Primäre humane Nasennebenhöhlen: Biobanking im Kontext der Präzisionsmedizin

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Isolierung, Amplifikation und Differenzierung von primären humanen Nasenepithelzellen (HNE) an der Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle und ein Biobanking-Protokoll, das es ermöglicht, erfolgreich einzufrieren und dann verstärktes HNE aufzutauen. Das Protokoll analysiert die elektrophysiologischen Eigenschaften differenzierter HNE-Zellen und die CFTR-bezogene Chloridsekretionskorrektur bei verschiedenen Modulatorbehandlungen.

Zusammenfassung

Menschliche Nasenepithelzellen (HNE) lassen sich leicht durch einfaches, nicht-invasives Nasenbürsten sammeln. Patientenabgeleitete primäre HNE-Zellen können unter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenbedingungen amplifiziert und zu einem pseudostratifizierten Epithel differenziert werden, um den zyklischen AMP-vermittelten Chloridtransport (Cl^-) als Index der CFTR-Funktion (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) zu quantifizieren. Wenn kritische Schritte wie die Qualität des Nasenbürstens und die Zelldichte bei der Kryokonservierung effizient durchgeführt werden, können HNE-Zellen erfolgreich biobankiert werden. Darüber hinaus zeigen Kurzschlussstromstudien, dass das Einfrieren und Auftauen die elektrophysiologischen Eigenschaften und die Reaktion von HNE-Zellen auf CFTR-Modulatoren nicht signifikant verändert. Unter den in dieser Studie verwendeten Kulturbedingungen, wenn weniger als 2 x 10⁶ Zellen pro Kryo eingefroren sind, ist die Ausfallrate sehr hoch. Wir empfehlen, mindestens 3 x 10⁶ Zellen pro Kryo einzufrieren. Wir zeigen, dass duale Therapien, die einen CFTR-Korrektor mit einem CFTR-Potentiator kombinieren, eine vergleichbare Korrekturwirksamkeit für die CFTR-Aktivität in F508del-homozygoten HNE-Zellen aufweisen. Die Dreifachtherapie VX-445 + VX-661 + VX-770 erhöhte signifikant die Korrektur der CFTR-Aktivität im Vergleich zur Dualtherapie VX-809 + VX-770. Das Maß der CFTR-Aktivität in HNE-Zellen ist ein vielversprechender präklinischer Biomarker, der nützlich ist, um die CFTR-Modulatortherapie zu steuern.

Einleitung

Mukoviszidose (CF) ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, die aus Mutationen im CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) resultiert, die zum Fehlen oder zur Funktionsstörung des CFTR-Proteins führen, einem Anionenkanal an der apikalen Oberfläche von Epithel ^1,2. Jüngste Fortschritte in der CFTR-Therapie haben die Prognose der Krankheit verbessert, und die letzten zugelassenen Medikamente, die CFTR-Korrektoren und CFTR-Potentiatoren kombinieren, führten zu erheblichen Verbesserungen der Lungenfunktion und Lebensqualität bei CF-Patienten mit der häufigsten Mutation p.Phe508del-Mutation (F....

Protokoll

Alle Experimente wurden nach den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki und dem Huriet-Serusclat-Gesetz über die Ethik der Humanforschung beschrieben sind.

1. Vorbereitung von Kolben und verschiedenen Medien

1. Bereiten Sie Verstärkungs-, Luft-Flüssigkeits- und Gefriermedium wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
2. Bereiten Sie eine Stammlösung von menschlichem Kollagen IV vor, indem Sie 50 mg Kollagen in 100 ml 0,2% Eisessigsäure auflösen. Mischen Sie auf einem Magnetrührer für mindestens 1 h und sterilisieren Sie die Lösung. Bis zu 6 Monate bei 4 °C in ein....

Ergebnisse

Frische HNE-Zellen, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert werden, weisen typische Merkmale des polarisierten und differenzierten respiratorischen Epithels auf, wie sie durch Immunfärbung beurteilt werden (Abbildung 1). HNE-Zellen redifferenzieren sich in eine heterogene Schicht von Epithelzellen (positive Keratin-8-Immunfärbung), die die In-vivo-Situation eines pseudostratifizierten respiratorischen Epithels nachahmen, das aus flimmerbeinten (positive Alpha-Tubulin.......

Diskussion

Die Verwendung von von Patienten abgeleiteten Nasenepithelzellen als Surrogate für menschliche Bronchialepithelzellen (HBE) zur Messung der CFTR-Aktivität im Rahmen der personalisierten Medizin wurde vorgeschlagen, da HNE die Eigenschaften von Zellen in Kultur^{reproduziert 9,11}. Der starke Vorteil von HNE gegenüber HBE-Zellkulturen besteht darin, dass sie leicht und nicht-invasiv beprobt werden können. Kurzschlussstrommessungen in HNE-Zellkulturen ermöglichen.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABBV-2222	Selleckchem	S8535
ABBV-974	Selleckchem	S8698
Advanced DMEM/F-12	Life Technologies	12634010
Alexa 488 goat secondary antibody	Invitrogen	A11001
Alexa 594 goat secondary antibody	Invitrogen	A11012
Amphotericin B	Life Technologies	15290026
Anti-alpha-tubulin antibody	Abcam	ab80779
Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)	R&D Systems	MAB25031
Anti-cytokeratin 8 antibody	Progen	61038
Anti-Muc5AC antibody	Santa Cruz Biotech	sc-20118
Anti-ZO-1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-10804
Ciprofloxacin		provided by Necker Hospital Pharmacy
Colimycin	Sanofi	provided by Necker Hospital Pharmacy
Collagen type IV	Sigma-Aldrich Merck	C-7521
cytology brush	Laboratory GYNEAS	02.104
DMSO	Sigma-Aldrich Merck	D2650
EGF	Life Technologies	PHG0311
Epinephrin	Sigma-Aldrich Merck	E4375
F12-Nutrient Mixture	Life Technologies	11765054
FBS	Life Technologies	10270106
Ferticult	Fertipro NV	FLUSH020
Flasks 25	Thermo Scientific	156.367
Flasks 75	Thermo Scientific	156.499
Glacial acetic acid	VWR	20104.298
HEPES	Sigma-Aldrich Merck	H3375
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich Merck	SLCJ0893
Insulin	Sigma-Aldrich Merck	I0516
Mg2+ and Ca2+-free DPBS	Life Technologies	14190094
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140130
Tazocillin	Mylan	provided by Necker Hospital Pharmacy
Transwell Filters	Sigma-Aldrich Merck	CLS3470-48EA
Triton-X100	Sigma-Aldrich Merck	T8787
Trypsin 0,25%	Life Technologies	25200056
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
VX-445	Selleckchem	S8851
VX-661	Selleckchem	S7059
VX-770	Selleckchem	S1144
VX-809	Selleckchem	S1565
Xylocaine naphazoline 5%	Aspen France	provided by Necker Hospital Pharmacy
Y-27632	Selleckchem	S1049