JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, hava-sıvı arayüzünde primer insan nazal epitel (HNE) hücrelerinin izolasyonu, amplifikasyonu ve farklılaşması ve güçlendirilmiş HNE'nin başarılı bir şekilde dondurulmasına ve daha sonra çözülmesine izin veren bir biyobankacılık protokolü açıklanmaktadır. Protokol, farklılaşmış HNE hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini ve farklı modülatör tedavileri üzerine CFTR ile ilişkili klorür sekresyon düzeltmesini analiz eder.

Özet

İnsan nazal epitel (HNE) hücrelerinin basit, invaziv olmayan nazal fırçalama ile toplanması kolaydır. Hasta kaynaklı primer HNE hücreleri, Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) fonksiyonunun bir indeksi olarak siklik AMP aracılı Klorür (Cl-) taşınımını ölçmek için hava-sıvı arayüz koşullarında psödo-tabakalı bir epitel haline getirilebilir ve farklılaştırılabilir. Burun fırçalama kalitesi ve kriyoprezervasyonda hücre yoğunluğu gibi kritik adımlar verimli bir şekilde gerçekleştirilirse, HNE hücreleri başarılı bir şekilde biyobankaya yatırılabilir. Ayrıca, kısa devre akım çalışmaları, donarak çözülmenin HNE hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini ve CFTR modülatörlerine tepkisini önemli ölçüde değiştirmediğini göstermektedir. Bu çalışmada kullanılan kültür koşullarında, kriyov başına 2 x 106'dan az hücre dondurulduğunda, başarısızlık oranı çok yüksektir. Kriyov başına en az 3 x 106 hücre dondurmanızı öneririz. Bir CFTR düzelticisini bir CFTR güçlendiricisi ile birleştiren ikili tedavilerin, F508del-homozigot HNE hücrelerinde CFTR aktivitesi için karşılaştırılabilir bir düzeltme etkinliğine sahip olduğunu gösteriyoruz. Üçlü terapi VX-445 + VX-661 + VX-770, ikili terapi VX-809 + VX-770'e kıyasla CFTR aktivitesinin düzeltilmesini önemli ölçüde arttırmıştır. HNE hücrelerinde CFTR aktivitesinin ölçülmesi, CFTR modülatör tedavisine rehberlik etmek için yararlı olan umut verici bir klinik öncesi biyobelirteçtir.

Giriş

Kistik Fibrozis (KF), Epitel 1,2'nin apikal yüzeyinde bulunan bir anyon kanalı olan CFTR proteininin yokluğuna veya işlev bozukluğuna yol açan Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) genindeki mutasyonlardan kaynaklanan otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. CFTR tedavisindeki son gelişmeler hastalığın prognozunu iyileştirmiş ve CFTR düzelticileri ile CFTR güçlendiricilerini birleştiren son onaylanmış ilaçlar, en sık görülen p.Phe508del mutasyonu (F508del)3,4 mutasyonunu taşıyan KF hastalarında akciğer fonksiyonlarında ve yaşam kalitesinde önemli iyileşmelere yol açmıştır. Bu umut verici terapötik ilerlemeye rağmen, KF hastalarının yaklaşık% 10'u, bu CFTR modülatörleri tarafından kurtarılamayan mutasyonlar taşıdıkları için uygun değildir. Bu hastalar için, spesifik mutasyonlar için en etkili kombinasyonu bulmak için diğer ilaçları veya ilaç kombinasyonlarını test etmeye ihtiyaç vardır ve kişiselleştirilmiş tedavilerin önemini vurgulamaktadır.

İnsan nazal epitel (HNE) hücrelerinin basit, invaziv olmayan nazal fırçalama ile toplanması kolaydır ve CFTR fonksiyonunun bir indeksi olarak siklik AMP aracılı Klorür (Cl−) transportunun nicelleştirilmesine izin verir. HNE hücreleri, insan hava yolunun doğru bir modelini verir, ancak ömürleri kültürde sınırlıdır. Kültür tekniklerinin optimizasyonu sayesinde, hasta kaynaklı primer HNE hücreleri, Rho ile ilişkili kinaz inhibitörü (ROCKi) ile şartlı olarak yeniden programlanabilir, çoğaltılabilir ve mikro gözenekli filtrelerüzerindeki hava-sıvı arayüzü (ALI) koşullarında psödo-tabakalaşmış bir epitel haline getirilebilir 5,6. HNE kültürü için çok sayıda kültür protokolü mevcuttur (ticari olarak temin edilebilir, serumsuz, "ev yapımı", besleyici hücrelerle ortak kültür, vb.) ve büyümeyi, hücre popülasyonu farklılaşmasını ve epitel fonksiyonunu etkileyecek şekilde medya ve kültür koşullarının seçimi tanımlanmıştır 7,8. Buradaki protokol, CFTR fonksiyon tahlilleri için ALI'de farklılaştırılan çok sayıda HNE hücresinin başarılı bir şekilde elde edilmesini sağlayan basitleştirilmiş, besleyicisiz, ROCKi amplifikasyon yöntemi sunar.

Diferansiye HNE hücrelerinde, CFTR modülatörleri ile 48 saatlik bir tedavinin, CFTR'ye bağımlı Cl- akımının elektrofizyolojik düzeltmesini indüklemek için yeterli olduğunu ve in vitro olarak gözlenen düzeltmenin hastanın klinik iyileşmesi ile ilişkili olabileceğini gösterdik9. Bu nedenle HNE hücreleri, sadece temel KF araştırmaları için değil, hastaya özgü KFTR modülatör testi ile klinik öncesi çalışmalar için de uygun bir modeli temsil etmektedir. Bu kişiselleştirilmiş tedavi bağlamında, protokolün amacı, koşullarımızda yetiştirilen KF hastalarından kriyokorunmuş HNE hücrelerinin CFTR düzeltme çalışmaları için uygun bir model olduğunu doğrulamaktı ve taze ve dondurulmuş çözülmüş hücrelerden CFTR'ye bağımlı Cl-transportunu karşılaştırırken benzer sonuçlar beklenebilirdi. Çalışma ayrıca ikili ve üçlü tedaviler kullanırken farklı CFTR modülatörlerinin etkinliğini de değerlendirdi.

Protokol

Tüm deneyler, Helsinki Deklarasyonu ve insan araştırma etiği ile ilgili Huriet-Serusclat yasası tarafından açıklanan kılavuz ilkeler ve düzenlemeler uyarınca gerçekleştirilmiştir.

1. Şişelerin ve farklı ortamların hazırlanması

  1. Amplifikasyon, hava-sıvı ve dondurma ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
  2. 50 mg kolajenin% 0.2 buzul asetik asidin 100 mL'sinde çözündürülerek bir insan kollajen IV stok çözeltisi hazırlayın. Manyetik bir karıştırıcı üzerinde en az 1 saat karıştırın ve filtreleyerek çözeltiyi sterilize edin. Işıktan korunan bir cam şişede 6 aya kadar 4 ° C'de saklayın.
  3. Stok çözeltisini çift damıtılmış suda 1:5 oranında seyrelterek çalışan bir kollajen IV çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.
  4. Plastik hücre kültürü şişelerini veya transwell filtrelerini kollajen çalışma çözeltisi ile kaplayın. 0,33 cm2 transwell filtreler için 100 μL,25 cm2 şişeler için 500 μL ve şişenin tüm büyüme yüzeyine 75cm2 şişeler için 1 mL eşit olarak dağıtın.
    NOT: Bu, şişenin bir yandan diğer yana hafifçe eğilmesiyle sağlanabilir. Alternatif olarak, şişelerin kaplanmasını kolaylaştırmak için, artan bir hacim kullanılabilir ve tüm yüzey eşit şekilde kaplandığında, sadece belirtilen hacmi bırakmak için kollajen çözeltisi aspire edilir. Aspire edilmiş kollajen çözeltisi daha sonra bir sonraki şişeyi kaplamak için hemen kullanılabilir (yani, üç adet 75cm2 şişe için, ilk şişede 3 mL kollajen çözeltisini eşit olarak dağıtın, 2 mL'yi aspire edin, daha sonra bir sonraki şişe için kullanılır, vb.).
  5. Hücre kültürü şişelerini inkübatörde en az 2 saat veya bir gece boyunca bırakın. Kollajeni iyice aspire edin ve şişeleri inkübatörde veya kaputun altında en az 20 dakika veya gece boyunca kurumaya bırakın.
  6. 10 mL Mg2 + - ve Ca2 + içermeyen DPBS ile yıkayın, inkübatörde kurumaya bırakın ve ışıktan korumak için alüminyum folyoda saklayın. Şişeleri oda sıcaklığında (RT) 6 aya kadar saklayın.

2. Burun fırçalama

NOT: Burun fırçalamanın, katılımcının akut enfeksiyonu yokken yapıldığından emin olun. KF hastaları pulmoner enfeksiyon gösteriyorsa, hastanın antibiyogramına bakın ve amplifikasyon ortamına ek antibiyotikler ekleyin. İnsan burun epitel hücreleri, daha önce tarif edildiği gibi F508del/F508del hastalarından burun fırçalama ile toplandı9.

  1. Hastadan burnunu üflemesini isteyin, daha sonra naphazolin çözeltisi ile% 5 ksilokaine batırılmış pamuklu ağlar kullanarak her iki burun deliğinin mukozasını topikal olarak anestezi altına alın.
  2. Medial duvarı ve her iki burun deliğinin inferior konkasını bir sitoloji fırçası kullanarak nazikçe fırçalayın. Fırçayı, ticari olarak temin edilebilen 2 mL yıkama ortamına sahip 15 mL'lik bir tüpe batırın; hücreleri ayırmak için hafifçe sallayın. İkinci burun deliğinde fırçalamayı tekrarlayın.
  3. Yıkama ortamına aşağıdaki antibiyotikleri ekleyin: Penisilin (100 U / mL), Streptomisin (100 μg / mL), Tazosilin (10 μg / mL), Amfoterisin B (2.5 μg / mL) ve Kolimisin (16 μg / mL).
    NOT: Burun fırçalamaları RT'de genişleme ve kültür için özel laboratuvarlara gönderilebilir ve fırçalamadan sonra 72 saate kadar tohumlanabilir.

3. HNE izolasyonu

NOT: HNE sitoloji fırçasından izole edildi, Mg2 + ve Ca2 + içermeyen DPBS ile yıkandı,% 0.25 Tripsin ile ayrıştırıldı ve daha önce tarif edildiği gibi25 cm2 plastik şişe üzerine tohumlandı10.

  1. Fırçayı tekrar tekrar 1000 μL'lik bir pipet konisinden geçirerek ve 2 mL Mg 2 +ve Ca 2 + içermeyen DPBS ile durulayarak hücreleri sitoloji fırçasından ayırın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
  2. Hücreleri ayırmak için peleti% 0.25 Tripsin içinde 8-12 dakika boyunca yeniden askıya alın. 5 mL amplifikasyon ortamı ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun.
  3. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Peleti amplifikasyon ortamının 8 mL'sinde yeniden askıya alın ve 25 cm2 kollajen kaplı birşişeye tohumlayın. 37 °C'de ve% 5 CO2'de büyüyün. Bu, 0 numaralı pasaja karşılık gelir.
  4. Ertesi gün, ortamı 5 mL taze amplifikasyon ortamı ile değiştirin ve hücreleri günlük olarak bağlanma, morfoloji (hücreler yapışkan bir parke taşı görünümüne sahip olmalıdır) ve sayı açısından izleyin.
    NOT: İlk tohumlama yoğunluğu, burun fırçalamanın kalitesine ve epitel hücrelerinin oranına bağlı olarak değişir. Yeni izole edilmiş HNE hücreleri genellikle 3-10 gün içinde% 80-90 oranında akıcılığa ulaşır. Daha yavaş bir büyüme hızı, numunedeki yetersiz epitel hücrelerinin göstergesidir ve atılmalıdır.

4. İnsan burun epitel hücrelerinin amplifikasyonu ve pasajı

  1. İnsan burun epitel hücrelerini amplifikasyon ortamında 37 °C'de ve kollajen kaplı şişelerde% 80-90 akıcılığa kadar% 5 CO2'de büyütün, her 48-72 saatte bir ortam değiştirin. 25cm2 şişeler için 5 mL amplifikasyon ortamı ve 75cm2 şişeler için 10 mL kullanın.
  2. Hücreler% 80 -% 90 akıcılığa ulaştığında, hücreleri 10 mL Mg 2+ - ve Ca2 + içermeyen DPBS ile yıkayın, aspire edin ve atın.
  3. 25 cm2'lik bir şişe için 1 mL%0.25 Tripsin (veya 75 cm2'lik bir şişe için 2 mL Tripsin) ekleyin ve 8-12 dakika boyunca inkübatöre (37 ° C, % 5 CO2) geri dönün.
  4. Hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için şişeye elinizin avucuyla sıkıca dokunun.
  5. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için amplifikasyon ortamının 10 mL'sini ekleyin. Hücreleri durulamak ve ayırmak için amplifikasyon ortamını şişe yüzeyine çekmek ve dışarı atmak için 10 mL pipeti kullanarak şişeyi kuvvetlice durulayın.
  6. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
  7. Pelet, amplifikasyon ortamının 5-10 mL'sinde yeniden askıya alın.
  8. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
    NOT: Hücreler bu noktada dondurulabilir (bkz. adım 5.1-5.3). Daha fazla amplifikasyon gerekirse, kollajen kaplı şişelere yeniden tohumlayın (25cm2'lik bir şişe üç adet 75cm2'lik şişeye genişletilebilir, daha büyük bir seyreltme önerilmez).

5. Primer nazal epitel hücrelerinin kriyoprezervasyonu

NOT: Çözüldüğünde hücre büyümesini kolaylaştırmak için yeterli hücre elde etmek için biyobankacılıktan önce HNE hücrelerini 1. geçişe kadar büyütün. Bununla birlikte, biyobankacılık, ilk pasaj 0 veya pasaj 2'de mümkündür. Aşağıdaki kriyoprezervasyon adımları tüm pasajlara uyarlanmıştır.

  1. Hücre sayımından sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı atın
  2. mL başına ve kriyov başına 3 x 10 6-5 x 10 6 hücre elde etmek için peleti zenginleştirilmiş dondurucu ortamda (Tablo 1) yeniden askıya alın.
  3. Sıcaklığı -80 ° C'de uygun bir kriyo-dondurma kabında dakikada ~ 1 ° C'de düşürerek hücreleri yavaşça dondurun. Ertesi gün, korunan numuneyi uzun süreli depolama için bir azot depolama kabına taşıyın (mevcut çalışma 17 aylık depolama ile sınırlıdır).

6. Dondurulmuş güçlendirilmiş HNE hücrelerinin çözülmesi

  1. Su banyosunu 37 ° C'ye ısıtın. Amplifikasyon ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın ve ortamı 37 ° C'ye ısıtın.
  2. Kriyovalleri azot depolama tankından çıkarın ve tüm şişeyi suya batırmamaya dikkat ederek hızlı bir şekilde su banyosuna yerleştirin. Sadece küçük bir donmuş damlacık kaldığında kriovialleri su banyosundan çıkarın. Şişeyi% 70 alkolle silin, kurutun ve kaputun altına yerleştirin.
  3. 1 mL'lik bir pipet kullanarak, çözülmüş hücreleri boş bir 15 mL tüpe aktarın.
  4. Damla yönünde bir şekilde, 1 mL ılık amplifikasyon ortamı ekleyin. 1 dakika sonra, 1 mL amplifikasyon ortamı daha ekleyin ve bir dakika daha bekleyin.
  5. 10 mL amplifikasyon ortamı ekleyin ve 500 x g'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın.
  6. Süper natantı aspire edin ve atın. Hücre peletini, en az 1 x 106 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğu elde etmek için gereken bir amplifikasyon ortamında yeniden askıya alın.
  7. Hücreleri, amplifikasyon ortamını içeren kollajen kaplı bir şişeye tohumlayın.
    1. Kriyoval 4 x 106'dan fazla hücre içeriyorsa, amplifikasyon ortamının 10 mL'sinde 75cm2'lik bir şişeye tohumlayın.
    2. Kriyoval 4 x 106 hücreden daha azını içeriyorsa, tohum hücreleri, amplifikasyon ortamının 5 mL'sinde25 cm2'lik bir şişe üzerine yerleştirin.
  8. 37 ° C'de,% 5 CO 2'de inkübe edin ve önümüzdeki2-3 gün boyunca hücre genişlemesini görsel olarak gözlemleyin.
  9. Ardından, bölüm 4'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hücre amplifikasyonu gerçekleştirin.
    NOT: Adım 4.7'de az sayıda hücre toplandıysa. (yani, genişlemeden önce 0 pasajında donuyorsa), adım 6.5. ve 6.6. atlanabilir ve hücreler santrifüjleme olmadan doğrudan 25cm2 kollajen kaplı şişeye ekilebilir. Daha sonra dimetil sülfoksiti (DMSO) çıkarmak için ortam ertesi gün değiştirilmelidir.

7. İnsan burun epitel hücrelerinin hava-sıvı arayüzünde farklılaşması

NOT: HNE hava-sıvı arayüzünde daha önce tarif edildiği gibi farklılaştırılmıştır10.

  1. Hücreleri 0.33cm2 kollajen kaplı gözenekli filtreler üzerine 330.000 hücre / filtre yoğunluğunda tohumlayın ve apikal tarafta 300 μL amplifikasyon ortamı ve bazolateral tarafta 900 μL hava-sıvı ortam ile takviye edin.
  2. 3 gün sonra, apikal ortamı aspire edin ve farklılaşmış bir epitel oluşturmak için hava-sıvı ortamdaki hücreleri hava-sıvı ortamında 3-4 hafta boyunca kültürleyin. Bazal ortamı her 48-72 saatte bir değiştirin.

8. CFTR modülatörleri

  1. CFTR modülatörleri içeren hava-sıvı ortam hazırlayın. VX-445, VX-661 ve VX-809'u 3 μM nihai konsantrasyonda ve VX-770'i 100 nM'de kullanın. 1 μM nihai konsantrasyonda düzeltici ABBV-2222 ve 10 μM'de güçlendirici ABBV-974 kullanın.
  2. Düzeltici ortamdakiyle aynı miktarda% 100 DMSO içeren hava-sıvı ortam hazırlayın.
  3. Ortam içeren ilaçları veya DMSO'yu bir hava-sıvı arayüzünde yetiştirilen polarize HNE hücrelerinin bazolateral tarafına ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2'de 24 saat boyunca inkübe edin.
  4. 24 saat sonra, ortamı aspire edin ve atın ve 8.1-8.2. adımlarında olduğu gibi hazırlanmış taze ortamla değiştirin ve 37 ° C'de% 5 CO 2'de24 saatlik bir süre boyunca inkübe edin.

9. Ussing odası çalışmaları

  1. Kısa devre akımı ölçümlerini (Isc) daha önce açıklandığı gibi voltaj kelepçesi koşulları altında ölçün9.
    NOT: Kültürlerin transepitelyal elektrik direnci (TEER) bir çubuk voltmetre ile ölçülmüştür ve aşağıdaki deneyler için sadece en az 200 Ω · cm2'ye ulaşan kültürler dikkate alınmıştır. Polarize HNE hücrelerinin filtreleri Ussing odalarına monte edildi ve voltaj kelepçesi koşulları altında kısa devre akım ölçümleri (Isc) ölçüldü.

10. İmmünositokimya

  1. Daha önce tarif edildiği gibi İmmüno-tespiti gerçekleştirin9.
    NOT: CFTR immüno-tespiti, anti-CFTR C-terminali (24-1) monoklonal antikoru kullanılarak gece boyunca 1/100 seyreltmede gerçekleştirildi. Zona-oklüdenler-1 (ZO-1) (1/500 seyreltme), alfa-tübülin (1/300 seyreltme), Muc 5AC (1/250 seyreltme) ve sitokeratin 8 (1/250 seyreltme) boyama ek filtrelerde yapıldı. PBS-Triton-X100% 0.1 ile yıkandıktan sonra,% 10 keçi serumunda Alexa 488 veya 594'e konjuge edilmiş keçi sekonder antikorları% 10 keçi serumunda (1/1000 seyreltme) 30 dakika boyunca ilave edildi. Son bir yıkamadan sonra, filtreler destekten kesildi ve DAPI içeren Vectashield montaj ortamı ile monte edildi. ImageJ yazılımı ile analiz edilen görüntüleri yakalamak için bir konfokal mikroskop (63x/1.4 yağ diferansiyel girişim kontrastı λ mavi PL APO hedefi) kullanıldı.

11. İstatistiksel analiz

  1. Uygun yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın.
    NOT: İstatistiksel analiz S.A.S yazılımı kullanılarak yapılmıştır. Hasta başına ve duruma göre birkaç HNE filtresi elde edildiğinden, kantitatif parametreler hasta başına medyan değerler (± SEM) olarak ifade edildi. Karşılaştırmalar (ortalama ± SD) Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler işaretli sıralama testi veya eşlenmemiş t-testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Sonuçlar

Hava-sıvı arayüzünde kültürlenen taze HNE hücreleri, immün boyama ile değerlendirildiği gibi polarize ve diferansiye solunum epitelinin tipik özelliklerini göstermektedir (Şekil 1). HNE hücreleri, siliyer (pozitif alfa-tübülin boyaması) ve siliye olmayan mukus üreten goblet hücrelerinden (pozitif Muc5Ac immün boyama) oluşan psödo-tabakalaşmış bir solunum epitelinin in vivo durumunu taklit eden heterojen bir epitel hücresi tabakasına (pozitif keratin 8 imm?...

Tartışmalar

Kişiselleştirilmiş tıp bağlamında CFTR aktivitesini ölçmek için insan bronşiyal epitel (HBE) hücreleri için vekil olarak hasta kaynaklı nazal epitel hücrelerinin kullanılması, HNE üreme hücrelerinin kültür 9,11'deki özellikleri olarak önerilmiştir. HNE'nin HBE hücre kültürlerine göre güçlü avantajı, kolayca ve invaziv olmayan bir şekilde örneklenmeleridir. HNE hücre kültürlerinde kısa devre akım ölçümleri, epitel boyunca C...

Açıklamalar

Yazarlar, bu yayın veya bilimsel video prodüksiyonu ile ilgili hiçbir rakip finansal çıkar bildirmemektedir.

Teşekkürler

Çalışmaya katıldıkları için tüm hastalara ve ailelerine içtenlikle teşekkür ederiz. Bu çalışma Fransız Derneği Vaincre la Mucoviscidose'den gelen hibelerle desteklendi; Fransız Birliği ABCF 2 ve Vertex İlaç İnovasyon Ödülleri.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ABBV-2222SelleckchemS8535
ABBV-974SelleckchemS8698
Advanced DMEM/F-12Life Technologies12634010
Alexa 488 goat secondary antibodyInvitrogenA11001
Alexa 594 goat secondary antibodyInvitrogenA11012
Amphotericin BLife Technologies15290026
Anti-alpha-tubulin antibodyAbcamab80779
Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)R&D SystemsMAB25031
Anti-cytokeratin 8 antibodyProgen61038
Anti-Muc5AC antibodySanta Cruz Biotechsc-20118
Anti-ZO-1 antibodySanta Cruz Biotechsc-10804
Ciprofloxacinprovided by Necker Hospital Pharmacy
ColimycinSanofiprovided by Necker Hospital Pharmacy
Collagen type IVSigma-Aldrich MerckC-7521
cytology brushLaboratory GYNEAS02.104
DMSOSigma-Aldrich MerckD2650
EGFLife TechnologiesPHG0311
EpinephrinSigma-Aldrich MerckE4375
F12-Nutrient MixtureLife Technologies11765054
FBSLife Technologies10270106
FerticultFertipro NVFLUSH020
Flasks 25Thermo Scientific156.367
Flasks 75Thermo Scientific156.499
Glacial acetic acidVWR20104.298
HEPESSigma-Aldrich MerckH3375
HydrocortisoneSigma-Aldrich MerckSLCJ0893
InsulinSigma-Aldrich MerckI0516
Mg2+ and Ca2+-free DPBSLife Technologies14190094
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140130
TazocillinMylanprovided by Necker Hospital Pharmacy
Transwell FiltersSigma-Aldrich MerckCLS3470-48EA
Triton-X100Sigma-Aldrich MerckT8787
Trypsin 0,25%Life Technologies25200056
Vectashield mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
VX-445SelleckchemS8851
VX-661SelleckchemS7059
VX-770SelleckchemS1144
VX-809SelleckchemS1565
Xylocaine naphazoline 5%Aspen Franceprovided by Necker Hospital Pharmacy
Y-27632SelleckchemS1049

Referanslar

  1. Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
  2. Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
  3. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
  4. Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
  5. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
  6. Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
  7. Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
  8. Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
  9. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
  10. Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
  11. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
  12. Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
  13. de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
  14. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
  15. McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
  16. Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
  17. Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
  18. Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
  19. Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
  20. Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
  21. Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
  22. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
  23. Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
  24. Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
  25. Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
  26. Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
  27. Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
  28. Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
  29. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
  30. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).
  31. Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 182Kistik Fibrozisprimer insan burun epitel h crelerikriyoprezervasyoncftr mod lat rleribiyobankac l khassas t p

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır