JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем выделение, усиление и дифференцировку первичных эпителиальных клеток носа человека (HNE) на границе раздела воздух-жидкость и протокол биобанкинга, позволяющий успешно замораживать, а затем размораживать усиленный HNE. Протокол анализирует электрофизиологические свойства дифференцированных клеток HNE и связанную с CFTR коррекцию секреции хлорида при различных модуляторных обработках.

Аннотация

Клетки эпителия носа человека (HNE) легко собрать с помощью простой, неинвазивной чистки носа. Полученные от пациента первичные клетки HNE могут быть усилены и дифференцированы в псевдостратифицированный эпителий в условиях взаимодействия воздух-жидкость для количественной оценки циклического переноса хлорида (Cl-), опосредованного AMP, в качестве индекса функции регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR). Если критические шаги, такие как качество чистки носа и плотность клеток при криоконсервации, выполняются эффективно, клетки HNE могут быть успешно биобанкированы. Кроме того, исследования тока короткого замыкания показывают, что замораживание-оттаивание существенно не изменяет электрофизиологические свойства HNE-клеток и реакцию на модуляторы CFTR. В условиях культивирования, используемых в этом исследовании, когда замораживаются менее 2 х 106 клеток на криовиал, частота отказов очень высока. Мы рекомендуем замораживать не менее 3 х 106 клеток на криовиал. Показано, что двойные методы лечения, сочетающие корректор CFTR с потенциатором CFTR, имеют сопоставимую эффективность коррекции активности CFTR в F508del-гомозиготных клетках HNE. Тройная терапия VX-445 + VX-661 + VX-770 значительно увеличила коррекцию активности CFTR по сравнению с двойной терапией VX-809 + VX-770. Измерение активности CFTR в клетках HNE является многообещающим доклиническим биомаркером, полезным для руководства модуляторной терапией CFTR.

Введение

Муковисцидоз (CF) является аутосомно-рецессивным расстройством, возникающим в результате мутаций в гене регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR), приводящих к отсутствию или дисфункции белка CFTR, анионного канала, расположенного на апикальной поверхности эпителия 1,2. Последние достижения в терапии CFTR улучшили прогноз заболевания, а последние одобренные препараты, сочетающие корректоры CFTR и потенциаторы CFTR, привели к значительному улучшению функции легких и качества жизни пациентов с муковисцидозом, несущих наиболее частую мутацию p.Phe508del (F508del)3,4. Несмотря на этот многообещающий терапевтический прогресс, около 10% пациентов с муковисцидозом не имеют права на участие, поскольку они несут мутации, которые не могут быть спасены этими модуляторами CFTR. Для этих пациентов необходимо протестировать другие лекарства или комбинации лекарств, чтобы найти наиболее эффективную комбинацию для конкретных мутаций, подчеркивая важность персонализированной терапии.

Клетки эпителия носа человека (HNE) легко собираются с помощью простой, неинвазивной чистки носа и позволяют количественно оценивать циклический транспорт хлорида (Cl−), опосредованный AMP, как индекс функции CFTR. Клетки HNE дают точную модель дыхательных путей человека, но их продолжительность жизни ограничена в культуре. Благодаря оптимизации методов культивирования полученные от пациента первичные клетки HNE могут быть условно перепрограммированы ингибитором Rho-ассоциированной киназы (ROCKi), усилены и дифференцированы в псевдостратифицированный эпителий в условиях воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) на микропористых фильтрах 5,6. Существуют многочисленные протоколы культивирования для культуры HNE (коммерчески доступные, без сыворотки, «домашние», совместные культуры с фидерными клетками и т. Д.), И был описан выбор среды и условий культивирования, влияющих на рост, дифференцировку клеточной популяции и функцию эпителия 7,8. Протокол здесь представляет упрощенный, не содержащий фидера метод амплификации ROCKi, который позволяет успешно получить большое количество HNE-клеток, которые затем дифференцируются в ALI для анализа функции CFTR.

Мы продемонстрировали, что в дифференцированных клетках HNE 48-часовое лечение модуляторами CFTR является достаточным для индуцирования электрофизиологической коррекции CL-тока , зависящего от CFTR, и что коррекция, наблюдаемая in vitro , может коррелировать с клиническим улучшением пациента9. Таким образом, клетки HNE представляют собой подходящую модель не только для фундаментальных исследований муковисцидоза, но и для доклинических исследований с тестированием модулятора CFTR для конкретного пациента. В этом контексте персонализированной терапии цель протокола состояла в том, чтобы подтвердить, что криоконсервированные клетки HNE у пациентов с муковисцидозом, выращенные в наших условиях, были подходящей моделью для исследований коррекции CFTR, и аналогичные результаты можно было ожидать при сравнении CFTR-зависимого Cl-транспорта из свежих и замороженных размороженных клеток. В исследовании также оценивалась эффективность различных модуляторов CFTR при использовании двойной и тройной терапии.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами и правилами, описанными в Хельсинкской декларации и законе Хуриета-Серуслата об этике исследований человека.

1. Приготовление колб и различных сред

  1. Подготовьте амплификацию, воздушно-жидкую и морозильную среду, как описано в таблице 1.
  2. Готовят готовый раствор человеческого коллагена IV путем растворения 50 мг коллагена в 100 мл 0,2% ледниковой уксусной кислоты. Перемешать на магнитной мешалке не менее 1 ч, а раствор стерилизовать фильтром. Хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев в стеклянной бутылке, защищенной от света.
  3. Готовят рабочий раствор коллагена IV путем разведения бульонного раствора 1:5 в двухдистиллированной воде. Хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.
  4. Покройте пластиковые колбы для культивирования клеток или трансвелл-фильтры рабочим раствором коллагена. Равномерно распределите 100 мкл на 0,33 см2 трансвелл-фильтра, 500 мкл на25 см 2 колбы и 1 мл на 75 см 2 колбы навсю поверхность роста колбы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этого можно достичь, осторожно наклонив колбу из стороны в сторону. Альтернативно, для облегчения покрытия колб можно использовать увеличенный объем, а когда вся поверхность равномерно покрыта, раствор коллагена аспирируют, чтобы оставить только указанный объем. Аспирированный раствор коллагена затем можно сразу же использовать для покрытия следующей колбы (т.е. для трех колбразмером 75 см 2 равномерно распределить 3 мл раствора коллагена в первой колбе, аспирировать 2 мл, которые затем используют для следующей колбы и так далее).
  5. Оставьте колбы для посева клеток в инкубаторе минимум на 2 ч или на ночь. Тщательно аспирируйте коллаген и оставьте колбы сохнуть в инкубаторе или под капюшоном минимум на 20 минут или на ночь.
  6. Промыть 10 мл Mg2+ и Ca2+ без DPBS, дать высохнуть в инкубаторе и хранить в алюминиевой фольге для защиты от света. Хранить колбы до 6 месяцев при комнатной температуре (RT).

2. Расчесывание носа

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что расчесывание носа выполняется, пока у участника нет острой инфекции. Если у пациентов с муковисцидозом присутствует легочная инфекция, обратитесь к антибиотикограмме пациента и добавьте дополнительные антибиотики в амплификационную среду. Эпителиальные клетки носа человека были собраны путем чистки носа у пациентов F508del/F508del, как описано ранее9.

  1. Попросите больного сморкаться, затем местно обезболить слизистую оболочку обеих ноздрей с помощью ватных сеток, смоченных в 5% ксилокаине раствором нафазолина.
  2. Аккуратно расчешите медиальную стенку и нижнюю носовую раковину обеих ноздрей с помощью цитологической щетки. Замочите щетку в пробирке объемом 15 мл с 2 мл коммерчески доступной промывочной среды; аккуратно встряхните, чтобы отсоединить клетки. Повторите расчесывание во второй ноздре.
  3. Добавьте следующие антибиотики в промывочную среду: пенициллин (100 Ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), тазоциллин (10 мкг/мл), амфотерицин В (2,5 мкг/мл) и колимицин (16 мкг/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Носовые щетки могут быть отправлены в RT в специализированные лаборатории для расширения и культивирования и могут быть посеяны до 72 ч после чистки щеткой.

3. Изоляция HNE

ПРИМЕЧАНИЕ: HNE выделяли из цитологической щетки, промывали Mg2+ и Ca2+ dpBS, диссоциировали с 0,25% трипсина и высевали на пластиковую колбу размером 25см2 , как описано ранее10.

  1. Отделите клетки от цитологической щетки, многократно пропуская щетку через конус пипетки 1000 мкл и промывая 2 мл Mg2+ и Ca2+ без DPBS. Центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант.
  2. Повторно суспендируют гранулу в 0,25% трипсина в течение 8-12 мин для диссоциации клеток. Остановить ферментативную реакцию путем добавления 5 мл амплификационной среды.
  3. Центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант. Повторно суспендируйте гранулы в 8 мл амплификационной среды и помейте в колбу с коллагеновым покрытиемобъемом 25 см2 . Растут при 37 °C и 5% CO2. Это соответствует отрывку 0.
  4. На следующий день замените среду 5 мл свежей амплификационной среды и ежедневно контролируйте клетки на предмет прикрепления, морфологии (клетки должны иметь сплоченный булыжный вид) и количества.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начальная плотность посева варьируется в зависимости от качества расчесывания носа и доли эпителиальных клеток. Свежеизолированные клетки HNE обычно достигают 80%-90% конфлюзии в течение 3-10 дней. Более медленная скорость роста наводит на мысль о недостаточном количестве эпителиальных клеток в образце и должна быть отброшена.

4. Усиление и прохождение эпителиальных клеток носа человека

  1. Выращивают эпителиальные клетки носа человека в среде амплификации при 37 °C и 5% CO2 на колбах, покрытых коллагеном, до 80%-90% конфлюзии, меняя среду каждые 48-72 ч. Для колб размером25 см 2 используйте 5 мл амплификационной среды и 10 мл для колб размером 75см2 .
  2. Когда клетки достигнут 80%-90% конфлюзии, промыть клетки 10 мл Mg2+- и Ca2+ свободных DPBS, аспиратом и выбросить.
  3. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина на колбу 25см2 (или 2 мл трипсина на колбу 75см2 ) и верните в инкубатор (37 °C, 5% CO2) в течение 8-12 мин.
  4. Плотно постучите по колбе ладонью, чтобы помочь клеткам отсоединиться.
  5. Добавьте 10 мл амплификационной среды, чтобы остановить ферментативную реакцию. Энергично промойте колбу, используя пипетку объемом 10 мл, чтобы вытянуть и вывести амплификационную среду по поверхности колбы для промывки и отсоединения клеток.
  6. Центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант.
  7. Повторно суспендировать гранулу в 5-10 мл амплификационной среды.
  8. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки могут быть заморожены (см. шаги 5.1-5.3). Если требуется дальнейшее усиление, повторно посейте на колбы, покрытые коллагеном (колбуразмером 25 см2 можно расширить на три колбы размером 75см2 , большее разбавление не рекомендуется).

5. Криоконсервация первичных эпителиальных клеток носа

ПРИМЕЧАНИЕ: Выращивайте клетки HNE до прохождения 1 перед биобанкингом, чтобы получить достаточное количество клеток для облегчения роста клеток при оттаивании. Биобанкинг, однако, возможен при начальном прохождении 0 или прохождении 2. Следующие этапы криоконсервации адаптированы ко всем проходам.

  1. После подсчета клеток центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант
  2. Повторно суспендируют гранулу в обогащенной морозильной среде (таблица 1) с получением 3 х 106-5 х 106 клеток на мл и на криовиал.
  3. Медленно замораживайте клетки, снижая температуру при ~1 °C в минуту в соответствующем криозамораживающем контейнере при -80 °C. На следующий день переместите сохраненный образец в контейнер для хранения азота для длительного хранения (настоящее исследование ограничено 17 месяцами хранения).

6. Оттаивание замороженных амплифицированных HNE клеток

  1. Разогрейте водяную баню до 37 °C. Подготовьте амплификационную среду, как описано в таблице 1 , и нагрейте среду до 37 °C.
  2. Извлеките криовиалы из резервуара для хранения азота и быстро поместите их на водяную баню, следя за тем, чтобы не погрузить весь флакон в воду. Удалите криовиалы с водяной бани, когда останется только небольшая замороженная капля. Протрите флакон 70% спиртом, вытрите насухо и поместите под капот.
  3. Используя пипетку 1 мл, переместите размороженные клетки в пустую трубку объемом 15 мл.
  4. По каплям добавьте 1 мл теплой амплификационной среды. Через 1 мин добавьте еще 1 мл амплификационной среды и подождите еще минуту.
  5. Добавьте 10 мл амплификационной среды и центрифуги в течение 2 мин при 500 х г.
  6. Аспирировать и выбросить супернатант. Повторное суспендирование клеточной гранулы в объеме амплификационной среды, необходимом для достижения плотности ячейки не менее 1 х 106 ячеек/мл.
  7. Поместите клетки в колбу, покрытую коллагеном, содержащую амплификационную среду.
    1. Если криовиал содержит более 4 х 106 клеток, посейте в колбу размером 75см2 в 10 мл амплификационной среды
    2. Если криовиал содержит менее 4 х 106 клеток, семенные клетки на колбуразмером 25 см2 , в 5 мл амплификационной среды
  8. Инкубируют при 37 °C, 5% CO2 и визуально наблюдают расширение клеток в течение следующих 2-3 дней.
  9. Затем выполните амплификацию клеток, как описано в разделе 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если на этапе 4.7 было собрано несколько клеток. (т.е. если замораживание в проходе 0 перед расширением), этапы 6.5. и 6.6. могут быть опущены, а клетки могут быть посеяны непосредственно на колбу с коллагеновым покрытием25 см2 без центрифугирования. Затем среду необходимо заменить на следующий день, чтобы удалить диметилсульфоксид (ДМСО).

7. Дифференцировка эпителиальных клеток носа человека на границе воздух-жидкость

ПРИМЕЧАНИЕ: HNE были дифференцированы на границе раздела воздух-жидкость, как описано ранее10.

  1. Засейте клетки плотностью 330 000 клеток/фильтр на 0,33см2 коллагеновых пористых фильтрах и дополните 300 мкл амплификационной среды на апикальной стороне и 900 мкл воздушно-жидкой среды на базолатеральной стороне.
  2. Через 3 дня аспирируют аспиральную среду и культивируют клетки на границе раздела воздух-жидкость в течение 3-4 недель в воздушно-жидкой среде для создания дифференцированного эпителия. Менять базальную среду каждые 48-72 ч.

8. МОДУЛЯТОРЫ CFTR

  1. Готовят воздушно-жидкую среду, содержащую МОДУЛЯТОРЫ CFTR. Используйте VX-445, VX-661 и VX-809 в конечной концентрации 3 мкМ и VX-770 при 100 нМ. Используйте корректор ABBV-2222 при конечной концентрации 1 мкМ и потенциатор ABBV-974 при 10 мкМ. Используйте 100% DMSO для растворения всех модуляторов CFTR.
  2. Готовят воздушно-жидкую среду, содержащую такое же количество 100% ДМСО, как и в корректирующей среде.
  3. Добавляют среду, содержащую лекарственные средства или ДМСО, к базолатеральной стороне поляризованных HNE-клеток, выращенных на границе раздела воздух-жидкость, и инкубируют в течение 24 ч в 5% CO2 при 37°C.
  4. Через 24 ч аспирируют и выбрасывают среду и заменяют свежей средой, приготовленной как на этапах 8.1-8.2,, и далее инкубируют в течение 24 ч в 5% CO2 при 37°С.

9. Использование камерных исследований

  1. Измерение тока короткого замыкания (Isc) в условиях зажима напряжения, как описано ранее9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) культур измеряли с помощью вольтметра для еды, и только культуры, достигающие не менее 200 Ω·см2 , рассматривались для следующих экспериментов. В камерах Ussing были установлены фильтры поляризованных HNE-ячеек, а измерения тока короткого замыкания (Isc) измерялись в условиях напряжения-зажима.

10. Иммуноцитохимия

  1. Выполняют иммунодетекторию, как описано ранее9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунодетектирование CFTR проводили с использованием анти-CFTR C-концевых (24-1) моноклональных антител в течение ночи в разведении 1/100. Зона-окклюдены-1 (ZO-1) (разведение 1/500), альфа-тубулин (разведение 1/300), Muc 5AC (разведение 1/250) и цитокератин 8 (разведение 1/250) проводились на дополнительных фильтрах. После промывки PBS-Triton-X100 0,1% козеляные вторичные антитела, конъюгированные с Alexa 488 или 594, добавляли в течение 30 мин в 10% козьей сыворотке (1/1000 разведение). После окончательной промывки фильтры были вырезаны из опоры и смонтированы с монтажным носителем Vectashield, содержащим DAPI. Конфокальный микроскоп (63x/1.4 масляный дифференциальный интерференционный контраст λ синий объектив PL APO) использовался для захвата изображений, которые анализировались с помощью программного обеспечения ImageJ.

11. Статистический анализ

  1. Выполняйте статистический анализ с помощью соответствующего программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения S.A.S. Поскольку было получено несколько фильтров HNE на пациента и на каждое состояние, количественные параметры были выражены в виде медианных значений (± SEM) на пациента. Сравнения (среднее ± SD) проводились с использованием уилкоксоновских пар, подписанных ранговым тестом или непарным t-тестом.

Результаты

Свежие клетки HNE, культивируемые на границе раздела воздух-жидкость, демонстрируют типичные особенности поляризованного и дифференцированного респираторного эпителия, оцениваемые иммуноокрашиванием (рисунок 1). Клетки HNE повторно дифференцируются в гетерогенный слой...

Обсуждение

Было предложено использование носовых эпителиальных клеток, полученных от пациента, в качестве суррогатов эпителиальных клеток бронхов человека (HBE) для измерения активности CFTR в контексте персонализированной медицины, поскольку свойства клеток HNE воспроизводят в культуре

Раскрытие информации

Авторы сообщают об отсутствии конкурирующих финансовых интересов, связанных с этой публикацией или производством научного видео.

Благодарности

Мы тепло благодарим всех пациентов и их семьи за участие в исследовании. Эта работа была поддержана грантами Французской ассоциации Vaincre la Mucoviscidose; Французская ассоциация ABCF 2 и Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ABBV-2222SelleckchemS8535
ABBV-974SelleckchemS8698
Advanced DMEM/F-12Life Technologies12634010
Alexa 488 goat secondary antibodyInvitrogenA11001
Alexa 594 goat secondary antibodyInvitrogenA11012
Amphotericin BLife Technologies15290026
Anti-alpha-tubulin antibodyAbcamab80779
Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)R&D SystemsMAB25031
Anti-cytokeratin 8 antibodyProgen61038
Anti-Muc5AC antibodySanta Cruz Biotechsc-20118
Anti-ZO-1 antibodySanta Cruz Biotechsc-10804
Ciprofloxacinprovided by Necker Hospital Pharmacy
ColimycinSanofiprovided by Necker Hospital Pharmacy
Collagen type IVSigma-Aldrich MerckC-7521
cytology brushLaboratory GYNEAS02.104
DMSOSigma-Aldrich MerckD2650
EGFLife TechnologiesPHG0311
EpinephrinSigma-Aldrich MerckE4375
F12-Nutrient MixtureLife Technologies11765054
FBSLife Technologies10270106
FerticultFertipro NVFLUSH020
Flasks 25Thermo Scientific156.367
Flasks 75Thermo Scientific156.499
Glacial acetic acidVWR20104.298
HEPESSigma-Aldrich MerckH3375
HydrocortisoneSigma-Aldrich MerckSLCJ0893
InsulinSigma-Aldrich MerckI0516
Mg2+ and Ca2+-free DPBSLife Technologies14190094
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140130
TazocillinMylanprovided by Necker Hospital Pharmacy
Transwell FiltersSigma-Aldrich MerckCLS3470-48EA
Triton-X100Sigma-Aldrich MerckT8787
Trypsin 0,25%Life Technologies25200056
Vectashield mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
VX-445SelleckchemS8851
VX-661SelleckchemS7059
VX-770SelleckchemS1144
VX-809SelleckchemS1565
Xylocaine naphazoline 5%Aspen Franceprovided by Necker Hospital Pharmacy
Y-27632SelleckchemS1049

Ссылки

  1. Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
  2. Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
  3. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
  4. Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
  5. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
  6. Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
  7. Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
  8. Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
  9. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
  10. Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
  11. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
  12. Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
  13. de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
  14. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
  15. McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
  16. Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
  17. Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
  18. Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
  19. Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
  20. Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
  21. Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
  22. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
  23. Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
  24. Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
  25. Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
  26. Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
  27. Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
  28. Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
  29. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
  30. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).
  31. Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182CFTR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены