור או מתחת למכסה המנוע למשך 20 דקות לפחות או לילה.
  6. יש לשטוף עם 10 מ"ל של Mg2+- ו-Ca2+DPBS ללא DPBS, לאפשר ייבוש באינקובטור ולאחסן בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור. אחסנו את הצלוחיות למשך עד 6 חודשים בטמפרטורת החדר (RT).

2. צחצוח אף

הערה: ודא כי צחצוח האף מבוצע בזמן שלמשתתף אין זיהום חריף. אם חולי CF מציגים זיהום ריאתי, יש לעיין באנטיביוגרמה של המטופל ולהוסיף אנטיביוטיקה נוספת למדיום ההגברה. תאי אפיתל האף האנושיים נאספו על ידי הברשה באף מחולי F508del/F508del כפי שתואר קודם לכן9.

  1. בקשו מהמטופל לפוצץ את האף, ואז להרדים באופן מקומי את הרירית של שני הנחיריים באמצעות רשתות כותנה ספוגות בקסילוקאין 5% עם תמיסת נפאזולין.
  2. מברישים בעדינות את הדופן המדיאלית ואת הטורבינאט הנחות של שני הנחיריים באמצעות מברשת ציטולוגיה. השרו את המברשת בצינור 15 מ"ל עם 2 מ"ל של מדיום שטיפה זמין מסחרית; לנער בעדינות כדי לנתק תאים. חוזרים על צחצוח בנחיר השני.
  3. הוסיפו את האנטיביוטיקה הבאה למדיום ההדחה: פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל), טזוצילין (10 מיקרוגרם/מ"ל), אמפוטריצין B (2.5 מיקרוגרם/מ"ל) וקולימיצין (16 מיקרוגרם/מ"ל).
    הערה: ניתן לשלוח מברשות לאף ב-RT למעבדות ייעודיות להרחבה ולתרבית, וניתן לזרוע אותן עד 72 שעות לאחר הצחצוח.

3. בידוד של HNE

הערה: HNE בודדו מהמברשת הציטולוגית, נשטפו עם Mg2+- ו-Ca2+-ללא DPBS, נותקו עם 0.25% טריפסין, ונזרעו על בקבוקון פלסטיק בגודל 25 ס"מ2 כפי שתואר קודם לכן10.

  1. נתקו את התאים ממברשת הציטולוגיה על ידי העברה חוזרת ונשנית של המברשת דרך חרוט פיפטה של 1000 μL ושטיפה עם 2 מ"ל של Mg2+- ו-Ca2+ללא DPBS. צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant.
  2. החייאת הכדור ב-0.25% טריפסין במשך 8-12 דקות כדי לנתק תאים. עצרו את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 5 מ"ל של מדיום ההגברה.
  3. צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant. משחזרים את הכדור ב-8 מ"ל של מדיום ההגברה וזורעים על בקבוקון מצופה קולגן בקוטר 25 ס"מ. הגדל ב-37 °C (84 °F) ו-5% CO2. זה מתאים לקטע 0.
  4. למחרת, החליפו את המדיום ב-5 מ"ל של מדיום הגברה טרייה ועקבו אחר התאים מדי יום לצורך התקשרות, מורפולוגיה (לתאים צריכה להיות מראה מרוצף מלוכד) ומספר.
    הערה: צפיפות הזריעה הראשונית משתנה בהתאם לאיכות צחצוח האף ולשיעור תאי האפיתל. תאי HNE מבודדים טריים מגיעים בדרך כלל למפגש של 80%-90% תוך 3-10 ימים. קצב גדילה איטי יותר מרמז על כך שאין מספיק תאי אפיתל בדגימה ויש להשליך אותם.

4. הגברה ומעבר של תאי אפיתל האף האנושיים

  1. לגדל תאי אפיתל אף אנושיים במדיום ההגברה ב-37°C ו-5% CO2 על צלוחיות מצופות קולגן עד למפגש של 80%-90%, תוך שינוי מדיום כל 48-72 שעות. עבור 25 ס"מ2 צלוחיות, השתמש 5 מ"ל של אמצעי הגברה ו 10 מ"ל עבור 75 ס"מ2 צלוחיות.
  2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%-90%, שטפו את התאים ב-10 מ"ל של Mg2+- ו-Ca2+-ללא DPBS, שאפו והשליכו.
  3. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין עבור בקבוקון 25 ס"מ2 (או 2 מ"ל של טריפסין עבור צלוחית 75 ס"מ2 ) וחזור לאינקובטור (37 °C , 5% CO2) למשך 8-12 דקות.
  4. הקש על הבקבוקון בחוזקה, עם כף היד, כדי לעזור לתאים להתנתק.
  5. הוסף 10 מ"ל של מדיום ההגברה כדי לעצור את התגובה האנזימטית. שוטפים במרץ את הבקבוקון, ומשתמשים בפיפטה של 10 מ"ל כדי למשוך ולגרש את מדיום ההגברה מעל משטח הבקבוקון כדי לשטוף ולנתק תאים.
  6. צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant.
  7. Resuspend את הכדור ב 5-10 מ"ל של מדיום ההגברה.
  8. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.
    הערה: ניתן להקפיא תאים בנקודה זו (ראה שלבים 5.1-5.3). אם נדרשת הגברה נוספת, זרעו מחדש על צלוחיות מצופות קולגן (ניתן להרחיב צלוחית25 ס"מ 2 לשלוש צלוחיות 75 ס"מ2 , לא מומלץ דילול גדול יותר).

5. שימור בהקפאה של תאי אפיתל ראשוניים באף

הערה: לגדל תאי HNE עד מעבר 1 לפני הביו-בנק כדי להשיג מספיק תאים כדי להקל על צמיחת התאים בעת הפשרתם. עם זאת, ביובנקינג אפשרי במעבר ראשוני 0 או במעבר 2. שלבי ההקפאה הבאים מותאמים לכל הקטעים.

  1. לאחר ספירת התאים, צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C ,ו להשליך את supernatant
  2. יש לבצע החייאה של הכדור בתווך ההקפאה המועשר (טבלה 1) כדי לקבל 3 x 106-5 x 106 תאים למ"ל ולכל קריוביאל.
  3. הקפיאו באיטיות את התאים על ידי הפחתת הטמפרטורה בטמפרטורה של כ-1 מעלות צלזיוס לדקה במיכל מקפיא קריו מתאים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הדגימה המשומרת למיכל אחסון חנקן לאחסון לטווח ארוך (המחקר הנוכחי מוגבל ל-17 חודשי אחסון).

6. הפשרת תאי HNE מוגברים קפואים

  1. חממו את אמבט המים ל-37 מעלות צלזיוס. הכינו את מדיום ההגברה כמתואר בטבלה 1 וחממו את המדיום ל-37 מעלות צלזיוס.
  2. מוציאים את הקריוביציאלים ממיכל אחסון החנקן ומניחים אותם במהירות באמבט המים, תוך הקפדה שלא להטביע את כל הבקבוקון במים. מוציאים את הקריוביצ'ים מאמבטיית המים כאשר נותרה רק טיפה קפואה קטנה. נגבו את הבקבוקון ב-70% אלכוהול, נגבו את הייבוש והניחו מתחת למכסה המנוע.
  3. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, מעבירים את התאים המופשרים לצינור ריק של 15 מ"ל.
  4. באופן טיפתי, הוסיפו 1 מ"ל של מדיום הגברה חמה. לאחר דקה אחת, מוסיפים עוד 1 מ"ל של מדיום הגברה ומחכים דקה נוספת.
  5. הוסף 10 מ"ל של מדיום ההגברה וצנטריפוגה למשך 2 דקות ב 500 x g.
  6. לשאוף ולהשליך את ה-supernatant. בצעו החייאה של כדור התא בנפח של מדיום הגברה הנדרש כדי להשיג צפיפות תאים של לפחות 1 x 106 תאים/מ"ל.
  7. זרעו את התאים על גבי בקבוקון מצופה קולגן המכיל את מדיום ההגברה.
    1. אם הקריוביט מכיל יותר מ-4 x 106 תאים, זרע על בקבוקון 75 ס"מ2 , ב-10 מ"ל של מדיום ההגברה
    2. אם cryovial מכיל פחות מ-4 x 106 תאים, תאי זרעים על בקבוקון 25 ס"מ2 , ב-5 מ"ל של מדיום ההגברה
  8. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, וצפו באופן חזותי בהתפשטות התאים במהלך 2-3 הימים הבאים.
  9. לאחר מכן, בצע הגברה של התא כמפורט בסעיף 4.
    הערה: אם מעט תאים נקטפו בשלב 4.7. (כלומר, אם מקפיאים במעבר 0 לפני ההרחבה), שלבים 6.5. ו-6.6. ניתן להשמיט, וניתן לזרוע תאים ישירות על בקבוקון מצופה קולגן בגודל25 ס"מ 2 ללא צנטריפוגה. לאחר מכן יש לשנות את המדיום למחרת כדי להסיר את דימתיל סולפוקסיד (DMSO).

7. התמיינות של תאי אפיתל האף האנושיים בממשק אוויר-נוזל

הערה: HNE נבדלו בממשק האוויר-נוזל כפי שתואר קודם לכן10.

  1. זרעו את התאים בצפיפות של 330,000 תאים/מסנן על מסננים נקבוביים מצופים קולגןבקוטר 0.33 ס"מ 2 ותוספילים עם 300 μL של מדיום ההגברה בצד האפי ו-900 μL של התווך הנוזלי-אוויר בצד הבזולטרלי.
  2. לאחר 3 ימים, שאפו את המדיום האפיקלי ותרבו את התאים בממשק אוויר-נוזל למשך 3-4 שבועות בתווך האוויר-נוזלי כדי ליצור אפיתל ממוין. שנה את המדיום הבסיסי כל 48-72 שעות.

8. מודולטורים של CFTR

  1. הכן מדיום אוויר-נוזלי המכיל אפנני CFTR. השתמש ב- VX-445, VX-661 ו- VX-809 בריכוז סופי של 3 μM ו- VX-770 ב- 100 ננומטר. השתמש במתקן ABBV-2222 בריכוז סופי של 1 μM ובפוטנציאטור ABBV-974 ב- 10 μM. השתמש ב- 100% DMSO כדי להמיס את כל אפנן CFTR.
  2. הכן מדיום נוזלי-אוויר המכיל את אותה כמות של 100% DMSO כמו במדיום מתקן.
  3. הוסיפו את המדיום המכיל תרופות או DMSO לצד הבזולטרלי של תאי HNE מקוטבים הגדלים בממשק אוויר-נוזל ודגרו במשך 24 שעות ב-5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר 24 שעות, שאפו והשליכו את המדיום והחליפו במדיום טרי שהוכן כמו בשלבים 8.1-8.2., ודגירה נוספת לתקופה של 24 שעות ב-5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.

9. לימוד חדרים

  1. מדוד מדידות זרם קצר חשמלי (Isc) בתנאי מהדק מתח כפי שתואר קודם לכן9.
    הערה: התנגדות חשמלית טרנס-פיתלית (TEER) של תרביות נמדדה באמצעות מד מתח של מקלות אכילה, ורק תרביות שהגיעו לפחות ל-200 Ω·cm2 נחשבו לניסויים הבאים. מסננים של תאי HNE מקוטבים הותקנו בתאי Ussing, ומדידות זרם קצר חשמלי (Isc) נמדדו בתנאי מהדק מתח.

10. אימונוציטוכימיה

  1. בצע זיהוי חיסוני כפי שתואר קודם לכן9.
    הערה: זיהוי חיסוני CFTR בוצע באמצעות הנוגדן החד-שבטי נגד CFTR C-terminal (24-1) במהלך הלילה בדילול של 1/100. Zona-occludens-1 (ZO-1) (דילול 1/500), אלפא-טובולין (דילול 1/300), Muc 5AC (דילול 1/250) וצביעת ציטוקראטין 8 (דילול 1/250) נעשו על מסננים נוספים. לאחר שטיפה עם PBS-Triton-X100 0.1%, נוספו נוגדנים משניים לעזים שהוצמדו לאלקסה 488 או 594 במשך 30 דקות בסרום עיזים של 10% (1/1000 דילול). לאחר שטיפה אחרונה, מסננים נחתכו מתמיכה והותקנו עם מדיום הרכבה Vectashield המכיל DAPI. מיקרוסקופ קונפוקלי (63x/1.4 ניגוד הפרעות דיפרנציאליות שמן λ כחול PL APO המטרה) שימש ללכידת תמונות, אשר נותחו באמצעות תוכנת ImageJ.

11. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה מתאימה.
    הערה: ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות תוכנת S.A.S. מכיוון שהתקבלו מספר מסנני HNE לכל מטופל ולכל מצב, פרמטרים כמותיים התבטאו כערכים חציוניים (± SEM) לכל מטופל. ההשוואות (ממוצעות ± SD) בוצעו באמצעות מבחן דירוג של זוגות תואמי Wilcoxon או מבחן t לא מזווג.

תוצאות

תאי HNE טריים בתרבית בממשק אוויר-נוזל מציגים תכונות אופייניות של אפיתל הנשימה המקוטב והמובחנות כפי שהוערכו על ידי חיסון(איור 1). תאי HNE מתמיינים מחדש לשכבה הטרוגנית של תאי אפיתל (חיסון קרטין חיובי 8) המחקים את המצב in vivo של אפיתל נשימתי מדומה-מרובד המורכב מכתם ציליאטי (צביע...

Discussion

השימוש בתאי אפיתל האף שמקורם בחולה כפונדקאים לתאי אפיתל הסימפונות האנושיים (HBE) למדידת פעילות CFTR בהקשר של רפואה מותאמת אישית הוצע כמאפיינים של תאי שכפול HNE בתרבית 9,11. היתרון החזק של HNE על פני תרביות תאי HBE הוא שהן נדגמות בקלות ובאופן לא פולשני. מדידות זרם קצר ח...

Disclosures

המחברים אינם מדווחים על אינטרסים כלכליים מתחרים הקשורים לפרסום זה או להפקת וידאו מדעית.

Acknowledgements

אנו מודים בחום לכל המטופלים ובני משפחותיהם על השתתפותם במחקר. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של האגודה הצרפתית Vaincre la Mucoviscidose; האגודה הצרפתית ABCF 2 ופרסי החדשנות של Vertex Pharmaceuticals.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ABBV-2222SelleckchemS8535
ABBV-974SelleckchemS8698
Advanced DMEM/F-12Life Technologies12634010
Alexa 488 goat secondary antibodyInvitrogenA11001
Alexa 594 goat secondary antibodyInvitrogenA11012
Amphotericin BLife Technologies15290026
Anti-alpha-tubulin antibodyAbcamab80779
Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)R&D SystemsMAB25031
Anti-cytokeratin 8 antibodyProgen61038
Anti-Muc5AC antibodySanta Cruz Biotechsc-20118
Anti-ZO-1 antibodySanta Cruz Biotechsc-10804
Ciprofloxacinprovided by Necker Hospital Pharmacy
ColimycinSanofiprovided by Necker Hospital Pharmacy
Collagen type IVSigma-Aldrich MerckC-7521
cytology brushLaboratory GYNEAS02.104
DMSOSigma-Aldrich MerckD2650
EGFLife TechnologiesPHG0311
EpinephrinSigma-Aldrich MerckE4375
F12-Nutrient MixtureLife Technologies11765054
FBSLife Technologies10270106
FerticultFertipro NVFLUSH020
Flasks 25Thermo Scientific156.367
Flasks 75Thermo Scientific156.499
Glacial acetic acidVWR20104.298
HEPESSigma-Aldrich MerckH3375
HydrocortisoneSigma-Aldrich MerckSLCJ0893
InsulinSigma-Aldrich MerckI0516
Mg2+ and Ca2+-free DPBSLife Technologies14190094
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140130
TazocillinMylanprovided by Necker Hospital Pharmacy
Transwell FiltersSigma-Aldrich MerckCLS3470-48EA
Triton-X100Sigma-Aldrich MerckT8787
Trypsin 0,25%Life Technologies25200056
Vectashield mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
VX-445SelleckchemS8851
VX-661SelleckchemS7059
VX-770SelleckchemS1144
VX-809SelleckchemS1565
Xylocaine naphazoline 5%Aspen Franceprovided by Necker Hospital Pharmacy
Y-27632SelleckchemS1049

References

  1. Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
  2. Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
  3. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
  4. Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
  5. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
  6. Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
  7. Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
  8. Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
  9. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
  10. Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
  11. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
  12. Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
  13. de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
  14. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
  15. McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
  16. Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
  17. Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
  18. Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
  19. Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
  20. Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
  21. Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
  22. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
  23. Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
  24. Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
  25. Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
  26. Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
  27. Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
  28. Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
  29. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
  30. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).
  31. Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182cftr

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved