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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para el cribado de la biodiversidad del suelo para buscar cepas de hongos involucradas en la degradación de materiales recalcitrantes. En primer lugar, se aíslan cepas fúngicas capaces de crecer con ácidos húmicos o lignocelulosa. Su actividad se prueba tanto en ensayos enzimáticos como en contaminantes como hidrocarburos y plásticos.

Resumen

La contaminación ambiental es un problema creciente, y la identificación de hongos involucrados en el proceso de biorremediación es una tarea esencial. El suelo alberga una increíble diversidad de vida microbiana y puede ser una buena fuente de estos hongos biorremediativos. Este trabajo tiene como objetivo la búsqueda de hongos del suelo con potencial de biorremediación mediante el uso de diferentes pruebas de cribado. Los medios de cultivo minerales suplementados con sustancias recalcitrantes como única fuente de carbono se utilizaron como pruebas de crecimiento. En primer lugar, las diluciones del suelo se enchaparon en placas de Petri con medio mineral modificado con ácidos húmicos o lignocelulosa. Las colonias de hongos en crecimiento se aislaron y probaron en diferentes sustratos, como mezclas complejas de hidrocarburos (vaselina y aceite de motor usado) y polvos de diferentes polímeros plásticos (PET, PP, PS, PUR, PVC). Las pruebas enzimáticas cualitativas se asociaron con las pruebas de crecimiento para investigar la producción de esterasas, lacasas, peroxidasas y proteasas. Estas enzimas están involucradas en los principales procesos de degradación del material recalcitrante, y su secreción constitutiva por las cepas fúngicas examinadas podría tener el potencial de ser explotada para la biorremediación. Se aislaron y probaron más de 100 cepas, y se encontraron varios aislados con buen potencial de biorremediación. En conclusión, las pruebas de detección descritas son un método fácil y de bajo costo para identificar cepas de hongos con potencial de biorremediación del suelo. Además, es posible adaptar las pruebas de detección de diferentes contaminantes, de acuerdo con los requisitos, agregando otras sustancias recalcitrantes a los medios de cultivo mínimos.

Introducción

El suelo es un componente fundamental de la vida en la Tierra y es la base de muchos ecosistemas. Los minerales, la materia orgánica y los microorganismos en el suelo pueden considerarse como un sistema, con asociaciones e interacciones cercanas que ocurren entre ellos. Las interacciones de estos compuestos tienen un impacto importante en los procesos terrestres, la calidad ambiental y la salud de losecosistemas 1. La contaminación del suelo plantea graves problemas ambientales en todo el mundo. La aplicación indiscriminada, a largo plazo y excesiva de sustancias recalcitrantes y tóxicas, como pesticidas, productos derivados del petróleo, plásticos y otros productos químicos, tiene graves efectos en la ecología del suelo y, como resultado, puede alterar la microbiota del suelo. Las comunidades microbianas en los suelos están compuestas por una amplia gama de organismos en diferentes estados fisiológicos, siendo la mayoría bacterias y hongos. Muchos de los contaminantes en los suelos tienen estabilidad a mediano y largo plazo, y su persistencia puede conducir al desarrollo de mecanismos adaptativos que permitan a los microorganismos utilizar sustancias recalcitrantes como nutrientes 2,3. Estos microorganismos pueden, por lo tanto, ser considerados para las técnicas de biorremediación.

La biorremediación trata de mitigar los efectos de la contaminación mediante el uso de microorganismos y sus enzimas para la degradación o transformación de residuos en compuestos menos tóxicos o no tóxicos. Varias especies de arqueas, bacterias, algas y hongos poseen esta capacidad de biorremediación4. Como resultado de sus particulares acciones biodegradativas, los hongos son organismos especialmente prometedores para la biorremediación. Pueden atacar diferentes sustratos utilizando su red hifal, lo que les permite penetrar en la matriz del suelo de manera más eficiente que otros microorganismos. Además, pueden alcanzar intersticios inaccesibles donde los contaminantes son difíciles de eliminar5, y también pueden sobrevivir a bajos niveles de humedad6. Además, los hongos sintetizan diferentes casetes de enzimas inespecíficas, generalmente para degradar sustancias recalcitrantes naturales como la celulosa, la lignina y los ácidos húmicos. Aquellos que carecen del sustrato objetivo pueden estar involucrados en la degradación de una amplia gama de contaminantes recalcitrantes, como hidrocarburos, plásticos y pesticidas 7,8,9,10. Por lo tanto, aunque muchas especies de hongos ya han sido reportadas como agentes de biorremediación, existe un creciente interés en explorar especies que aún no se han estudiado para seleccionar candidatos para la biorremediación de sustancias contaminantes recalcitrantes. Las especies ya conocidas por tener propiedades de biorremediación pertenecen al filo Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 y Mucoromycota. Por ejemplo, los géneros Penicillium y Aspergillus son bien conocidos por estar involucrados en la degradación de hidrocarburos alifáticos13, diferentes polímeros plásticos 16,17,18, metales pesados19 y colorantes20. Del mismo modo, estudios realizados sobre hongos basidiomicetos, como Phanerochaete chrysosporium y Trametes versicolor, han revelado su implicación en la oxidación de materiales recalcitrantes como hidrocarburos aromáticos13 y plásticos21. Otro ejemplo de hongos implicados en los procesos de biodegradación son los zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp. y Cunninghamella spp.22,23. En particular, Cunninghamella es capaz de oxidar hidrocarburos aromáticos y se considera un organismo modelo para estudiar la desintoxicación de productos de una amplia gama de xenobióticos13.

Existen varias enzimas fúngicas implicadas en los principales procesos degradativos de materiales recalcitrantes 24,25, como la esterasa, la lacasa, la peroxidasa y la proteasa. Las lacasas son oxidasas que contienen cobre producidas en la célula y posteriormente secretadas, que permiten la oxidación de una variedad de compuestos fenólicos y aromáticos. Pueden degradar orto y para difenoles, los fenoles que contienen el grupo amino, la lignina y las diaminas que contienen el grupo arilo26. Las peroxidasas utilizan peróxido de hidrógeno como mediador para degradar la lignina y otros compuestos aromáticos. Hay muchas peroxidasas diferentes, pero las que tienen el mayor potencial para degradar sustancias tóxicas son la lignina peroxidasa y la manganeso peroxidasa27.

Las esterasas y proteasas pertenecen al grupo de las enzimas extracelulares o ectocelulares, que actúan fuera de sus células de origen pero que aún están unidas a ellas. Estas enzimas pueden catalizar la hidrólisis de moléculas recalcitrantes grandes en otras más pequeñas. Debido a su baja especificidad de sustrato, estas enzimas pueden desempeñar un papel clave en la biorremediación de diversos contaminantes, como colorantes textiles, efluentes liberados de las industrias de pulpa y papel y curtido de cuero, productos derivados del petróleo, plásticos y pesticidas 28,29,30.

Ya se han publicado varios métodos de cribado para seleccionar cepas fúngicas biorremediativas. Por ejemplo, el medio de agar a base de paja se ha utilizado para detectar hongos de podredumbre blanca con alto potencial en la degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP)31; y se han colocado pequeños trozos de madera podrida sobre agar de extracto de malta (MEA) para aislar los hongos que pudren la madera32. Sin embargo, la mayoría de los métodos que ya se han propuesto seleccionan hongos muy específicos para su actividad de interés. Esta investigación propone un enfoque más amplio para seleccionar hongos del suelo con un rango de acción más amplio. El método se basa en el recubrimiento inicial de diluciones en serie de muestras de suelo en un medio modificado con ácidos húmicos o lignocelulosa mezclada con antibióticos para seleccionar hongos con la capacidad de degradar estas sustancias recalcitrantes naturales. Los ácidos húmicos y la lignocelulosa, de hecho, son sustancias que son extremadamente resistentes a la biodegradación ya que tienen estructuras moleculares muy complejas, y esto les permite ser excelentes indicadores de la capacidad degradativa de los hongos probados33,34. Posteriormente, los hongos seleccionados en las primeras pruebas se examinan para identificar aquellos con el potencial de degradar contaminantes específicos como la vaselina, el aceite de motor usado y los plásticos. Finalmente, se realizan pruebas enzimáticas cualitativas para detectar cepas fúngicas capaces de producir enzimas implicadas en los procesos de biodegradación de sustancias recalcitrantes. Para ello se realizan ensayos de proteasa y esterasa, mientras que el ácido gálico y el guaiacol se utilizan como indicadores de la producción de lacasa y otras enzimas ligninolíticas35,36. Estos sustratos se utilizan porque se ha encontrado una fuerte correlación entre la capacidad de los hongos para oxidarlos a su forma de color marrón y la posesión de la capacidad ligninolítica 37,38,39.

A través de estos protocolos, es posible aislar cepas fúngicas con alto potencial degradativo y un amplio espectro de acción directamente de muestras de suelo. El aislamiento de estas cepas fúngicas podría ayudar a encontrar nuevos candidatos para fines de biorremediación.

Protocolo

1. Selección de cepas de hongos capaces de degradar materiales recalcitrantes del suelo

  1. Preparación de solución antibiótica.
    1. Ponga penicilina (50 mg/L), estreptomicina (40 mg/L), clortetraciclina (40 mg/L), neomicina (100 mg/L) y cloranfenicol (100 mg/L) en 250 ml de agua estéril desionizada.
    2. Antes de agregar cloranfenicol a la solución antibiótica, disolverlo en 3 ml de etanol ≥99%.
    3. Coloque la solución antibiótica en un agitador magnético (sin calor) con una barra de agitación magnética dentro de la solución durante 10 minutos. Guárdelo a 4 °C.
  2. Preparación de medios de crecimiento.
    1. Ponga 1 g de ácido húmico comercial, 3,26 g de caldo Bushnell-Haas (BH) y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y hágalo en autoclave durante 20 min a 121 °C (agar de ácido húmico).
    2. Coloque el agar de ácido húmico en placas de Petri debajo de un gabinete de flujo laminar.
    3. Poner 4 g de lignocelulosa, 3,26 g de BH y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y esterilizarlo en autoclave durante 20 min a 121 °C (agar lignocelulosa).
    4. Coloque el agar de lignocelulosa en placas de Petri debajo de un gabinete de flujo laminar.
    5. Bajo un gabinete de flujo laminar, después de que los medios se hayan solidificado en las placas de Petri, transfiera 1 ml de la solución antibiótica a las placas preparadas utilizando una jeringa estéril con un filtro de 0,2 μm para esterilizarla.
    6. Distribuya la solución antibiótica uniformemente en las superficies de la placa utilizando un esparcidor celular desechable estéril en forma de L y déjela secar al aire debajo del gabinete de flujo laminar.
    7. Poner 20 g de caldo de extracto de malta y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y autoclave durante 20 min a 121 °C (agar de extracto de malta - MEA).
    8. Coloque el MEA en placas de Petri debajo de un gabinete de flujo laminar.
  3. Muestreo de suelos y diluciones de suelos.
    1. Muestree el suelo de interés a una profundidad de 10 cm, eliminando cualquier planta, hierba y hojas muertas de la capa superior, y colóquelo en bolsas estériles de polietileno.
    2. Después de llegar al laboratorio, tamice el suelo con una malla de 2 mm, eliminando las raíces y los restos de plantas.
    3. Si no es posible proceder con el análisis aguas abajo de inmediato, almacene las muestras de suelo tamizadas a 4 °C.
    4. Trabajando bajo un gabinete de flujo laminar, coloque 1 g del suelo tamizado en un tubo estéril de 15 ml con 10 ml de agua desionizada estéril (1 x 10-1 dilución). Agite el tubo horizontalmente durante 30 min.
    5. Debajo de un gabinete de flujo laminar, antes de que la suspensión se asiente, tome 1 ml de la dilución 1 x 10-1 con una pipeta estéril y transfiérala a 9 ml de agua desionizada en blanco (1 x 10-2 dilución). Vórtice a fondo.
    6. Antes de que la suspensión se asiente, tome 1 ml de la dilución 1 x 10-2 con una pipeta estéril y transfiérala a 9 ml de agua desionizada en blanco (1 x 10-3 dilución). Vórtice a fondo.
  4. Diluciones de suelo de chapado en medios selectivos.
    1. Trabajando bajo un gabinete de flujo laminar, recolecte 100 μL de la dilución 1 x 10-3 usando una micropipeta con un punto estéril y transfiérala a una placa de Petri de agar húmico. Haga esto durante al menos 4 o 5 placas de Petri.
    2. Distribuya la dilución uniformemente en la superficie de la placa de Petri utilizando un esparcidor celular desechable estéril en forma de L.
    3. Deje que se seque al aire durante 10-15 minutos debajo del gabinete de flujo laminar.
    4. Repita los pasos 1.4.1.-1.4.3. utilizando placas de Petri de lignocelulosa.
    5. Incubar a 25 °C en la oscuridad durante un máximo de 15 días.
  5. Aislamiento de colonias de hongos cultivadas de medios selectivos a medios de crecimiento.
    1. A partir de 3 días después de la preparación, revise las placas de Petri de medios selectivos preparadas diariamente para detectar cualquier crecimiento de colonias de hongos durante un máximo de 15 días.
    2. Verifique todas las colonias de hongos presentes para ver si hay similitudes. Si es necesario, prepare una diapositiva para ser observada bajo un microscopio de luz.
      NOTA: El objetivo es aislar el mayor número de colonias de hongos, pero es necesario evitar aislar siempre la misma cepa fúngica de diferentes placas, por lo que esta comprobación es muy importante. Busca colonias con diferente macro y micromorfología.
    3. Debajo de un gabinete de flujo laminar o en un quemador Bunsen, aísle cada cepa fúngica elegida retirando suavemente una pequeña parte del micelio de la colonia con una aguja de inoculación estéril y transfiriéndola a una nueva placa de Petri MEA.
      NOTA: En esta fase, es muy importante ser delicado y preciso porque existe un alto riesgo de contaminación de las otras colonias de hongos presentes en la placa de Petri original. Si crece más de una cepa fúngica en la placa MEA inoculada, repita el Paso 1.5.3.
    4. Incubar a 25 °C en la oscuridad durante 7 días. Estas son las cepas de hongos que se probarán más a fondo en sustancias recalcitrantes específicas.

2. Pruebas de crecimiento de sustancias recalcitrantes

  1. Prueba de crecimiento en vaselina.
    1. Transfiera 20 ml de BH líquido (3,26 g/L de BH) a viales de 50 ml y esterilícelos en autoclave a 121 °C durante 20 min.
    2. Transfiera 7 ml de agua desionizada a viales de vidrio de 15 ml y agregue algunos trozos de hojas de vidrio rotas en cada vial.
    3. Esterilizarlos en autoclave a 121 °C durante 20 min.
    4. Debajo del gabinete de flujo laminar, agregue 1 ml de vaselina a cada vial de BH de 50 ml con una pipeta estéril. Mantenga algunos viales con solo BH como control negativo.
    5. Debajo del gabinete de flujo laminar, retire el micelio en la superficie del medio de las placas MEA con las cepas de hongos elegidas (preparadas en el paso 1.5.3.) con una aguja estéril y transfiéralo a viales de vidrio de 15 ml con las hojas de cubierta rotas.
    6. Agite cada vial en un mezclador de vórtice durante 2 minutos, permitiendo que las hojas de cubierta rotas corten el cubo de la colonia de hongos, haciendo una suspensión de hongos.
    7. Inocular cada vial de vaselina con 200 μL de suspensión fúngica. Haga dos réplicas para cada cepa fúngica.
    8. Para el control negativo, coloque 200 μL de suspensión fúngica en viales con solo BH líquido. Además, mantenga un par de viales con vaselina sin ninguna inoculación fúngica para verificar si hay contaminación en el medio.
    9. Incubar los viales a 25 °C en la oscuridad y revisarlos después de 15 días y 30 días desde el inóculo.
  2. Prueba de crecimiento en aceite de motor usado.
    1. Poner 3,26 g de BH y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y autoclave durante 20 min a 121 °C (BHA).
    2. Coloque el BHA en placas de Petri debajo de un gabinete de flujo laminar.
    3. Cuando se haya solidificado, transfiera 500 μL de aceite de motor usado a las placas de Petri BHA y distribúyalo uniformemente en las superficies de la placa utilizando un esparcidor de células desechable estéril en forma de L.
    4. Inocular cada placa BHA de aceite de motor usado con cada cepa fúngica, recogiendo el micelio de las placas preparadas en el Paso 1.5.3. Trabaje en un quemador Bunsen o debajo de una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Haga dos réplicas para cada cepa fúngica.
    5. Para el control negativo, inocule las placas de Petri solo con BHA. Además, mantenga un par de placas de Petri BHA de aceite de motor usado sin ninguna inoculación fúngica para verificar si hay contaminación en el medio.
    6. Incubar las placas de Petri a 25 °C en la oscuridad y comprobarlas después de 15 días y 30 días desde el inóculo.
  3. Prueba de crecimiento en plásticos.
    1. Transfiera 200 μL de suspensión fúngica (Pasos 2.1.5.-2.1.6.) a una placa de 96 micropocillos. Haga tres réplicas de la combinación de cepa fúngica y plástico.
    2. A cada pozo con la suspensión fúngica, agregue 10 mg de un tipo diferente de polvo plástico (tereftalato de polietileno - PET, cloruro de polivinilo - PVC, polietileno de alta densidad - HDPE, poliestireno - PS, poliuretano - PUR).
    3. Para el control negativo, en lugar de agregar el polvo de plástico, agregue 200 μL de solución BH esterilizada al pozo con la suspensión de hongos. Además, para cada tipo de polvo plástico, llene un pozo con 200 μL de solución BH esterilizada y 10 mg de cada polvo plástico para verificar la contaminación del medio.
    4. Incubar las placas de micropocillos a 25 °C en la oscuridad y comprobarlas después de 15 días y 30 días desde el inóculo.

3. Pruebas enzimáticas cualitativas

  1. Prueba colorimétrica cualitativa de enzimas ligninolíticas.
    1. Poner 27 g de caldo de dextrosa de patata (PD) y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y esterilizarlo en autoclave durante 20 min a 121 °C (PDA).
    2. Cuando el medio se haya enfriado un poco pero todavía esté líquido, agregue ácido gálico (5 g / L) debajo de una campana de flujo laminar y coloque el medio en placas de Petri.
    3. Inocular las placas de PDA + ácido gálico con cada cepa fúngica, recogiendo el micelio de las placas preparadas en el paso 1.5.3. Trabaje en un quemador Bunsen o debajo de una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.
    4. Como controles negativos, prepare placas de Petri con solo PDA (sin ácido gálico) e inocularlas con las cepas de hongos (una por cada cepa de hongos), así como una placa de Petri con PDA + ácido gálico y sin inoculación de hongos.
    5. Incubar las placas de Petri a 25 °C en la oscuridad y comprobarlas después de 7 días desde el inóculo.
  2. Prueba colorimétrica cualitativa de lacasas.
    1. Poner 27 g de PD y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y esterilizarlo en autoclave durante 20 min a 121 °C (PDA).
    2. Cuando el medio se haya enfriado un poco pero todavía esté líquido, agregue guaiacol (400 μL / L) debajo de una campana de flujo laminar y colóquelo en placas de Petri.
    3. Inocular las placas PDA + guaiacol con cada cepa fúngica, recogiendo el micelio de las placas preparadas en el paso 1.5.3. Trabaje en un quemador Bunsen o debajo de una campana de flujo laminar para evitar cualquier contaminación.
    4. Como controles negativos, preparar placas de Petri con solo PDA (sin guaiacol) e inocularlas con las cepas de hongos (una por cada cepa de hongos), así como una placa de Petri con PDA + guaiacol y sin inoculación de hongos.
    5. Incubar las placas de Petri a 25 °C en la oscuridad y comprobarlas después de 7 días desde el inóculo.
  3. Prueba cualitativa de proteasas.
    1. Prepare el medio SÍ añadiendo K2HPO4 (1 g/L), KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H2O (0,5 g/L), MnCl2·4H2O (0,001 g/L), CuCl2·2H2O (1,4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L), y gelatina/peptona (0,02 g/L) al agua desionizada.
    2. Coloque el medio YES en un agitador magnético (sin calor) con una barra de agitación magnética dentro del medio durante 10 minutos.
    3. Cuando todas las sales se hayan disuelto en el medio, transfiera 5 ml de la solución a viales de vidrio estéril de 20 ml y hágalos en autoclave durante 20 minutos a 121 °C.
    4. Para el control negativo, preparar unos viales de vidrio estéril de 20 ml con 5 ml de solución de BH y autoclave durante 20 min a 121 °C.
    5. Bajo un gabinete de flujo laminar, transfiera 200 μL de suspensión fúngica (Pasos 2.1.5.-2.1.6.) para cada cepa a los viales esterilizados del medio YES (haga al menos 2 réplicas por cepa fúngica). Para cada cepa fúngica, agregue 200 μL de la misma suspensión fúngica a los viales esterilizados BH para tener un control negativo.
    6. Incubar los viales a 25 °C en la oscuridad durante 21 días y revisarlos cada 7 días.
  4. Prueba cualitativa de esterasas.
    1. Prepare el medio Tween 80 agregando peptona (10 g / L), NaCl (5 g / L), CaCl2 (0.1 g / L) y 10 ml de Tween 80 a 1 L de agua desionizada.
    2. Coloque el medio Tween 80 en un agitador magnético (sin calor) con una barra de agitación magnética dentro del medio durante 10 minutos.
    3. Cuando todo esté fundido dentro del medio, transfiera 5 ml de la solución a viales de vidrio estéril de 20 ml y hágalos en autoclave durante 20 minutos a 121 °C.
    4. Para el control negativo, preparar unos viales de vidrio estéril de 20 ml con 5 ml de solución de BH y autoclave durante 20 min a 121 °C.
    5. Bajo un gabinete de flujo laminar, transfiera 200 μL de suspensión fúngica (Pasos 2.1.5.-2.1.6.) para cada cepa a los viales esterilizados medianos Tween 80 (haga al menos 2 réplicas por cepa fúngica). Para cada cepa fúngica, agregue 200 μL de la misma suspensión fúngica a los viales esterilizados BH para un control negativo.
    6. Incubar los viales a 25 °C en la oscuridad durante 21 días y revisarlos cada 7 días.

Resultados

Los métodos de medios selectivos (Sección 1 del protocolo) permitieron cribar la rica biodiversidad del suelo y seleccionar los hongos con alto potencial de biorremediación. Con el ácido húmico y los medios de lignocelulosa, se aislaron más de 100 cepas de hongos. Estos hongos produjeron enzimas involucradas en la biodegradación de materiales recalcitrantes naturales, que tienen una estructura química que se asemeja a muchos contaminantes. Sin embargo, las cepas fúngicas aisladas con los medios selectivos necesi...

Discusión

La rica biodiversidad del suelo es una fuente abundante de hongos que poseen numerosas capacidades metabólicas, algunas de las cuales podrían ser candidatos potenciales para la biorremediación. Las pruebas selectivas de medios (Sección 1 del protocolo) son métodos fáciles de realizar y efectivos para aislar hongos capaces de crecer en polímeros complejos naturales como su única fuente de carbono. Los hongos pueden producir hidrolasas extracelulares, inespecíficas y oxidorreductasas30 como...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Reconocemos a la Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) de la Universidad de Pavía y al profesor Solveig Tosi por brindar la oportunidad de este trabajo.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
96 microwell plateGreiner bio-one650185
AgarVWR84609.05
Bushnell-Haas BrothFlukaB5051
CaCl2Sigma-AldrichC5670
ChloroamphenicolEurobioGABCRL006Z
ChlortetracyclineSigma-AldrichY0001451
CoCl2·6H2OSigma-AldrichC8661
CuCl2·2H2OSigma-AldrichC3279
EthanolVWR Chemicals20821.296
FeCl3·6H2OSigma-Aldrich236489
Filter 0.2 µmWhatman10462200
gallic acidSigma-AldrichG7384
Glass cover slipsBiosigmaVBS634
Glass vials 15 mLSciLabwareP35467
guaiacolSigma-AldrichG5502
High-density polyethylene (HDPE)Sigma-Aldrich434272
Humic acidsAldrich Chemistry53680
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Lignocellulose//Sterilized bioethanol production waste
L-shaped cell spreaderLaboindustria S.p.a21133
magnetic stirrerA.C.E.F8235
Malt Extract BrothSigma-Aldrich70146
MgSO4·7H2OSigma-AldrichM2643
Micropipette 1000 μLGilsonFA10006M
Micropipette 200  μLGilsonFA10005M
MnCl2·4H2OSigma-AldrichM5005
Na2MoO4·2H2OSigma-AldrichM1651
NaClSigma-AldrichS5886
NeomycinSigma-AldrichN0401000
PenicillinSigma-Aldrich1504489
peptoneSigma-Aldrich83059
Polyethylene terephthalate (PET)GoodfellowES306031
Petri dishesLaboindustria S.p.a21050
Petrolatum (Paraffin liquid)A.C.E.F009661
Potato Dextrose BrothSigma-AldrichP6685
Polystyrene (PS)Sigma-Aldrich331651
Polyurethane (PUR)Sigma-AldrichGF20677923
Polyvinyl chloride (PVC)Sigma-Aldrich81388
Sterile falcon tubeGreiner bio-one227 261
Sterile glass vials 20 mLSigma-AldrichSU860051
Sterile point 1000  μLGilsonF172511
Sterile point 200  μLGilsonF172311
Sterile polyethylene bagsWHIRL-PAKB01018
sterile syringeRays5523CM25
StreptomycinSigma-AldrichS-6501
Tween 80Sigma-AldrichP1754
Used engine oil//complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company
Vials 50 mLSigma-Aldrich33108-U
ZnCl2Sigma-AldrichZ0152

Referencias

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