نموذج زرع الكلى التقويمي للفئران لرفض اللوغراف الكلوي

Summary

يساهم نموذج زرع الكلى التقويمي للفئران في التحقيق في آلية رفض اللوغراف الكلوي. يزيد النموذج الحالي من بقاء المتلقين على قيد الحياة دون التدخل في إمدادات الدم والارتجاع الوريدي في الجزء السفلي من الجسم باستخدام مفاغرة شاملة لزرع الكلى وطريقة "نفق" من طرف إلى جانب لمفاغرة الحالب والمثانة.

Abstract

يحد رفض الألوغراف الكلوي من بقاء المرضى على قيد الحياة على المدى الطويل بعد زراعة الكلى. زرع الكلى التقويمي للفئران هو نموذج أساسي للتحقيق في آلية رفض اللوغراف الكلوي في الدراسات قبل السريرية ويمكن أن يساعد في تطوير أساليب جديدة لتحسين البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل من allografts الكلى. عادة ما يتم إجراء زراعة الكلى من متبرع في زراعة الكلى العظمية للفئران عن طريق مفاغرة من طرف إلى جانب للشريان الأورطي للمتلقين والوريد الأجوف السفلي. في هذا النموذج، تم زرع كلية المتبرع باستخدام مفاغرة من طرف إلى طرف للشريان الكلوي والوريد الكلوي للمتلقين. تم مفاغرة الحالب لدى المتبرع إلى مثانة المتلقي بطريقة "نفق" من طرف إلى جانب. يساهم هذا النموذج في تحسين شفاء مفاغرة الحالب والمثانة ويزيد من بقاء المتلقين على قيد الحياة عن طريق تجنب التدخل في إمدادات الدم والارتجاع الوريدي في الجزء السفلي من الجسم. يمكن استخدام هذا النموذج للتحقيق في آليات الرفض المناعي والمرضي الحاد والمزمن للألوغرافات الكلوية. هنا ، تصف الدراسة البروتوكولات التفصيلية لعملية زرع الكلى التقويمية هذه بين الفئران.

Introduction

أصبح زرع الكلى النهج العلاجي الأكثر فعالية للمرضى الذين يعانون من فشل وظائف الكلى في المرحلة النهائية. ومع ذلك ، فإن الرفض الحاد بوساطة الخلايا التائية والرفض المناعي الخلطي بوساطة الأجسام المضادة يؤدي إلى الإصابة المرضية للألوغرفات الكلوية ويحد من بقاء المرضى على المدى القصير والطويل بعد زراعة الكلى^1،2،3. لسوء الحظ ، لا تزال المستحضرات الصيدلانية الفعالة التي تمنع رفض الألوغراف الكلوي غير موجودة ، لأن الآليات الدقيقة للرفض المناعي والمرضي للألوغام الكلوية غير واضحة. وبالتالي ، فإن الدراسات قبل السريرية التي توضح آليات الرفض المناعي والمرضي للألوغرافات الكلوية تساهم في إيجاد أهداف جديدة وتطوير أدوية فعالة ذات صلة لمنع رفض اللوغاريت الكلوي وإطالة بقاء المرضى على قيد الحياة في نهاية المطاف.

تم اقتراح العديد من الآليات المناعية والفسيولوجية المرضية المحتملة لرفض اللوغراف الكلوي مؤخرا في دراسات نموذج الفئران لزرع الكلى التقويمي⁴،⁵،^6،7،8. تقترح هذه النتائج العديد من الأهداف الجديدة والنهج المتداخلة ذات الصلة كعلاجات واعدة لقمع رفض اللوغراف الكلوي ، مثل العوامل التنظيمية المكملة والأجسام المضادة المضادة ل CD59⁶ ، والبروتيازوم المناعي ، ومثبطات الإيبوكسي كيتون ^7,8. وبالتالي ، فإن زرع الكلى التقويمي للفئران هو نموذج مثالي قبل السريري للتحقيق في آليات الرفض المناعي والإصابة المرضية للألوغرفات الكلوية بعد زرع الكلى.

تحولت زراعة كلى الفئران تدريجيا من زرع الكلى غير المتجانسة للمتبرع⁹ إلى زرع الكلى التقويمي باستخدام مفاغرة من طرف إلى جانب للأوعية أو باستخدام مفاغرة من طرف إلى طرف من الحالب باستخدام طريقة الكفة¹⁰،^11،12. تصف هذه الدراسة بروتوكولات مفصلة لزرع الكلى التقويمي بين الفئران باستخدام مفاغرة من طرف إلى طرف للشريان الكلوي والوريد الكلوي لدى المتلقين ، وطريقة "النفق" من طرف إلى جانب لمفاغرة الحالب والمثانة ، والتي تتجنب نقص تروية الجزء السفلي من الجسم وتجلط الوريد الأجوف السفلي وتقلل من تسرب البول بعد العملية الجراحية وتطور الحالب.

Protocol

تم الحصول على ذكور F344 و Lewis التي يبلغ عمرها 8-10 أسابيع (200 جم إلى 250 جم) تجاريا. تم إجراء عملية زرع الكلى اليسرى الخيفية بين ذكور F344 وفئران لويس. تم استخدام الفئران F344 كمتبرعين ومتلقين متلازمين ، وكانت فئران لويس بمثابة متلقين خيفيين. تم إجراء جميع إجراءات التعامل مع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر التي نشرتها المعاهد الوطنية للصحة ، وتمت الموافقة على جميع بروتوكولات التجارب الحيوانية من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى السرطان بجامعة تشونغتشينغ. جميع اللوازم المستخدمة أثناء الجراحة ، بما في ذلك الأدوات والحلول الجراحية ، معقمة. ويبين الشكل 1 مخططا للبروتوكول.

1. إجراءات المتبرعين

1. حث التخدير العام في الفئران بنسبة 5٪ استنشاق الأيزوفلوران باستخدام غرفة الحث. ثم، حقن البوبرينورفين تحت الجلد في 0.1 مغ/كغ لإجراء تسكين وقائي متزامن.
2. ضع الفئران على ظهرها وحافظ على التخدير مع استنشاق الإيسوفلوران بنسبة 2٪ باستخدام قناع الوجه على أنفه وفمه. ضع مواد تشحيم العين على العينين لتجنب تجفيف القرنية. يشير بطء معدل التنفس والإيقاع ، واختفاء منعكس القرنية ، وعدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم إلى فعالية التخدير.
3. حلق شعر البطن باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية وتعقيم الجلد باستخدام 0.5٪ من اليود و 70٪ من الكحول.
4. حقن 0.5٪ ليدوكائين تحت الجلد على طول خط الوسط من العانة السيمفيزية إلى subxiphoid للمسكنات المحلية ، ثم شق البطن وسحب فتح الشق باستخدام التراجع.
5. أخرج الأمعاء من الجانب الأيمن من الشق ولفها بشاش مبلل لمنعها من الجفاف. ثم، فضح الكلى اليسرى.
6. فصل الأنسجة الدهنية عن الكلى اليسرى والحالب باستخدام مسحات القطن ، ثم فصل الشريان الكلوي الأيسر والوريد باستخدام الملقط الدقيق تحت المجهر التشغيلي مع تكبير 20x. تخثر أي نزيف باستخدام التخثر الكهربائي ، إذا لزم الأمر.
7. قم بإجراء ربط الشريان الأورطي على ارتفاع حوالي 5 مم فوق الشريان الكلوي الأيسر باستخدام خياطة أحادية الخيوط من البولي أميد 4-0. ثم ، انقل الوريد الكلوي الأيسر البعيد إلى اقتران الوريد التناسلي الأيسر والوريد الكظري.
8. اغسل الكلى بمحلول UW البارد المثلج المكمل بالهيبارين (100 U / mL) باستخدام إبرة فروة الرأس 24 جم من الشريان الأورطي أسفل الشريان الكلوي الأيسر حتى يتلاشى لون الدم. وقت نقص التروية الدافئ هو 5 دقائق في المتوسط.
9. بعد عبور الشريان الكلوي الأيسر حوالي 2 مم بجوار الشريان الأورطي ، قم بفصل الكلى والحالب بمساعدة ملقط دقيق (حافظ على الأنسجة الضامة الطرفية لضمان تدفق الدم إلى الحالب). ثم ، قم بنقل الحالب بجوار المثانة والحفاظ على الكلى اليسرى للمتبرع في محلول UW البارد المثلج.
10. التضحية بالفئران المانحة بفقدان الدم عن طريق عبور الشريان الأورطي ووضعه لاحقا في صندوق CO₂ لضمان الموت.

2. إجراء المستلم

1. كرر الإجراء الموضح في الخطوات من 1.1 إلى 1.5 للفأر المستلم.
2. فصل الكلى اليسرى والحالب وكذلك الشريان الكلوي الأيسر والوريد الكلوي للفأر المتلقي باستخدام مسحات القطن والملقط الدقيق تحت المجهر التشغيلي مع تكبير 20x.
3. قص الشريان الكلوي الأيسر والوريد الكلوي في الجذر بواسطة مشابك الأوعية الدموية الدقيقة غير الغازية. ربط الحالب الأيسر حوالي 2-3 سم تحت الكلى مع 8-0 خيوط البولي أميد الأحادية وتعبرها عند الربط.
4. استئصال الكلية اليسرى الأصلية للمتلقي عن طريق عبور الشريان الكلوي الأيسر على بعد 2 مم من المشبك الوعائي الدقيق ، وعبور الوريد الكلوي القريب إلى اقتران الوريد التناسلي الأيسر والوريد الكظري. تخثر الوريد الكظري باستخدام التخثر الكهربائي ، إذا لزم الأمر.
5. زرع الكلى المانحة في الحفرة الكلوية اليسرى للفأر المتلقي ووضع الثلج حول كلية المتبرع المزروعة. مفاغرة الشريان الكلوي للمتبرع والوريد الكلوي إلى الشريان الكلوي والمتلقي الوريد الكلوي في نمط من طرف إلى طرف باستخدام خيوط أحادية 10-0 البولي أميد تحت المجهر التشغيلي مع تكبير 45x ، على النحو التالي.
6. مفاغرة الشريان الكلوي مع الغرز المتقطعة.
   1. ضع خيوط الإقامة في وضعي الساعة 12 و 6 من المفاغرة ، على التوالي. خياطة جانب واحد من المفاغرة بشكل متساو بين اثنين من خيوط البقاء مع 2-3 غرز باستخدام خياطة أحادية الخيوط 10-0 البولي أميد.
   2. اقلب خيوط الإقامة وخيط بالمثل الجانب الآخر من المفاغرة بين خيوط الإقامة مع 2-3 غرز.
7. مفاغرة الوريد الكلوي مع خيوط مستمرة.
   1. ضع خيوط الإقامة في وضعي الساعة 6 و 12 من المفاغرة ، على التوالي. قم بخياطة جانب واحد من المفاغرة من موضع الساعة 12 باستخدام 4-5 غرز باستخدام خيوط الجري ، ثم اربط خياطة الجري بخياطة البقاء في وضع الساعة 6 باستخدام خياطة أحادية الخيوط من البولي أميد 10-0.
   2. اقلب خيوط الإقامة وقم بالمثل بخياطة الجانب الآخر من المفاغرة من وضع الساعة 6 ، وأخيرا اربط خياطة الجري بخياطة البقاء في وضع الساعة 12.
8. إعادة دمج الكلى المانحة عن طريق إطلاق المشبك الوعائي الدقيق غير الغازي للوريد الكلوي أولا ؛ ثم ، حدد مواقع النزيف وقم بعمل غرز إضافية.
9. الافراج عن المشبك الأوعية الدموية الدقيقة غير الغازية من الشريان الكلوي ، وتحديد مواقع النزيف وجعل غرز إضافية. وقت نقص التروية البارد هو 45 دقيقة في المتوسط.
10. قم بخياطة نهاية الحالب المانح بخياطة أحادية الخيوط من البولي أميد 4-0 كسحب لسحب النهاية عبر "نفق" المثانة المتلقي تحت مجهر التشغيل مع تكبير 20x. بعد ذلك ، قم بعبور نهاية الحالب المانح مع خياطة خارج المثانة المتلقي. دع الحالب المتبرع يتقلص مرة أخرى إلى مثانة المتلقي.
11. إصلاح الحالب المتبرع مع المثانة المتلقي عن طريق خياطة الغدة الدرقية من الحالب المانحة مع طبقة العضلات من المتلقي المثانة في الخارج في أربعة أوضاع متساوية البعد باستخدام 8-0 خياطة البولي أميد أحادي الخيوط تحت مجهر التشغيل مع تكبير 45x.
12. ضع الأمعاء مرة أخرى في تجويف البطن وأغلق شق البطن بخيوط مستمرة في طبقة العضلات أولا ثم طبقة الجلد بخياطة أحادية الخيوط من البولي أميد 4-0.
13. ضع الفأر المتلقي على وسادة تدفئة 37 درجة مئوية في قفص جاف ونظيف. انتظر حتى يتعافى الفئران من التخدير.
14. حقن البوبرينورفين تحت الجلد (0.05 ملغم / كغ) في الفئران المتلقية كل 6 ساعات لمدة 48 ساعة للتسكين بعد الجراحة. حقن البنسلين في العضل (50000 U / kg) في الفئران المتلقية مرة واحدة في اليوم لمدة 3 أيام للوقاية من العدوى. يتم التضحية بالفئران المتلقية عن طريق وضعها في صندوق CO₂ لمراقبة الرفض المزمن للألوغراف الكلوي بعد 10 أسابيع من الزرع.

النتائج

في نموذج زراعة الكلى التقويمي للفئران هذا، تتحرك الفئران المتلقية بشكل طبيعي بعد العملية. لمراقبة الرفض المزمن للألوغراف الكلوي ، يتم تربية الفئران المتلقية لمدة 10 أسابيع بعد الزرع ، ويبلغ معدل البقاء الكلي للفئران المتلقية في هذه المرحلة الزمنية حوالي 90٪. الأسباب الرئيسية للوفاة هي الن...

Discussion

زرع الكلى في الفئران هو عمل صعب يتطلب مستوى عال من تقنيات الجراحة الدقيقة وقد تم تحسين تقنيات العملية عدة مرات. منذ البداية ، زرع غونزاليس وآخرون كلية المتبرع في عنق المتلقي وقاموا بمفاغرة الحالب المتبرع بالجلد⁹. ومع ذلك ، بسبب ارتفاع معدل الإصابة بالعدوى البولية وتضيق الحالب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
4-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C1048451
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Electrocoagulator	ZJ1099
F344 and Lewis rats	Center of Experimental Animals (Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China)	NA
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
Injection syringe (1 ml and 10 ml)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Penicillin G Sodium	Wuhan HongDe Yuexin pharmatech co.,Ltd	69-57-8
Scalp needle (24 G)	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science	R500
Small Animal Surgery Kit	Beyotime	FS500
Sodium chloride injection	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274
Tape	Minnesota Mining Manufacturing Medical Equipment (Shanghai) Co., LTD	1911N68
UW solution	Bristol-Myers Squibb Company	17HB0002