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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui descriviamo l'isolamento, l'amplificazione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali umane primarie (HNE) all'interfaccia aria-liquido e un protocollo di biobanking che consente di congelare e quindi scongelare con successo l'HNE amplificato. Il protocollo analizza le proprietà elettrofisiologiche delle cellule HNE differenziate e la correzione della secrezione di cloruro correlata al CFTR su diversi trattamenti modulatori.

Abstract

Le cellule epiteliali nasali umane (HNE) sono facili da raccogliere con una spazzolatura nasale semplice e non invasiva. Le cellule HNE primarie derivate dal paziente possono essere amplificate e differenziate in un epitelio pseudo-stratificato in condizioni di interfaccia aria-liquido per quantificare il trasporto ciclico di cloruro mediato da AMP (Cl-) come indice della funzione CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) della fibrosi cistica. Se passaggi critici come la qualità della spazzolatura nasale e la densità cellulare dopo la crioconservazione vengono eseguiti in modo efficiente, le cellule HNE possono essere biobancate con successo. Inoltre, studi di corrente di cortocircuito dimostrano che lo scongelamento da congelamento non modifica significativamente le proprietà elettrofisiologiche delle cellule HNE e la risposta ai modulatori CFTR. Nelle condizioni di coltura utilizzate in questo studio, quando meno di 2 x 106 cellule sono congelate per crioviale, il tasso di fallimento è molto alto. Si consiglia di congelare almeno 3 x 106 cellule per crioviale. Mostriamo che le terapie duali che combinano un correttore CFTR con un potenziatore CFTR hanno un'efficacia di correzione comparabile per l'attività CFTR nelle cellule HNE F508del-omozigoti. La tripla terapia VX-445 + VX-661 + VX-770 ha aumentato significativamente la correzione dell'attività CFTR rispetto alla doppia terapia VX-809 + VX-770. La misura dell'attività del CFTR nelle cellule HNE è un promettente biomarcatore pre-clinico utile per guidare la terapia con modulatori CFTR.

Introduzione

La fibrosi cistica (CF) è una malattia autosomica recessiva derivante da mutazioni nel gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) che portano all'assenza o alla disfunzione della proteina CFTR, un canale anionico situato sulla superficie apicale dell'epitelio 1,2. I recenti progressi nella terapia CFTR hanno migliorato la prognosi della malattia e gli ultimi farmaci approvati che combinano correttori CFTR e potenziatori CFTR hanno portato a importanti miglioramenti nella funzione polmonare e nella qualità della vita per i pazienti CF portatori della mutazione più frequente p.Phe508del mutazione (F508del)3,4. Nonostante questo promettente progresso terapeutico, circa il 10% dei pazienti con FC non è idoneo in quanto porta mutazioni che non sono salvabili da questi modulatori CFTR. Per questi pazienti, c'è la necessità di testare altri farmaci o combinazioni di farmaci per trovare la combinazione più efficiente per mutazioni specifiche, evidenziando l'importanza di terapie personalizzate.

Le cellule epiteliali nasali umane (HNE) sono facili da raccogliere con una spazzolatura nasale semplice e non invasiva e consentono la quantificazione del trasporto ciclico di cloruro mediato da AMP (Cl−) come indice della funzione CFTR. Le cellule HNE producono un modello accurato delle vie aeree umane, ma la loro durata è limitata in coltura. Grazie all'ottimizzazione delle tecniche di coltura, le cellule HNE primarie derivate dal paziente possono essere riprogrammate condizionatamente con inibitore della chinasi rho-associata (ROCKi), amplificate e differenziate in un epitelio pseudo-stratificato in condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI) su filtri microporosi 5,6. Esistono numerosi protocolli di coltura per la coltura HNE (disponibili in commercio, senza siero, "fatti in casa", co-colture con cellule feeder, ecc.), E la scelta dei mezzi e delle condizioni di coltura sono state descritte per influenzare la crescita, la differenziazione della popolazione cellulare e la funzione epiteliale 7,8. Il protocollo qui presenta un metodo di amplificazione ROCKi semplificato, privo di alimentatore, che consente di ottenere con successo un gran numero di cellule HNE che vengono poi differenziate in ALI per i saggi di funzione CFTR.

Abbiamo dimostrato che, nelle cellule HNE differenziate, un trattamento di 48 ore con modulatori CFTR è sufficiente per indurre la correzione elettrofisiologica della corrente Cl-dipendente da CFTR e che la correzione osservata in vitro può essere correlata al miglioramento clinico del paziente9. Le cellule HNE, quindi, rappresentano un modello appropriato non solo per la ricerca fondamentale sulla FC, ma anche per gli studi pre-clinici con test del modulatore CFTR specifico per il paziente. In questo contesto di terapia personalizzata, l'obiettivo del protocollo era quello di convalidare che le cellule HNE crioconservate di pazienti CF, cresciute nelle nostre condizioni, fossero un modello appropriato per gli studi di correzione CFTR e risultati simili potevano essere attesi quando si confrontava il trasporto di Cl- CFTR dipendente da cellule fresche e congelate-scongelate. Lo studio ha anche valutato l'efficacia di diversi modulatori CFTR quando si utilizzano terapie doppie e triple.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti seguendo le linee guida e i regolamenti descritti dalla Dichiarazione di Helsinki e dalla legge Huriet-Serusclat sull'etica della ricerca umana.

1. Preparazione di palloni e mezzi diversi

  1. Preparare l'amplificazione, l'aria-liquido e il mezzo di congelamento come descritto nella Tabella 1.
  2. Preparare una soluzione madre di collagene umano IV sciogliendo 50 mg di collagene in 100 ml di acido acetico glaciale allo 0,2%. Mescolare su un agitatore magnetico per almeno 1 ora e filtrare sterilizzare la soluzione. Conservare a 4 °C per un massimo di 6 mesi in una bottiglia di vetro, al riparo dalla luce.
  3. Preparare una soluzione di lavoro di collagene IV diluendo la soluzione madre 1:5 in acqua a doppio distillato. Conservare a 4 °C per un massimo di 6 mesi.
  4. Rivestire i palloni di coltura cellulare in plastica o i filtri transwell con la soluzione di lavoro del collagene. Distribuire uniformemente 100 μL per 0,33 cm2 filtri transwell, 500 μL per 25 cm2 palloni e 1 mL per 75 cm2 palloni su tutta la superficie di crescita del pallone.
    NOTA: Questo può essere ottenuto inclinando delicatamente il pallone da un lato all'altro. In alternativa, per facilitare il rivestimento dei palloni, è possibile utilizzare un volume maggiore e, quando l'intera superficie è coperta uniformemente, la soluzione di collagene viene aspirata per lasciare solo il volume indicato. La soluzione di collagene aspirato può quindi essere utilizzata immediatamente per rivestire il pallone successivo (ad esempio, per tre palloni da 75 cm2 , distribuire uniformemente 3 ml di soluzione di collagene nel primo matraccio, aspirare 2 ml, che vengono poi utilizzati per il pallone successivo e così via).
  5. Lasciare i palloni di coltura cellulare nell'incubatrice per un minimo di 2 ore o durante la notte. Aspirare accuratamente il collagene e lasciare asciugare i palloni nell'incubatrice o sotto il cofano per un minimo di 20 minuti o durante la notte.
  6. Lavare con 10 ml di DPBS senza Mg2+ e Ca2+, lasciare asciugare nell'incubatrice e conservare in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce. Conservare i palloni per un massimo di 6 mesi a temperatura ambiente (RT).

2. Spazzolatura nasale

NOTA: Assicurarsi che la spazzolatura nasale venga eseguita mentre il partecipante non ha un'infezione acuta. Se i pazienti con FC presentano un'infezione polmonare, fare riferimento all'antibiogramma del paziente e aggiungere ulteriori antibiotici al mezzo di amplificazione. Le cellule epiteliali nasali umane sono state raccolte mediante spazzolatura nasale da pazienti F508del/F508del come descritto in precedenza9.

  1. Chiedere al paziente di soffiarsi il naso, quindi anestetizzare localmente la mucosa di entrambe le narici usando maglie di cotone imbevute di xilocaina al 5% con soluzione di nafazolina.
  2. Spazzolare delicatamente la parete mediale e il turbinato inferiore di entrambe le narici usando un pennello citologico. Immergere la spazzola in un tubo da 15 ml con 2 mL di mezzo di lavaggio disponibile in commercio; agitare delicatamente per staccare le cellule. Ripetere la spazzolatura nella seconda narice.
  3. Aggiungere i seguenti antibiotici al mezzo di lavaggio: penicillina (100 U / mL), streptomicina (100 μg / mL), tazocillina (10 μg / mL), amfotericina B (2,5 μg / mL) e colimicina (16 μg / mL).
    NOTA: le spazzolature nasali possono essere spedite a RT a laboratori dedicati per l'espansione e la coltura e possono essere seminate fino a 72 ore dopo la spazzolatura.

3. Isolamento dell'HNE

NOTA: gli HNE sono stati isolati dal pennello citologico, lavati con DPBS privo di Mg2+ e Ca2+, dissociati con tripsina allo 0,25% e seminati su un pallone di plastica da25 cm 2 come descritto in precedenza10.

  1. Staccare le cellule dal pennello citologico facendo passare ripetutamente il pennello attraverso un cono di pipetta da 1000 μL e risciacquando con 2 ml di DPBS privo di Mg2+ e Ca2+. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
  2. Risospese il pellet in tripsina allo 0,25% per 8-12 minuti per dissociare le cellule. Arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 5 ml del mezzo di amplificazione.
  3. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Risospesciare il pellet in 8 mL del mezzo di amplificazione e seminare su un pallone rivestito di collagene di 25 cm2 . Crescere a 37 °C e 5% di CO2. Questo corrisponde al passaggio 0.
  4. Il giorno seguente, sostituire il mezzo con 5 ml di terreno di amplificazione fresco e monitorare quotidianamente le cellule per l'attaccamento, la morfologia (le cellule dovrebbero avere un aspetto coeso di ciottoli) e il numero.
    NOTA: La densità iniziale di semina varia a seconda della qualità della spazzolatura nasale e della proporzione di cellule epiteliali. Le cellule HNE appena isolate di solito raggiungono l'80% -90% di confluenza entro 3-10 giorni. Un tasso di crescita più lento è indicativo di cellule epiteliali insufficienti nel campione e deve essere scartato.

4. Amplificazione e passaggio di cellule epiteliali nasali umane

  1. Coltivare cellule epiteliali nasali umane nel mezzo di amplificazione a 37 °C e 5% di CO2 su palloni rivestiti di collagene fino all'80%-90% di confluenza, cambiando mezzo ogni 48-72 ore. Per i palloni da25 cm 2 , utilizzare 5 mL di terreno di amplificazione e 10 mL per 75 cm2 palloni.
  2. Quando le cellule raggiungono l'80% -90% di confluenza, lavare le cellule con 10 ml di DPBS privo di Mg 2+ e Ca2+, aspirare e scartare.
  3. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% per un matraccio da25 cm 2 (o 2 ml di tripsina per un matraccio da 75 cm2 ) e riportare all'incubatrice (37 °C, 5% CO2) per 8-12 min.
  4. Picchiettare saldamente il pallone, con il palmo della mano, per aiutare le cellule a staccarsi.
  5. Aggiungere 10 ml del mezzo di amplificazione per fermare la reazione enzimatica. Risciacquare energicamente il matraccio, utilizzando la pipetta da 10 ml per aspirare ed espellere il mezzo di amplificazione sulla superficie del pallone per risciacquare e staccare le cellule.
  6. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
  7. Risospendare il pellet in 5-10 ml del mezzo di amplificazione.
  8. Contare le cellule usando un emocitometro.
    NOTA: le celle possono essere congelate a questo punto (vedere i passaggi 5.1-5.3). Se è necessaria un'ulteriore amplificazione, riseminare su palloni rivestiti di collagene (un pallone da25 cm 2 può essere espanso in tre palloni da 75 cm2 , non è raccomandata una maggiore diluizione).

5. Crioconservazione delle cellule epiteliali nasali primarie

NOTA: Far crescere le cellule HNE fino al passaggio 1 prima del biobanking per ottenere abbastanza cellule per facilitare la crescita cellulare quando scongelate. Il biobanking è, tuttavia, possibile al passaggio iniziale 0 o al passaggio 2. Le seguenti fasi di crioconservazione sono adattate a tutti i passaggi.

  1. Dopo il conteggio delle cellule, centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante
  2. Risospesere il pellet nel mezzo di congelamento arricchito (Tabella 1) per ottenere 3 x 106-5 x 106 celle per mL e per crioviale.
  3. Congelare lentamente le cellule riducendo la temperatura a ~ 1 °C al minuto in un contenitore di criogelaggio appropriato a -80 °C. Il giorno successivo, spostare il campione conservato in un contenitore di stoccaggio dell'azoto per la conservazione a lungo termine (il presente studio è limitato a 17 mesi di conservazione).

6. Scongelamento delle cellule HNE amplificate congelate

  1. Riscaldare il bagno d'acqua a 37 °C. Preparare il mezzo di amplificazione come descritto nella Tabella 1 e riscaldare il mezzo a 37 °C.
  2. Rimuovere i crioviali dal serbatoio di stoccaggio dell'azoto e posizionarli rapidamente a bagnomaria, facendo attenzione a non immergere l'intera fiala nell'acqua. Rimuovere i crioviali dal bagno d'acqua quando rimane solo una piccola goccia congelata. Pulire il flaconcino con alcool al 70%, asciugare e posizionarlo sotto il cofano.
  3. Utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire le celle scongelate in un tubo vuoto da 15 ml.
  4. In modo a goccia, aggiungere 1 mL di terreno di amplificazione caldo. Dopo 1 min, aggiungere un altro 1 mL di mezzo di amplificazione e attendere un minuto aggiuntivo.
  5. Aggiungere 10 ml del mezzo di amplificazione e centrifugare per 2 minuti a 500 x g.
  6. Aspirare e scartare il surnatante. Risospesso il pellet di cella in un volume di mezzo di amplificazione necessario per raggiungere una densità cellulare di almeno 1 x 106 celle/ml.
  7. Seminare le cellule su un pallone rivestito di collagene contenente il mezzo di amplificazione.
    1. Se la crioviale contiene più di 4 x 106 cellule, seminare su un matraccio di 75 cm2 , in 10 ml del mezzo di amplificazione
    2. Se crioviale contiene meno di 4 x 106 cellule, cellule di semi su un matraccio di 25 cm2 , in 5 ml del mezzo di amplificazione
  8. Incubare a 37 °C, 5% CO2 , e osservare visivamente l'espansione cellulare nei prossimi 2-3 giorni.
  9. Quindi, eseguire l'amplificazione cellulare come descritto nella sezione 4.
    NOTA: se sono state raccolte poche cellule nel passaggio 4.7. (cioè, se si congela al passaggio 0 prima dell'espansione), passaggi 6.5. e 6.6. può essere omessa e le cellule possono essere seminate direttamente su un pallone rivestito di collagenedi 25 cm 2 senza centrifugazione. Il mezzo deve quindi essere cambiato il giorno seguente per rimuovere il dimetilsolfossido (DMSO).

7. Differenziazione delle cellule epiteliali nasali umane all'interfaccia aria-liquido

NOTA: gli HNE sono stati differenziati all'interfaccia aria-liquido come precedentemente descritto10.

  1. Seminare le cellule ad una densità di 330.000 cellule/filtro su 0,33 cm2 filtri porosi rivestiti di collagene e integrare con 300 μL del mezzo di amplificazione sul lato apicale e 900 μL del mezzo aria-liquido sul lato basolaterale.
  2. Dopo 3 giorni, aspirare il mezzo apicale e coltivare le cellule all'interfaccia aria-liquido per 3-4 settimane nel mezzo aria-liquido per stabilire un epitelio differenziato. Cambiare il mezzo basale ogni 48-72 ore.

8. Modulatori CFTR

  1. Preparare un mezzo aria-liquido contenente modulatori CFTR. Utilizzare VX-445, VX-661 e VX-809 a una concentrazione finale di 3 μM e VX-770 a 100 nM. Utilizzare il correttore ABBV-2222 alla concentrazione finale di 1 μM e il potenziatore ABBV-974 a 10 μM. Utilizzare il DMSO al 100% per sciogliere tutti i modulatori CFTR.
  2. Preparare un mezzo aria-liquido contenente la stessa quantità di DMSO al 100% del mezzo correttore.
  3. Aggiungere il mezzo contenente farmaci o DMSO sul lato basolaterale delle cellule HNE polarizzate coltivate a un'interfaccia aria-liquido e incubare per 24 ore nel 5% di CO2 a 37 °C.
  4. Dopo 24 ore, aspirare e scartare il mezzo e sostituirlo con un mezzo fresco preparato come nei passaggi 8.1-8.2., e incubare ulteriormente per un periodo di 24 ore in 5% CO2 a 37 °C.

9. Studi della camera di Ussing

  1. Misurare le misure di corrente di cortocircuito (Isc) in condizioni di tensione-morsetto come descritto in precedenza9.
    NOTA: La resistenza elettrica transepiteliale (TEER) delle colture è stata misurata con un voltmetro a bacchetta e solo le colture che raggiungevano almeno 200 Ω·cm2 sono state prese in considerazione per i seguenti esperimenti. I filtri delle celle HNE polarizzate sono stati montati in camere Ussing e le misurazioni della corrente di cortocircuito (Isc) sono state misurate in condizioni di tensione-morsetto.

10. Immunocitochimica

  1. Eseguire l'immuno-rilevamento come descritto in precedenza9.
    NOTA: l'immuno-rilevazione CFTR è stata eseguita utilizzando l'anticorpo monoclonale anti-CFTR C-terminale (24-1) durante la notte a una diluizione di 1/100. La colorazione zona-occludens-1 (ZO-1) (diluizione 1/500), alfa-tubulina (diluizione 1/300), Muc 5AC (diluizione 1/250) e citocheratina 8 (diluizione 1/250) sono state eseguite su filtri aggiuntivi. Dopo il lavaggio con PBS-Triton-X100 0,1%, gli anticorpi secondari di capra coniugati ad Alexa 488 o 594 sono stati aggiunti per 30 minuti in siero di capra al 10% (diluizione 1/1000). Dopo un lavaggio finale, i filtri sono stati tagliati dal supporto e montati con il mezzo di montaggio Vectashield contenente DAPI. Un microscopio confocale (63x/1.4 oil differential interference contrast λ blue PL APO objective) è stato utilizzato per catturare immagini, che sono state analizzate con il software ImageJ.

11. Analisi statistica

  1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software appropriato.
    NOTA: L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software S.A.S. Poiché sono stati ottenuti diversi filtri HNE per paziente e per condizione, i parametri quantitativi sono stati espressi come valori mediani (± SEM) per paziente. I confronti (media ± SD) sono stati effettuati utilizzando il test di rango firmato a coppie abbinate a Wilcoxon o il t-test non accoppiato.

Risultati

Le cellule HNE fresche coltivate all'interfaccia aria-liquido mostrano le caratteristiche tipiche dell'epitelio respiratorio polarizzato e differenziato valutate mediante immunocolorazione (Figura 1). Le cellule HNE si ri-differenziano in uno strato eterogeneo di cellule epiteliali (immunocolorazione positiva cheratina 8) che imitano la situazione in vivo di un epitelio respiratorio pseudo-stratificato composto da cellule caliciate (colorazione alfa-tubulina positiva) e cellule cali...

Discussione

L'uso di cellule epiteliali nasali derivate dal paziente come surrogati di cellule epiteliali bronchiali umane (HBE) per misurare l'attività CFTR nel contesto della medicina personalizzata è stato proposto come HNE riprodurre le proprietà delle cellule in coltura 9,11. Il forte vantaggio dell'HNE rispetto alle colture cellulari HBE è che vengono campionate facilmente e in modo non invasivo. Le misurazioni della corrente di cortocircuito nelle colture cellular...

Divulgazioni

Gli autori non riportano interessi finanziari concorrenti relativi a questa pubblicazione o produzione di video scientifici.

Riconoscimenti

Ringraziamo calorosamente tutti i pazienti e le loro famiglie per la partecipazione allo studio. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Associazione francese Vaincre la Mucoviscidose; Associazione francese ABCF 2 e Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
ABBV-2222SelleckchemS8535
ABBV-974SelleckchemS8698
Advanced DMEM/F-12Life Technologies12634010
Alexa 488 goat secondary antibodyInvitrogenA11001
Alexa 594 goat secondary antibodyInvitrogenA11012
Amphotericin BLife Technologies15290026
Anti-alpha-tubulin antibodyAbcamab80779
Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)R&D SystemsMAB25031
Anti-cytokeratin 8 antibodyProgen61038
Anti-Muc5AC antibodySanta Cruz Biotechsc-20118
Anti-ZO-1 antibodySanta Cruz Biotechsc-10804
Ciprofloxacinprovided by Necker Hospital Pharmacy
ColimycinSanofiprovided by Necker Hospital Pharmacy
Collagen type IVSigma-Aldrich MerckC-7521
cytology brushLaboratory GYNEAS02.104
DMSOSigma-Aldrich MerckD2650
EGFLife TechnologiesPHG0311
EpinephrinSigma-Aldrich MerckE4375
F12-Nutrient MixtureLife Technologies11765054
FBSLife Technologies10270106
FerticultFertipro NVFLUSH020
Flasks 25Thermo Scientific156.367
Flasks 75Thermo Scientific156.499
Glacial acetic acidVWR20104.298
HEPESSigma-Aldrich MerckH3375
HydrocortisoneSigma-Aldrich MerckSLCJ0893
InsulinSigma-Aldrich MerckI0516
Mg2+ and Ca2+-free DPBSLife Technologies14190094
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140130
TazocillinMylanprovided by Necker Hospital Pharmacy
Transwell FiltersSigma-Aldrich MerckCLS3470-48EA
Triton-X100Sigma-Aldrich MerckT8787
Trypsin 0,25%Life Technologies25200056
Vectashield mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
VX-445SelleckchemS8851
VX-661SelleckchemS7059
VX-770SelleckchemS1144
VX-809SelleckchemS1565
Xylocaine naphazoline 5%Aspen Franceprovided by Necker Hospital Pharmacy
Y-27632SelleckchemS1049

Riferimenti

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