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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Isolierung, Amplifikation und Differenzierung von primären humanen Nasenepithelzellen (HNE) an der Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle und ein Biobanking-Protokoll, das es ermöglicht, erfolgreich einzufrieren und dann verstärktes HNE aufzutauen. Das Protokoll analysiert die elektrophysiologischen Eigenschaften differenzierter HNE-Zellen und die CFTR-bezogene Chloridsekretionskorrektur bei verschiedenen Modulatorbehandlungen.

Zusammenfassung

Menschliche Nasenepithelzellen (HNE) lassen sich leicht durch einfaches, nicht-invasives Nasenbürsten sammeln. Patientenabgeleitete primäre HNE-Zellen können unter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenbedingungen amplifiziert und zu einem pseudostratifizierten Epithel differenziert werden, um den zyklischen AMP-vermittelten Chloridtransport (Cl-) als Index der CFTR-Funktion (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) zu quantifizieren. Wenn kritische Schritte wie die Qualität des Nasenbürstens und die Zelldichte bei der Kryokonservierung effizient durchgeführt werden, können HNE-Zellen erfolgreich biobankiert werden. Darüber hinaus zeigen Kurzschlussstromstudien, dass das Einfrieren und Auftauen die elektrophysiologischen Eigenschaften und die Reaktion von HNE-Zellen auf CFTR-Modulatoren nicht signifikant verändert. Unter den in dieser Studie verwendeten Kulturbedingungen, wenn weniger als 2 x 106 Zellen pro Kryo eingefroren sind, ist die Ausfallrate sehr hoch. Wir empfehlen, mindestens 3 x 106 Zellen pro Kryo einzufrieren. Wir zeigen, dass duale Therapien, die einen CFTR-Korrektor mit einem CFTR-Potentiator kombinieren, eine vergleichbare Korrekturwirksamkeit für die CFTR-Aktivität in F508del-homozygoten HNE-Zellen aufweisen. Die Dreifachtherapie VX-445 + VX-661 + VX-770 erhöhte signifikant die Korrektur der CFTR-Aktivität im Vergleich zur Dualtherapie VX-809 + VX-770. Das Maß der CFTR-Aktivität in HNE-Zellen ist ein vielversprechender präklinischer Biomarker, der nützlich ist, um die CFTR-Modulatortherapie zu steuern.

Einleitung

Mukoviszidose (CF) ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, die aus Mutationen im CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) resultiert, die zum Fehlen oder zur Funktionsstörung des CFTR-Proteins führen, einem Anionenkanal an der apikalen Oberfläche von Epithel 1,2. Jüngste Fortschritte in der CFTR-Therapie haben die Prognose der Krankheit verbessert, und die letzten zugelassenen Medikamente, die CFTR-Korrektoren und CFTR-Potentiatoren kombinieren, führten zu erheblichen Verbesserungen der Lungenfunktion und Lebensqualität bei CF-Patienten mit der häufigsten Mutation p.Phe508del-Mutation (F508del)3,4. Trotz dieses vielversprechenden therapeutischen Fortschritts sind rund 10% der CF-Patienten nicht geeignet, da sie Mutationen tragen, die durch diese CFTR-Modulatoren nicht gerettet werden können. Für diese Patienten besteht die Notwendigkeit, andere Medikamente oder Arzneimittelkombinationen zu testen, um die effizienteste Kombination für bestimmte Mutationen zu finden, was die Bedeutung personalisierter Therapien unterstreicht.

Menschliche Nasenepithelzellen (HNE) lassen sich leicht durch einfaches, nicht-invasives Nasenbürsten sammeln und ermöglichen die Quantifizierung des zyklischen AMP-vermittelten Chloridtransports (Cl−) als Index der CFTR-Funktion. HNE-Zellen liefern ein genaues Modell der menschlichen Atemwege, aber ihre Lebensdauer ist in der Kultur begrenzt. Dank der Optimierung der Kulturtechniken können patientenabgeleitete primäre HNE-Zellen bedingt mit dem Rho-assoziierten Kinase-Inhibitor (ROCKi) umprogrammiert, amplifiziert und unter ALI-Bedingungen (Air-Liquid Interface) auf mikroporösen Filtern zu einem pseudostratifizierten Epithel differenziertwerden 5,6. Es gibt zahlreiche Kulturprotokolle für die HNE-Kultur (kommerziell erhältlich, serumfrei, "hausgemacht", Kokultur mit Feederzellen usw.), und es wurde beschrieben, dass die Wahl der Medien und die Kulturbedingungen das Wachstum, die Zellpopulationsdifferenzierung und die Epithelfunktion beeinflussen 7,8. Das Protokoll stellt hier eine vereinfachte, feederfreie ROCKi-Amplifikationsmethode vor, die es ermöglicht, eine große Anzahl von HNE-Zellen erfolgreich zu erhalten, die dann bei ALI für CFTR-Funktionsassays differenziert werden.

Wir haben gezeigt, dass in differenzierten HNE-Zellen eine 48-stündige Behandlung mit CFTR-Modulatoren ausreicht, um eine elektrophysiologische Korrektur des CFTR-abhängigen Cl-Stroms zu induzieren, und dass die in vitro beobachtete Korrektur mit der klinischen Verbesserung des Patienten korreliertsein kann 9. HNE-Zellen stellen daher ein geeignetes Modell nicht nur für die CF-Grundlagenforschung, sondern auch für präklinische Studien mit patientenspezifischen CFTR-Modulatortests dar. In diesem Zusammenhang mit der personalisierten Therapie bestand das Ziel des Protokolls darin, zu validieren, dass kryokonservierte HNE-Zellen von CF-Patienten, die unter unseren Bedingungen gezüchtet wurden, ein geeignetes Modell für CFTR-Korrekturstudien waren, und ähnliche Ergebnisse konnten beim Vergleich des CFTR-abhängigen Cl-Transports aus frischen und gefrorenen aufgetauten Zellen erwartet werden. Die Studie bewertete auch die Wirksamkeit verschiedener CFTR-Modulatoren bei der Verwendung von dualen und dreifachen Therapien.

Protokoll

Alle Experimente wurden nach den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki und dem Huriet-Serusclat-Gesetz über die Ethik der Humanforschung beschrieben sind.

1. Vorbereitung von Kolben und verschiedenen Medien

  1. Bereiten Sie Verstärkungs-, Luft-Flüssigkeits- und Gefriermedium wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
  2. Bereiten Sie eine Stammlösung von menschlichem Kollagen IV vor, indem Sie 50 mg Kollagen in 100 ml 0,2% Eisessigsäure auflösen. Mischen Sie auf einem Magnetrührer für mindestens 1 h und sterilisieren Sie die Lösung. Bis zu 6 Monate bei 4 °C in einer lichtgeschützten Glasflasche aufbewahren.
  3. Bereiten Sie eine Arbeitslösung aus Kollagen IV vor, indem Sie die Stammlösung 1:5 in doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Bis zu 6 Monate bei 4 °C lagern.
  4. Beschichten Sie Kunststoff-Zellkulturflaschen oder Transwell-Filter mit der Kollagen-Arbeitslösung. 100 μL für 0,33 cm 2 Transwell-Filter, 500 μL für 25 cm 2 Kolben und 1 ml für75 cm2 Kolben gleichmäßig auf die gesamte Wachstumsfläche des Kolbens verteilen.
    HINWEIS: Dies kann erreicht werden, indem der Kolben sanft von einer Seite zur anderen geneigt wird. Alternativ kann zur Erleichterung der Beschichtung der Kolben ein erhöhtes Volumen verwendet werden, und wenn die gesamte Oberfläche gleichmäßig bedeckt ist, wird Kollagenlösung abgesaugt, um nur das angegebene Volumen zu hinterlassen. Die angesaugte Kollagenlösung kann dann sofort verwendet werden, um den nächsten Kolben zu beschichten (d. h. für drei 75 cm 2 Kolben, verteilen Sie 3 ml Kollagenlösung gleichmäßig im ersten Kolben, aspirieren Sie 2 ml, die dann für den nächsten Kolben verwendet werden, und so weiter).
  5. Lassen Sie die Zellkulturflaschen mindestens 2 h oder über Nacht im Inkubator. Saugen Sie das Kollagen gründlich ab und lassen Sie die Kolben mindestens 20 Minuten oder über Nacht im Inkubator oder unter der Haube trocknen.
  6. Mit 10 ml Mg 2+- und Ca2+-freien DPBS waschen, im Inkubator trocknen lassen und zum Schutz vor Licht in Aluminiumfolie lagern. Lagern Sie die Flaschen bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur (RT).

2. Nasenbürsten

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Nasenbürsten durchgeführt wird, während der Teilnehmer keine akute Infektion hat. Wenn CF-Patienten eine Lungeninfektion aufweisen, beziehen Sie sich auf das Antibiogramm des Patienten und fügen Sie dem Amplifikationsmedium zusätzliche Antibiotika hinzu. Menschliche Nasenepithelzellen wurden durch Nasenbürsten von F508del/F508del-Patienten gesammelt, wie zuvor beschrieben9.

  1. Bitten Sie den Patienten, sich die Nase zu putzen, und betäuben Sie dann topisch die Schleimhaut beider Nasenlöcher mit Baumwollnetzen, die in Xylocain 5% mit Naphazolinlösung getränkt sind.
  2. Bürsten Sie die mediale Wand und den unteren Nasenpanzer beider Nasenlöcher vorsichtig mit einem Zytologiepinsel. Weichen Sie die Bürste in einem 15-ml-Schlauch mit 2 ml handelsüblichem Spülmedium ein; Vorsichtig schütteln, um Zellen zu lösen. Wiederholen Sie das Bürsten im zweiten Nasenloch.
  3. Fügen Sie dem Spülmedium die folgenden Antibiotika hinzu: Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 μg / ml), Tazocillin (10 μg / ml), Amphotericin B (2,5 μg / ml) und Colimycin (16 μg / ml).
    HINWEIS: Nasenbürsten können bei RT an spezielle Labore zur Expansion und Kultur geliefert werden und können bis zu 72 Stunden nach dem Bürsten ausgesät werden.

3. Isolierung von HNE

HINWEIS: HNE wurden aus der Zytologiebürste isoliert, mit Mg 2+- und Ca2+-freiem DPBS gewaschen, mit 0,25% Trypsin dissoziiert und wie zuvor beschrieben auf einen25 cm2 großen Kunststoffkolben ausgesät10.

  1. Lösen Sie die Zellen von der Zytologiebürste, indem Sie die Bürste wiederholt durch einen 1000 μL Pipettenkegel führen und mit 2 ml Mg2+- und Ca2+-freiem DPBS spülen. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
  2. Resuspendiert das Pellet in 0,25% Trypsin für 8-12 Minuten, um Zellen zu dissoziieren. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 5 ml des Amplifikationsmediums hinzufügen.
  3. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Das Pellet wird in 8 ml des Verstärkungsmediums resuspendiert und auf einem 25 cm2 kollagenbeschichteten Kolben ausgesät. Wachsen bei 37 °C und 5% CO2. Dies entspricht der Passage 0.
  4. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch 5 ml frisches Verstärkungsmedium und überwachen Sie die Zellen täglich auf Anhaftung, Morphologie (Zellen sollten ein kohäsives Kopfsteinpflasteraussehen haben) und Anzahl.
    HINWEIS: Die anfängliche Aussaatdichte variiert je nach Qualität der Nasenbürste und dem Anteil der Epithelzellen. Frisch isolierte HNE-Zellen erreichen normalerweise innerhalb von 3-10 Tagen eine Konfluenz von 80% -90%. Eine langsamere Wachstumsrate deutet auf unzureichende Epithelzellen in der Probe hin und sollte verworfen werden.

4. Amplifikation und Passage menschlicher Nasenepithelzellen

  1. Züchten Sie menschliche Nasenepithelzellen im Amplifikationsmedium bei 37 °C und 5% CO2 auf kollagenbeschichteten Kolben bis zu 80%-90% Konfluenz, wobei das Medium alle 48-72 h gewechselt wird. Für 25 cm 2 Kolben verwenden Sie 5 ml Verstärkungsmedium und 10 ml für 75 cm2 Kolben.
  2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80% -90% erreichen, waschen Sie die Zellen mit 10 ml Mg 2 + - und Ca2 + -freiem DPBS, aspirieren und verwerfen Sie.
  3. 1 ml 0,25% Trypsin für einen 25 cm 2 Kolben (oder 2 ml Trypsin für einen 75 cm 2 Kolben) zugeben und für 8-12 min in den Inkubator (37 °C, 5% CO2) zurückgeben.
  4. Klopfen Sie fest mit der Handfläche auf den Kolben, um den Zellen zu helfen, sich zu lösen.
  5. Fügen Sie 10 ml des Amplifikationsmediums hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Spülen Sie den Kolben kräftig aus, indem Sie die 10-ml-Pipette verwenden, um das Verstärkungsmedium über die Kolbenoberfläche zu ziehen und auszustoßen, um Zellen zu spülen und zu lösen.
  6. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
  7. Resuspendiert das Pellet in 5-10 ml des Verstärkungsmediums.
  8. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
    HINWEIS: Zellen können an dieser Stelle eingefroren werden (siehe Schritte 5.1-5.3). Wenn eine weitere Verstärkung erforderlich ist, werden Sie auf kollagenbeschichtete Kolben umsäen (ein 25 cm 2 Kolben kann zu drei 75 cm2 Kolben erweitert werden, eine stärkere Verdünnung wird nicht empfohlen).

5. Kryokonservierung primärer Nasenepithelzellen

HINWEIS: Züchten Sie HNE-Zellen bis zur Passage 1 vor dem Biobanking, um genügend Zellen zu erhalten, um das Zellwachstum beim Auftauen zu erleichtern. Biobanking ist jedoch bei der ersten Passage 0 oder Passage 2 möglich. Die folgenden Kryokonservierungsschritte sind an alle Passagen angepasst.

  1. Nach der Zellzählung bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen
  2. Resuspendiert das Pellet im angereicherten Gefriermedium (Tabelle 1), um 3 x 10 6-5 x 106 Zellen pro ml und pro Kryo zu erhalten.
  3. Langsam frieren Sie die Zellen ein, indem Sie die Temperatur auf ~ 1 ° C pro Minute in einem geeigneten Kryogefrierbehälter bei -80 ° C reduzieren. Am nächsten Tag die konservierte Probe zur Langzeitlagerung in einen Stickstofflagerbehälter geben (die vorliegende Studie ist auf 17 Monate Lagerung beschränkt).

6. Auftauen von gefrorenen verstärkten HNE-Zellen

  1. Das Wasserbad auf 37 °C aufwärmen. Das Verstärkungsmedium wird wie in Tabelle 1 beschrieben vorbereitet und auf 37 °C erhitzt.
  2. Entfernen Sie Kryoviale aus dem Stickstoffspeicher und legen Sie sie schnell in das Wasserbad, wobei Sie darauf achten, die gesamte Durchstechflasche nicht in das Wasser zu tauchen. Entfernen Sie die Kryofrüchte aus dem Wasserbad, wenn nur ein kleiner gefrorener Tröpfchen übrig bleibt. Wischen Sie die Durchstechflasche mit 70% Alkohol ab, wischen Sie sie trocken und legen Sie sie unter die Haube.
  3. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen mit einer 1-ml-Pipette in eine leere 15-ml-Röhre.
  4. Fügen Sie tropfenweise 1 ml warmes Verstärkungsmedium hinzu. Nach 1 Minute fügen Sie weitere 1 ml Verstärkungsmedium hinzu und warten Sie eine weitere Minute.
  5. Fügen Sie 10 ml des Verstärkungsmediums hinzu und zentrifugieren Sie für 2 min bei 500 x g.
  6. Saugen Sie den Überstand auf und verwerfen Sie ihn. Resuspendiert das Zellpellet in einem Volumen von Amplifikationsmedium, das erforderlich ist, um eine Zelldichte von mindestens 1 x 106 Zellen / ml zu erreichen.
  7. Säen Sie die Zellen auf einen kollagenbeschichteten Kolben, der das Verstärkungsmedium enthält.
    1. Wenn das Kryo mehr als 4 x 10 6 Zellen enthält, Samen Sie auf einen 75 cm2 Kolben, in 10 ml des Verstärkungsmediums
    2. Wenn Kryo weniger als 4 x 10 6 Zellen enthält, Samenzellen auf einen 25 cm2 Kolben, in 5 ml des Verstärkungsmediums
  8. Inkubieren Sie bei 37 °C, 5% CO 2 und beobachten Sie visuell die Zellexpansion in den nächsten2-3 Tagen.
  9. Führen Sie dann eine Zellverstärkung durch, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
    HINWEIS: Wenn in Schritt 4.7 nur wenige Zellen geerntet wurden. (d. h. wenn vor der Expansion bei Durchgang 0 eingefroren wird), Schritte 6.5. und 6.6. kann weggelassen werden, und Zellen können ohne Zentrifugation direkt auf einen 25 cm2 kollagenbeschichteten Kolben ausgesät werden. Das Medium muss dann am nächsten Tag gewechselt werden, um Dimethylsulfoxid (DMSO) zu entfernen.

7. Differenzierung menschlicher Nasenepithelzellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche

HINWEIS: HNE wurden an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche wie zuvor beschriebenunterschieden 10.

  1. Die Zellen werden mit einer Dichte von 330.000 Zellen/Filter auf 0,33 cm 2 kollagenbeschichtetenporösen Filtern ausgesät und mit 300 μL des Amplifikationsmediums auf der apikalen Seite und 900 μL des Luft-Flüssig-Mediums auf der basolateralen Seite ergänzt.
  2. Nach 3 Tagen aspirieren Sie das apikale Medium und kultivieren Sie die Zellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche für 3-4 Wochen im Luft-Flüssig-Medium, um ein differenziertes Epithel zu etablieren. Wechseln Sie das Basalmedium alle 48-72 h.

8. CFTR-Modulatoren

  1. Bereiten Sie ein Luft-Flüssig-Medium vor, das CFTR-Modulatoren enthält. Verwenden Sie VX-445, VX-661 und VX-809 bei einer Endkonzentration von 3 μM und VX-770 bei 100 nM. Verwenden Sie den Korrektor ABBV-2222 bei einer Endkonzentration von 1 μM und den Potentiator ABBV-974 bei 10 μM. Verwenden Sie 100% DMSO, um alle CFTR-Modulatoren aufzulösen.
  2. Bereiten Sie ein Luft-Flüssig-Medium vor, das die gleiche Menge an 100% DMSO wie in Korrektormedium enthält.
  3. Fügen Sie das Medium, das Medikamente oder DMSO enthält, auf die basolaterale Seite der polarisierten HNE-Zellen hinzu, die an einer Luft-Flüssig-Grenzfläche gezüchtet werden, und inkubieren Sie für 24 h in 5% CO2 bei 37 ° C.
  4. Nach 24 h wird das Medium abgesaugt, entsorgt und durch frisches Medium ersetzt, das gemäß den Schritten 8.1-8.2. zubereitet wurde, und für einen Zeitraum von 24 h in 5 % CO2 bei 37 °C weiter inkubiert.

9. Ussing-Kammerstudien

  1. Messen Sie Kurzschlussstrommessungen (Isc) unter Spannungsklemmbedingungen wie zuvor beschrieben9.
    HINWEIS: Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) von Kulturen wurde mit einem Essstäbchenvoltmeter gemessen, und für die folgenden Experimente wurden nur Kulturen mit einem Erreichen von mindestens 200 Ω · cm2 berücksichtigt. Filter von polarisierten HNE-Zellen wurden in Ussing-Kammern montiert, und Kurzschlussstrommessungen (Isc) wurden unter Spannungsklemmbedingungen gemessen.

10. Immunzytochemie

  1. Führen Sie die Immundetektion wie zuvor beschriebendurch 9.
    HINWEIS: Die CFTR-Immundetektion wurde mit dem monoklonalen Anti-CFTR-C-terminalen (24-1) Antikörper über Nacht bei einer 1/100-Verdünnung durchgeführt. Zona-Okklusionen-1 (ZO-1) (1/500 Verdünnung), Alpha-Tubulin (1/300 Verdünnung), Muc 5AC (1/250 Verdünnung) und Cytokeratin 8 (1/250 Verdünnung) wurden auf zusätzlichen Filtern gefärbt. Nach dem Waschen mit PBS-Triton-X100 wurden 0,1% Ziegensekundärantikörper, die an Alexa 488 oder 594 konjugiert waren, für 30 min in 10% Ziegenserum (1/1000 Verdünnung) zugegeben. Nach einer abschließenden Wäsche wurden die Filter von der Stütze geschnitten und mit einem DAPI-haltigen Vectashield-Montagemedium montiert. Ein konfokales Mikroskop (63x/1,4 Öl Differential Interferenzkontrast λ blaues PL APO Objektiv) wurde verwendet, um Bilder aufzunehmen, die mit der ImageJ-Software analysiert wurden.

11. Statistische Auswertung

  1. Führen Sie statistische Analysen mit geeigneter Software durch.
    HINWEIS: Die statistische Analyse wurde mit der S.A.S.-Software durchgeführt. Da mehrere HNE-Filter pro Patient und pro Zustand erhalten wurden, wurden quantitative Parameter als Medianwerte (± REM) pro Patient ausgedrückt. Vergleiche (Mittelwert ± SD) wurden unter Verwendung von Wilcoxon Matched Pairs signiertem Rangtest oder ungepaartem t-Test durchgeführt.

Ergebnisse

Frische HNE-Zellen, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert werden, weisen typische Merkmale des polarisierten und differenzierten respiratorischen Epithels auf, wie sie durch Immunfärbung beurteilt werden (Abbildung 1). HNE-Zellen redifferenzieren sich in eine heterogene Schicht von Epithelzellen (positive Keratin-8-Immunfärbung), die die In-vivo-Situation eines pseudostratifizierten respiratorischen Epithels nachahmen, das aus flimmerbeinten (positive Alpha-Tubulin...

Diskussion

Die Verwendung von von Patienten abgeleiteten Nasenepithelzellen als Surrogate für menschliche Bronchialepithelzellen (HBE) zur Messung der CFTR-Aktivität im Rahmen der personalisierten Medizin wurde vorgeschlagen, da HNE die Eigenschaften von Zellen in Kulturreproduziert 9,11. Der starke Vorteil von HNE gegenüber HBE-Zellkulturen besteht darin, dass sie leicht und nicht-invasiv beprobt werden können. Kurzschlussstrommessungen in HNE-Zellkulturen ermöglichen...

Offenlegungen

Die Autoren berichten von keinen konkurrierenden finanziellen Interessen im Zusammenhang mit dieser Publikation oder wissenschaftlichen Videoproduktion.

Danksagungen

Wir danken allen Patienten und ihren Familien herzlich für die Teilnahme an der Studie. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des französischen Verbandes Vaincre la Mucoviscidose unterstützt; Französischer Verband ABCF 2 und Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
ABBV-2222SelleckchemS8535
ABBV-974SelleckchemS8698
Advanced DMEM/F-12Life Technologies12634010
Alexa 488 goat secondary antibodyInvitrogenA11001
Alexa 594 goat secondary antibodyInvitrogenA11012
Amphotericin BLife Technologies15290026
Anti-alpha-tubulin antibodyAbcamab80779
Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)R&D SystemsMAB25031
Anti-cytokeratin 8 antibodyProgen61038
Anti-Muc5AC antibodySanta Cruz Biotechsc-20118
Anti-ZO-1 antibodySanta Cruz Biotechsc-10804
Ciprofloxacinprovided by Necker Hospital Pharmacy
ColimycinSanofiprovided by Necker Hospital Pharmacy
Collagen type IVSigma-Aldrich MerckC-7521
cytology brushLaboratory GYNEAS02.104
DMSOSigma-Aldrich MerckD2650
EGFLife TechnologiesPHG0311
EpinephrinSigma-Aldrich MerckE4375
F12-Nutrient MixtureLife Technologies11765054
FBSLife Technologies10270106
FerticultFertipro NVFLUSH020
Flasks 25Thermo Scientific156.367
Flasks 75Thermo Scientific156.499
Glacial acetic acidVWR20104.298
HEPESSigma-Aldrich MerckH3375
HydrocortisoneSigma-Aldrich MerckSLCJ0893
InsulinSigma-Aldrich MerckI0516
Mg2+ and Ca2+-free DPBSLife Technologies14190094
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140130
TazocillinMylanprovided by Necker Hospital Pharmacy
Transwell FiltersSigma-Aldrich MerckCLS3470-48EA
Triton-X100Sigma-Aldrich MerckT8787
Trypsin 0,25%Life Technologies25200056
Vectashield mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
VX-445SelleckchemS8851
VX-661SelleckchemS7059
VX-770SelleckchemS1144
VX-809SelleckchemS1565
Xylocaine naphazoline 5%Aspen Franceprovided by Necker Hospital Pharmacy
Y-27632SelleckchemS1049

Referenzen

  1. Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
  2. Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
  3. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
  4. Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
  5. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
  6. Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
  7. Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
  8. Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
  9. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
  10. Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
  11. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
  12. Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
  13. de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
  14. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
  15. McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
  16. Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
  17. Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
  18. Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
  19. Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
  20. Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
  21. Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
  22. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
  23. Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
  24. Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
  25. Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
  26. Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
  27. Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
  28. Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
  29. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
  30. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).
  31. Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).

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