Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لفحص التنوع البيولوجي للتربة للبحث عن السلالات الفطرية المشاركة في تدهور المواد المتمردة. أولا ، يتم عزل السلالات الفطرية القادرة على النمو على الأحماض الدبالية أو الليجنوسليلوز. ثم يتم اختبار نشاطها في كل من الفحوصات الأنزيمية وعلى الملوثات مثل الهيدروكربونات والبلاستيك.

Abstract

التلوث البيئي هو مشكلة متزايدة، وتحديد الفطريات المشاركة في عملية المعالجة الحيوية هو مهمة أساسية. تستضيف التربة تنوعا لا يصدق من الحياة الميكروبية ويمكن أن تكون مصدرا جيدا لهذه الفطريات المعالجة بيولوجيا. يهدف هذا العمل إلى البحث عن فطريات التربة ذات إمكانات المعالجة الحيوية باستخدام اختبارات فحص مختلفة. تم استخدام وسائط الاستزراع المعدني المكملة بمواد متمردة كمصدر وحيد للكربون كاختبارات نمو. أولا ، تم طلاء تخفيفات التربة على أطباق بتري مع تعديل الوسط المعدني بالأحماض الدبالية أو الليجنوسليلوز. تم عزل المستعمرات الفطرية المتنامية واختبارها على ركائز مختلفة ، مثل الخلائط المعقدة من الهيدروكربونات (الفازلين وزيت المحركات المستخدم) ومساحيق البوليمرات البلاستيكية المختلفة (PET ، PP ، PS ، PUR ، PVC). ارتبطت الاختبارات الأنزيمية النوعية باختبارات النمو للتحقيق في إنتاج الإستراز واللاكات والبيروكسيديا والبروتياز. وتشارك هذه الإنزيمات في عمليات التحلل الرئيسية للمواد المتمردة، ويمكن أن يكون لإفرازها التأسيسي بواسطة السلالات الفطرية التي تم فحصها القدرة على استغلالها في المعالجة البيولوجية. وتم عزل واختبار أكثر من 100 سلالة، وتم العثور على العديد من العزلات ذات الإمكانات الجيدة للمعالجة البيولوجية. في الختام ، تعد اختبارات الفحص الموصوفة طريقة سهلة ومنخفضة التكلفة لتحديد السلالات الفطرية ذات إمكانات المعالجة الحيوية من التربة. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن تخصيص اختبارات الفحص للملوثات المختلفة ، وفقا للمتطلبات ، عن طريق إضافة مواد متمردة أخرى إلى الحد الأدنى من وسائط الاستزراع.

Introduction

التربة هي عنصر أساسي للحياة على الأرض وهي أساس العديد من النظم الإيكولوجية. يمكن اعتبار المعادن والمواد العضوية والكائنات الحية الدقيقة في التربة نظاما واحدا ، مع وجود ارتباطات وتفاعلات وثيقة تحدث بينها. تفاعلات هذه المركبات لها تأثير مهم على العمليات الأرضية والجودة البيئية وصحة النظام الإيكولوجي1. يشكل تلوث التربة مشاكل بيئية خطيرة في جميع أنحاء العالم. إن التطبيق العشوائي والطويل الأجل والمفرط للمواد المتمردة والسامة ، مثل المبيدات الحشرية والمنتجات البترولية والبلاستيك والمواد الكيميائية الأخرى ، له آثار خطيرة على بيئة التربة ، ونتيجة لذلك ، يمكن أن يغير ميكروبات التربة. تتكون المجتمعات الميكروبية في التربة من مجموعة واسعة من الكائنات الحية في حالات فسيولوجية مختلفة ، معظمها من البكتيريا والفطريات. العديد من الملوثات في التربة لديها استقرار متوسط إلى طويل الأجل ، ويمكن أن يؤدي استمرارها إلى تطوير آليات تكيفية تسمح للكائنات الحية الدقيقة باستخدام المواد المتمردة كمغذيات 2,3. وبالتالي ، يمكن النظر في هذه الكائنات الحية الدقيقة لتقنيات المعالجة الحيوية.

تحاول المعالجة البيولوجية التخفيف من آثار التلوث باستخدام الكائنات الحية الدقيقة وإنزيماتها لتدهور النفايات أو تحويلها إلى مركبات أقل سمية أو غير سامة. تمتلك أنواع مختلفة من العتائق والبكتيريا والطحالب والفطريات هذه القدرة على المعالجة الحيوية4. نتيجة لإجراءاتها الخاصة بالتحلل البيولوجي ، تعد الفطريات كائنات حية واعدة بشكل خاص للمعالجة الحيوية. يمكنهم مهاجمة ركائز مختلفة باستخدام شبكة hyphal الخاصة بهم ، مما يمكنهم من اختراق مصفوفة التربة بشكل أكثر كفاءة من الكائنات الحية الدقيقة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يمكنهم الوصول إلى interstics التي يتعذر الوصول إليها حيث يصعب إزالة الملوثات5 ، ويمكنهم أيضا البقاء على قيد الحياة في مستويات الرطوبة المنخفضة6. علاوة على ذلك ، تقوم الفطريات بتوليف أشرطة مختلفة من الإنزيمات غير المحددة ، عادة لتحلل المواد المتمردة الطبيعية مثل السليلوز واللجنين والأحماض الدبالية. يمكن أن تشارك تلك التي تفتقر إلى الركيزة المستهدفة في تدهور مجموعة واسعة من الملوثات المتمردة ، مثل الهيدروكربونات والبلاستيك والمبيدات الحشرية7،8،9،10. لذلك ، على الرغم من أن العديد من الأنواع الفطرية قد تم الإبلاغ عنها بالفعل كعوامل معالجة بيولوجية ، إلا أن هناك اهتماما متزايدا باستكشاف الأنواع التي لم تتم دراستها بعد لاختيار المرشحين للمعالجة البيولوجية للمواد الملوثة المتمردة. الأنواع المعروفة بالفعل أن لها خصائص المعالجة الحيوية تنتمي إلى الفصيلة Ascomycota 11,12,13 ، Basidiomycota 14,15 ، و Mucoromycota. على سبيل المثال ، من المعروف جيدا أن أجناس البنسليوم والرشاشيات تشارك في تدهور الهيدروكربونات الأليفاتية13 ، والبوليمرات البلاستيكية المختلفة 16،17،18 ، والمعادن الثقيلة19 ، والأصباغ20. وبالمثل ، كشفت الدراسات التي أجريت على الفطريات القاعدية ، مثل Phanerochaete chrysosporium و Trametes المبرقشة ، عن تورطها في أكسدة المواد المتمردة مثل الهيدروكربونات العطرية13 والبلاستيك21. مثال آخر على الفطريات المشاركة في عمليات التحلل البيولوجي هي zygomycetes Rhizopus spp. و Mucor spp. و Cunninghamella spp.22,23. على وجه الخصوص ، Cunninghamella قادر على أوكسيديز الهيدروكربونات العطرية ويعتبر كائنا نموذجيا لدراسة إزالة السموم من المنتجات من مجموعة واسعة من xenobiotics13.

هناك العديد من الإنزيمات الفطرية المشاركة في العمليات التحلل الرئيسية للمواد المتمردة24,25 ، مثل الإستراز ، اللاكاس ، البيروكسيديز ، والبروتياز. Laccases هي أوكسيديات تحتوي على النحاس تنتج في الخلية وتفرز لاحقا ، والتي تسمح بأكسدة مجموعة متنوعة من المركبات الفينولية والعطرية. يمكن أن تتحلل الفينول الأورثو وبارا ديفينول ، والفينولات المحتوية على المجموعة الأمينية ، واللجنين ، والديامينات المحتوية على مجموعة الأريل26. تستخدم البيروكسيديات بيروكسيد الهيدروجين كوسيط لتحلل اللجنين والمركبات العطرية الأخرى. هناك العديد من البيروكسيديا المختلفة ، ولكن تلك التي لديها أكبر قدرة على تحلل المواد السامة هي بيروكسيديز اللجنين وبيروكسيديز المنغنيز27.

تنتمي الإستراز والبروتياز إلى مجموعة الإنزيمات خارج الخلية أو الخارجية ، والتي تعمل خارج خلاياها الأصلية ولكنها لا تزال مرتبطة بها. يمكن لهذه الإنزيمات تحفيز التحلل المائي للجزيئات المتمردة الكبيرة إلى جزيئات أصغر. نظرا لخصوصية الركيزة المنخفضة ، يمكن لهذه الإنزيمات أن تلعب دورا رئيسيا في المعالجة الحيوية لمختلف الملوثات ، مثل أصباغ المنسوجات والنفايات السائلة المنبعثة من صناعات اللب والورق ودباغة الجلود والمنتجات البترولية والبلاستيك والمبيدات الحشرية28،29،30.

وقد تم بالفعل نشر عدد من طرق الفحص لاختيار السلالات الفطرية المعالجة بيولوجيا. فعلى سبيل المثال، استخدم وسط الأجار القائم على القش للكشف عن الفطريات البيضاء المتعفنة ذات الإمكانات العالية في تحلل الهيدروكربونات العطرية المتعددة الحلقات31؛ وتم وضع قطع صغيرة من الخشب المتعفن على مستخلص الشعير أجار (MEA) لعزل الفطريات المتعفنة بالخشب32. ومع ذلك ، فإن معظم الطرق التي تم اقتراحها بالفعل تختار فطريات محددة للغاية لنشاطها المثير للاهتمام. يقترح هذا البحث نهجا أوسع لاختيار فطريات التربة مع مجموعة أوسع من الإجراءات. تعتمد الطريقة على الطلاء الأولي للتخفيفات التسلسلية لعينات التربة على وسط معدل بالأحماض الدبالية أو الليجنوسليلوز الممزوج بالمضادات الحيوية لاختيار الفطريات مع القدرة على تحلل هذه المواد المتمردة الطبيعية. الأحماض الدبالية و lignocellulose ، في الواقع ، هي مواد مقاومة للغاية للتحلل البيولوجي لأنها تحتوي على هياكل جزيئية معقدة للغاية ، وهذا يسمح لها بأن تكون مؤشرات ممتازة على القدرة على التحلل للفطريات المختبرة33,34. بعد ذلك ، يتم فحص الفطريات المختارة في الاختبارات الأولى لتحديد تلك التي لديها القدرة على تحلل ملوثات معينة مثل الفازلين وزيت المحرك المستخدم والبلاستيك. وأخيرا ، يتم إجراء اختبارات إنزيمية نوعية للكشف عن السلالات الفطرية القادرة على إنتاج إنزيمات تشارك في عمليات التحلل البيولوجي للمواد المتمردة. لهذا الغرض ، يتم إجراء اختبارات البروتياز والإستراز ، في حين يتم استخدام حمض الغال و guaiacol كمؤشرات على إنتاج اللاك وإنزيم لجنينوليتيك الآخر35,36. يتم استخدام هذه الركائز لأنه تم العثور على علاقة قوية بين قدرة الفطريات على أكسدتها إلى شكلها البني اللون وامتلاك القدرة على تحلل الليجنينوليك37،38،39.

من خلال هذه البروتوكولات ، من الممكن عزل السلالات الفطرية ذات الإمكانات التحلل العالية ومجموعة واسعة من الإجراءات مباشرة من عينات التربة. يمكن أن يساعد عزل هذه السلالات الفطرية في العثور على مرشحين جدد لأغراض المعالجة البيولوجية.

Protocol

1. اختيار السلالات الفطرية القادرة على تحلل المواد المتمردة من التربة

  1. إعداد محلول المضادات الحيوية.
    1. ضع البنسلين (50 مجم / لتر) والستربتومايسين (40 مجم / لتر) والكلورتتراسيكلين (40 مجم / لتر) والنيومايسين (100 مجم / لتر) والكلورامفينيكول (100 مجم / لتر) في 250 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات.
    2. قبل إضافة الكلورامفينيكول إلى محلول المضادات الحيوية ، قم بإذابته في 3 مل من الإيثانول ≥99٪.
    3. ضع محلول المضاد الحيوي على مقلب مغناطيسي (بدون حرارة) مع شريط تحريك مغناطيسي داخل المحلول لمدة 10 دقائق. تخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. إعداد وسائط النمو.
    1. ضع 1 غرام من حمض الدبالية التجاري ، و 3.26 غرام من مرق بوشنيل هاس (BH) ، و 15 غرام من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وأوتوكلافه لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية (أجار حمض الدبالية).
    2. ضعي أجار حمض الدبالية في أطباق بتري تحت خزانة تدفق صفائحية.
    3. ضع 4 غرام من الليجنوسليلوز ، و 3.26 غرام من BH ، و 15 غرام من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وأوتوكلافه لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية (lignocellulose agar).
    4. ضعي أجار الليجنوسليلوز في أطباق بتري تحت خزانة تدفق صفائحية.
    5. تحت خزانة تدفق صفائحية ، بعد أن تتصلب الوسائط في أطباق بتري ، قم بنقل 1 مل من محلول المضادات الحيوية إلى الأطباق المحضرة باستخدام حقنة معقمة مع مرشح 0.2 ميكرومتر لتعقيمها.
    6. قم بتوزيع محلول المضاد الحيوي بالتساوي على أسطح الألواح باستخدام موزع خلايا معقم على شكل حرف L يمكن التخلص منه واتركه يجف في الهواء تحت خزانة التدفق الرقائقي.
    7. ضع 20 جم من مرق مستخلص الشعير و 15 جم من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وأوتوكلافه لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية (مستخلص الشعير أجار - MEA).
    8. ضعي ال MEA في أطباق بتري تحت خزانة تدفق صفائحية.
  3. أخذ عينات التربة وتخفيفها.
    1. قم بأخذ عينة من التربة ذات الأهمية على عمق 10 سم ، وإزالة أي نباتات وعشب وأوراق ميتة من الطبقة العليا ، ووضعها في أكياس البولي إيثيلين المعقمة.
    2. بعد الوصول إلى المختبر ، قم بغربلة التربة باستخدام شبكة 2 مم ، وإزالة أي جذور وحطام نباتي.
    3. إذا لم يكن من الممكن المضي قدما في تحليل المصب على الفور ، فقم بتخزين عينات التربة المنخلة عند 4 درجات مئوية.
    4. من خلال العمل تحت خزانة تدفق صفحية ، ضع 1 غرام من التربة المنخلة في أنبوب معقم سعة 15 مل مع 10 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات (1 × 10-1 تخفيف). رج الأنبوب أفقيا لمدة 30 دقيقة.
    5. تحت خزانة تدفق صفحية ، قبل أن يستقر التعليق ، خذ 1 مل من التخفيف 1 × 10-1 باستخدام ماصة معقمة وانقلها إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات فارغ (1 × 10-2 تخفيف). دوامة ذلك بدقة.
    6. قبل أن يستقر التعليق ، خذ 1 مل من التخفيف 1 × 10-2 باستخدام ماصة معقمة وانقلها إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات فارغ (تخفيف 1 × 10-3). دوامة ذلك بدقة.
  4. طلاء تخفيفات التربة على وسائط انتقائية.
    1. من خلال العمل تحت خزانة تدفق صفائحية ، اجمع 100 ميكرولتر من التخفيف 1 × 10-3 باستخدام ماصة دقيقة مع نقطة معقمة ونقلها إلى طبق بتري أجار دبال. افعل ذلك لمدة 4 أو 5 أطباق بتري على الأقل.
    2. وزع التخفيف بالتساوي على سطح طبق بتري باستخدام موزع خلايا معقم على شكل حرف L يمكن التخلص منه.
    3. اتركيه يجف في الهواء لمدة 10-15 دقيقة تحت خزانة التدفق الرقائقي.
    4. كرر الخطوات 1.4.1.-1.4.3. باستخدام أطباق الليجنوسليلوز بيتري.
    5. احتضان في 25 درجة مئوية في الظلام لمدة أقصاها 15 يوما.
  5. عزل المستعمرات الفطرية نمت من وسائل الإعلام الانتقائية إلى وسائط النمو.
    1. بدءا من 3 أيام بعد التحضير ، تحقق من أطباق بتري الانتقائية المعدة يوميا لأي نمو مستعمرة فطرية لمدة أقصاها 15 يوما.
    2. تحقق من جميع المستعمرات الفطرية الموجودة بحثا عن أوجه التشابه. إذا لزم الأمر ، قم بإعداد شريحة ليتم ملاحظتها تحت المجهر الضوئي.
      ملاحظة: الهدف هو عزل أكبر عدد من المستعمرات الفطرية ، ولكن من الضروري تجنب عزل نفس السلالة الفطرية دائما من لوحات مختلفة ، لذلك هذا الفحص مهم جدا. ابحث عن مستعمرات ذات أشكال ماكرو وميكرومورفولوجية مختلفة.
    3. تحت خزانة التدفق الرقائقي أو في موقد بنسن ، اعزل كل سلالة فطرية مختارة عن طريق إزالة جزء صغير من الميسيليوم بلطف من المستعمرة باستخدام إبرة تلقيح معقمة ونقلها إلى طبق بتري جديد من MEA.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، من المهم جدا أن تكون دقيقا ودقيقا لأن هناك خطرا كبيرا من التلوث من المستعمرات الفطرية الأخرى الموجودة في طبق بتري الأصلي. إذا نمت أكثر من سلالة فطرية واحدة على صفيحة MEA الملقحة، كرر الخطوة 1.5.3.
    4. تحضن عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 7 أيام. هذه هي السلالات الفطرية التي سيتم اختبارها بشكل أكبر على مواد متمردة محددة.

2. اختبارات النمو على المواد المتمردة

  1. اختبار النمو على الفازلين.
    1. انقل 20 مل من BH السائل (3.26 جم / لتر من BH) إلى قوارير 50 مل وقم بتعقيمها عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    2. انقل 7 مل من الماء منزوع الأيونات إلى قوارير زجاجية سعة 15 مل وأضف بعض القطع من أغطية الزجاج المكسور إلى كل قارورة.
    3. قم بتعقيمها عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    4. تحت خزانة التدفق الرقائقي ، أضف 1 مل من الفازلين إلى كل قارورة BH سعة 50 مل باستخدام ماصة معقمة. احتفظ ببعض القوارير مع BH فقط كعنصر تحكم سلبي.
    5. تحت خزانة التدفق الرقائقي، قم بإزالة الميسيليوم على سطح الوسط من ألواح MEA مع السلالات الفطرية المختارة (المحضرة في الخطوة 1.5.3) باستخدام إبرة معقمة وانقلها إلى قوارير زجاجية سعة 15 مل مع الأغطية المكسورة.
    6. حرك كل قارورة على خلاط دوامة لمدة 2 دقيقة ، مما يسمح للأغطية المكسورة بقطع مكعب المستعمرة الفطرية ، مما يجعل التعليق الفطري.
    7. تطعيم كل قارورة بترولاتوم مع 200 ميكرولتر من التعليق الفطري. جعل اثنين من النسخ المتماثلة لكل سلالة فطرية.
    8. للتحكم السلبي ، ضع 200 ميكرولتر من التعليق الفطري في قوارير مع BH السائل فقط. علاوة على ذلك ، احتفظ بقريورتين مع الفازلين دون أي تلقيح فطري للتحقق من وجود تلوث في الوسط.
    9. احتضان القوارير عند 25 درجة مئوية في الظلام والتحقق منها بعد 15 يوما و 30 يوما من اللقاح.
  2. اختبار النمو على زيت المحرك المستخدم.
    1. ضع 3.26 جم من BH و 15 جم من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وأوتوكلافه لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية (BHA).
    2. ضعي BHA في أطباق بتري تحت خزانة تدفق صفائحية.
    3. عندما يصبح صلبا، انقل 500 ميكرولتر من زيت المحرك المستخدم إلى أطباق BHA Petri وقم بتوزيعه بالتساوي على أسطح الألواح باستخدام موزع خلايا معقم على شكل حرف L يمكن التخلص منه.
    4. قم بتلقيح كل لوحة BHA مستعملة لزيت المحرك مع كل سلالة فطرية ، وجمع الميسيليوم من الألواح المحضرة في الخطوة 1.5.3. اعمل في موقد بنسن أو تحت غطاء التدفق الرقائقي لتجنب التلوث. جعل اثنين من النسخ المتماثلة لكل سلالة فطرية.
    5. للسيطرة السلبية ، قم بتلقيح أطباق بتري مع BHA فقط. علاوة على ذلك ، احتفظ باثنين من أطباق زيت المحرك المستخدمة BHA Petri دون أي تلقيح فطري للتحقق من وجود تلوث في الوسط.
    6. احتضن أطباق بتري عند 25 درجة مئوية في الظلام وتحقق منها بعد 15 يوما و 30 يوما من اللقاح.
  3. اختبار النمو على البلاستيك.
    1. نقل 200 ميكرولتر من التعليق الفطري (الخطوات 2.1.5.-2.1.6) إلى صفيحة 96 ميكروويل. اصنع ثلاثة نسخ طبق الأصل من مزيج السلالة الفطرية والبلاستيك.
    2. إلى كل بئر مع التعليق الفطري ، أضف 10 ملغ من نوع مختلف من مسحوق البلاستيك (البولي إيثيلين تيريفثاليت - PET ، كلوريد البولي فينيل - PVC ، البولي إيثيلين عالي الكثافة - HDPE ، البوليسترين - PS ، البولي يوريثين - PUR).
    3. للتحكم السلبي ، بدلا من إضافة مسحوق البلاستيك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول BH المعقم إلى البئر مع التعليق الفطري. علاوة على ذلك ، لكل نوع من أنواع مسحوق البلاستيك ، املأ بئرا ب 200 ميكرولتر من محلول BH المعقم و 10 ملغ من كل غبار بلاستيكي للتحقق من تلوث الوسط.
    4. احتضان لوحات microwell عند 25 درجة مئوية في الظلام والتحقق منها بعد 15 يوما و 30 يوما من اللقاح.

3. الاختبارات الأنزيمية النوعية

  1. اختبار الإنزيمات المحللة للجينينولتيك النوعية.
    1. ضع 27 جم من مرق سكر العنب البطاطس (PD) و 15 جم من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وأوتوكلافه لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية (PDA).
    2. عندما يبرد الوسط قليلا ولكنه لا يزال سائلا ، أضف حمض الغاليك (5 جم / لتر) تحت غطاء تدفق صفائحي وقم بطحن الوسط في أطباق بتري.
    3. قم بتلقيح PDA + ألواح حمض الغال مع كل سلالة فطرية ، وجمع الميسيليوم من الألواح المحضرة في الخطوة 1.5.3. اعمل في موقد بنسن أو تحت غطاء التدفق الرقائقي لتجنب التلوث.
    4. كضوابط سلبية ، قم بإعداد أطباق بتري مع PDA فقط (بدون حمض غاليك) وتلقيحها بالسلالات الفطرية (واحدة لكل سلالة فطرية) ، بالإضافة إلى طبق بتري واحد مع PDA + حمض الغال وبدون تلقيح فطري.
    5. احتضن أطباق بتري على حرارة 25 درجة مئوية في الظلام وتحقق منها بعد 7 أيام من التطعيم.
  2. اختبار اللاكات النوعية اللونية.
    1. ضع 27 جم من PD و 15 جم من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وأوتوكلافه لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية (PDA).
    2. عندما يبرد الوسط قليلا ولكنه لا يزال سائلا ، أضف guaiacol (400 ميكرولتر / لتر) تحت غطاء تدفق صفحي وقم بوضعه في أطباق Petri.
    3. قم بتلقيح ألواح PDA + guaiacol مع كل سلالة فطرية ، وجمع الميسيليوم من الألواح المحضرة في الخطوة 1.5.3. اعمل في موقد بنسن أو تحت غطاء التدفق الرقائقي لتجنب أي تلوث.
    4. كضوابط سلبية ، قم بإعداد أطباق بتري مع PDA فقط (بدون guaiacol) وتلقيحها بالسلالات الفطرية (واحدة لكل سلالة فطرية) ، بالإضافة إلى طبق بتري واحد مع PDA + guaiacol ولا يوجد تلقيح فطري.
    5. احتضن أطباق بتري على حرارة 25 درجة مئوية في الظلام وتحقق منها بعد 7 أيام من التطعيم.
  3. اختبار البروتياز النوعي.
    1. تحضير وسط نعم بإضافة K 2 HPO4 (1 جم / لتر) ، KH 2 PO 4 (0.5 جم / لتر) ، MgSO 4 · 7H 2 O (0.5 جم / لتر) ، MnCl 2 · 4H 2 O (0.001 جم / لتر) ، CuCl 2 · 2H 2 O (1.4 × 10-5 جم / لتر) ، ZnCl 2 (1.1 × 10-5 جم / لتر) ، CoCl 2 ·6H 2 O (2× 10-5 جم / لتر) ، Na2MoO4·2H 2 O (1.3 × 10-5 جم / لتر) ، FeCl3 ·6H2O (7.5 × 10-5 جم / لتر) ، والجيلاتين / الببتون (0.02 جم / لتر) إلى الماء منزوع الأيونات.
    2. ضع وسط نعم على مقلب مغناطيسي (بدون حرارة) مع قضيب تحريك مغناطيسي داخل الوسط لمدة 10 دقائق.
    3. عندما تذوب جميع الأملاح في الوسط ، انقل 5 مل من المحلول إلى قوارير زجاجية معقمة سعة 20 مل وأوتوكلافها لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
    4. للتحكم السلبي ، قم بإعداد حوالي 20 مل من قوارير الزجاج المعقمة مع 5 مل من محلول BH وأوتوكلافها لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
    5. تحت خزانة التدفق الرقائقي ، انقل 200 ميكرولتر من التعليق الفطري (الخطوات 2.1.5.-2.1.6) لكل سلالة إلى قوارير YES المتوسطة المعقمة (قم بعمل نسختين متماثلتين على الأقل لكل سلالة فطرية). لكل سلالة فطرية ، أضف 200 ميكرولتر من نفس التعليق الفطري إلى قوارير BH المعقمة للحصول على تحكم سلبي.
    6. احتضن القوارير عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 21 يوما وتحقق منها كل 7 أيام.
  4. اختبار الاسترازات النوعية.
    1. تحضير توين 80 متوسطة عن طريق إضافة الببتون (10 جم / لتر) ، كلوريد الصوديوم (5 جم / لتر) ، CaCl2 (0.1 جم / لتر) ، و 10 مل من Tween 80 إلى 1 L من الماء منزوع الأيونات.
    2. ضع وسط Tween 80 على مقلب مغناطيسي (بدون حرارة) مع شريط تحريك مغناطيسي داخل الوسط لمدة 10 دقائق.
    3. عندما يذوب كل شيء داخل الوسط ، انقل 5 مل من المحلول إلى قوارير زجاجية معقمة سعة 20 مل وأوتوكلافها لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
    4. للتحكم السلبي ، قم بإعداد حوالي 20 مل من قوارير الزجاج المعقمة مع 5 مل من محلول BH وأوتوكلافها لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
    5. تحت خزانة التدفق الرقائقي ، انقل 200 ميكرولتر من التعليق الفطري (الخطوات 2.1.5.-2.1.6) لكل سلالة إلى قوارير Tween 80 متوسطة التعقيم (قم بعمل نسختين متماثلتين على الأقل لكل سلالة فطرية). لكل سلالة فطرية ، أضف 200 ميكرولتر من نفس التعليق الفطري إلى قوارير BH المعقمة للسيطرة السلبية.
    6. احتضن القوارير عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 21 يوما وتحقق منها كل 7 أيام.

النتائج

وسمحت أساليب الوسائط الانتقائية (القسم 1 من البروتوكول) بفحص التنوع البيولوجي الغني للتربة واختيار الفطريات ذات القدرة العالية على المعالجة البيولوجية. مع حمض الدبالية ووسائط الليجنوسليلوز ، تم عزل أكثر من 100 سلالة فطرية. أنتجت هذه الفطريات إنزيمات تشارك في التحلل البيولوجي للمواد المتم?...

Discussion

التنوع البيولوجي الغني للتربة هو مصدر وفير للفطريات التي تمتلك العديد من القدرات الأيضية ، وبعضها يمكن أن يكون مرشحا محتملا للمعالجة البيولوجية. اختبارات الوسائط الانتقائية (القسم 1 من البروتوكول) هي طرق سهلة الأداء وفعالة لعزل الفطريات القادرة على النمو على البوليمرات المعقدة الطبيعية ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نحن نقدر Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) من جامعة بافيا والبروفيسور سولفيغ توسي لإتاحة الفرصة لهذا العمل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96 microwell plateGreiner bio-one650185
AgarVWR84609.05
Bushnell-Haas BrothFlukaB5051
CaCl2Sigma-AldrichC5670
ChloroamphenicolEurobioGABCRL006Z
ChlortetracyclineSigma-AldrichY0001451
CoCl2·6H2OSigma-AldrichC8661
CuCl2·2H2OSigma-AldrichC3279
EthanolVWR Chemicals20821.296
FeCl3·6H2OSigma-Aldrich236489
Filter 0.2 µmWhatman10462200
gallic acidSigma-AldrichG7384
Glass cover slipsBiosigmaVBS634
Glass vials 15 mLSciLabwareP35467
guaiacolSigma-AldrichG5502
High-density polyethylene (HDPE)Sigma-Aldrich434272
Humic acidsAldrich Chemistry53680
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Lignocellulose//Sterilized bioethanol production waste
L-shaped cell spreaderLaboindustria S.p.a21133
magnetic stirrerA.C.E.F8235
Malt Extract BrothSigma-Aldrich70146
MgSO4·7H2OSigma-AldrichM2643
Micropipette 1000 μLGilsonFA10006M
Micropipette 200  μLGilsonFA10005M
MnCl2·4H2OSigma-AldrichM5005
Na2MoO4·2H2OSigma-AldrichM1651
NaClSigma-AldrichS5886
NeomycinSigma-AldrichN0401000
PenicillinSigma-Aldrich1504489
peptoneSigma-Aldrich83059
Polyethylene terephthalate (PET)GoodfellowES306031
Petri dishesLaboindustria S.p.a21050
Petrolatum (Paraffin liquid)A.C.E.F009661
Potato Dextrose BrothSigma-AldrichP6685
Polystyrene (PS)Sigma-Aldrich331651
Polyurethane (PUR)Sigma-AldrichGF20677923
Polyvinyl chloride (PVC)Sigma-Aldrich81388
Sterile falcon tubeGreiner bio-one227 261
Sterile glass vials 20 mLSigma-AldrichSU860051
Sterile point 1000  μLGilsonF172511
Sterile point 200  μLGilsonF172311
Sterile polyethylene bagsWHIRL-PAKB01018
sterile syringeRays5523CM25
StreptomycinSigma-AldrichS-6501
Tween 80Sigma-AldrichP1754
Used engine oil//complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company
Vials 50 mLSigma-Aldrich33108-U
ZnCl2Sigma-AldrichZ0152

References

  1. Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
  2. Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
  3. Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
  4. Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation - A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
  5. Dix, N. J., Webster, J. . Fungal Ecology. , (1995).
  6. Magan, N., Esser, K., Lemke, P. A. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. 4, 99-114 (2007).
  7. Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
  8. Hasan, I. F., AI-Jawhari, V., Kumar, M., Kumar, R., Prasad, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. , (2018).
  9. Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
  10. Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
  11. Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
  12. Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
  13. Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 1-36 (2018).
  14. Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig's Corrosion Handbook. , 421-438 (2011).
  15. Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, 224-239 (2019).
  16. DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
  17. El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
  18. Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
  19. Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
  20. Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
  21. Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
  22. Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
  23. Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
  24. Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , (2019).
  25. Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
  26. Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , (2019).
  27. Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
  28. Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
  29. Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
  30. Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
  31. Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
  32. Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
  33. Stevenson, F. J. . Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , (1995).
  34. Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
  35. Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
  36. Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
  37. Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
  38. Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
  39. Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
  40. Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
  41. Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
  42. Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
  43. Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
  44. Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved