Un modèle de transplantation rénale orthotopique de rat pour le rejet de l’allogreffe rénale

Résumé

Le modèle de transplantation rénale orthotopique chez le rat contribue à étudier le mécanisme du rejet de l’allogreffe rénale. Le modèle actuel augmente la survie des receveurs sans interférence avec l’apport sanguin et le reflux veineux du bas du corps en utilisant une anastomose de bout en bout de l’implantation rénale et une méthode « tunnel » de bout en bout de l’anastomose uretère-vessie.

Résumé

Le rejet de l’allogreffe rénale limite la survie à long terme des patients après une transplantation rénale. La transplantation rénale orthotopique chez le rat est un modèle essentiel pour étudier le mécanisme du rejet de l’allogreffe rénale dans les études précliniques et pourrait aider au développement de nouvelles approches pour améliorer la survie à long terme des allogreffes rénales. L’implantation de rein de donneur dans la transplantation rénale orthotopique chez le rat est généralement réalisée par anastomose de bout en bout de l’aorte et de la veine cave inférieure. Dans ce modèle, le rein du donneur a été implanté en utilisant l’anastomose de bout en bout à l’artère rénale et à la veine rénale des receveurs. L’uretère du donneur a été anastomisé à la vessie du receveur selon une méthode de « tunnel » de bout en bout. Ce modèle contribue à une meilleure guérison de l’anastomose uretère-vessie et augmente la survie des receveurs en évitant les interférences avec l’approvisionnement en sang et le reflux veineux du bas du corps. Ce modèle peut être utilisé pour étudier les mécanismes du rejet immunitaire et pathologique aigu et chronique des allogreffes rénales. Ici, l’étude décrit les protocoles détaillés de cette transplantation rénale orthotopique entre rats.

Introduction

La transplantation rénale est devenue l’approche thérapeutique la plus efficace pour les patients atteints d’insuffisance rénale terminale. Cependant, le rejet aigu médié par les lymphocytes T et le rejet immunitaire humoral médié par l’alloanticorps entraînent des lésions pathologiques des allogreffes rénales et limitent la survie à court et à long terme des patients après une transplantation rénale ^1,2,3. Malheureusement, les produits pharmaceutiques efficaces qui empêchent le rejet des allogreffes rénales font encore défaut, car les mécanismes exacts du rejet immunitaire et pathologique des allogreffes rénales ne sont pas clairs. Par conséquent, les études précliniques qui élucident les mécanismes de rejet immunitaire et pathologique des allogreffes rénales contribuent à trouver de nouvelles cibles et à développer des produits pharmaceutiques efficaces pertinents pour prévenir le rejet des allogreffes rénales et éventuellement prolonger la survie des patients.

De nombreux mécanismes immunologiques et physiopathologiques potentiels du rejet de l’allogreffe rénale ont été proposés récemment dans des études sur des modèles de transplantation rénale orthotopique chez le rat ^4,5,6,7,8. Ces résultats proposent plusieurs nouvelles cibles et approches interférentes pertinentes en tant que thérapies prometteuses pour supprimer le rejet de l’allogreffe rénale, telles que les facteurs de régulation du complément et les anticorps anti-CD59⁶, l’immunoprotéasome et les inhibiteurs de l’époxycétone ^7,8. Ainsi, la transplantation rénale orthotopique chez le rat est un modèle préclinique idéal pour étudier les mécanismes de rejet immunitaire et de lésion pathologique des allogreffes rénales après une transplantation rénale.

La transplantation rénale chez le rat est progressivement passée de l’implantation hétérotopique des reins du donneur⁹ à l’implantation rénale orthotopique en utilisant l’anastomose de bout en bout des vaisseaux ou en utilisant l’anastomose de bout en bout de l’uretère en utilisant une méthode de brassard 10,11,12. La présente étude décrit des protocoles détaillés de transplantation rénale orthotopique entre rats utilisant l’anastomose de bout en bout à l’artère rénale et à la veine rénale des receveurs, et une méthode « tunnel » de bout en bout de l’anastose de la vessie uretère, qui évite l’ischémie du bas du corps et la thrombose de la veine cave inférieure et réduit les fuites urinaires postopératoires et la torsion de l’uretère.

Protocole

Des rats mâles consanguins âgés de 8 à 10 semaines F344 et Lewis (200 g à 250 g) ont été obtenus commercialement. Une transplantation allogénique du rein gauche a été réalisée entre des rats F344 mâles et des rats Lewis. Les rats F344 ont été utilisés comme donneurs et receveurs syngéniques, et les rats Lewis ont servi de receveurs allogéniques. Toutes les procédures de manipulation des animaux ont été menées conformément aux directives pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire publiées par les NIH, et tous les protocoles expérimentaux sur les animaux ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Hôpital universitaire du cancer de Chongqing. Toutes les fournitures utilisées pendant la chirurgie, y compris les instruments et solutions chirurgicaux, sont stériles. Un schéma du protocole est illustré à la figure 1.

1. Procédure du donneur

1. Induire une anesthésie générale chez le rat par inhalation d’isoflurane à 5% à l’aide d’une chambre d’induction. Ensuite, injectez par voie sous-cutanée de la buprénorphine à 0,1 mg / kg pour effectuer une analgésie préventive concomitante.
2. Placez le rat sur le dos et maintenez l’anesthésie avec une inhalation d’isoflurane à 2% à l’aide d’un masque facial sur le nez et la bouche. Appliquez du lubrifiant pour les yeux sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée. La lenteur de la fréquence respiratoire et du rythme, la disparition du réflexe cornéen et l’absence de réponse au pincement des orteils indiquent l’efficacité de l’anesthésie.
3. Rasez les poils abdominaux avec un rasoir électrique et stérilisez la peau en utilisant 0,5% d’iode et 70% d’alcool.
4. Injecter par voie sous-cutanée 0,5% de lidocaïne le long de la ligne médiane de la symphyse pubienne au sous-xixipoïde pour les analgésiques locaux, puis inciser l’abdomen et ouvrir l’incision à l’aide d’un rétracteur.
5. Retirez les intestins du côté droit de l’incision et enveloppez-les avec de la gaze humidifiée pour les empêcher de se dessécher. Ensuite, exposez le rein gauche.
6. Séparer les tissus adipeux du rein gauche et de l’uretère à l’aide de cotons-tiges, puis dissocier l’artère et la veine rénales gauches à l’aide de la micro-pince sous un microscope opératoire avec un grossissement de 20x. Coaguler tout saignement par électrocoagulation, si nécessaire.
7. Effectuer la ligature de l’aorte à environ 5 mm au-dessus de l’artère rénale gauche avec une suture monofilament en polyamide 4-0. Ensuite, transectez la veine rénale gauche distale à la conjonction de la veine génitale gauche et de la veine surrénale.
8. Rincer le rein avec une solution UW glacée complétée par de l’héparine (100 U / mL) à l’aide d’une aiguille de cuir chevelu de 24 G de l’aorte sous l’artère rénale gauche jusqu’à ce que le sang s’estompe en couleur. Le temps d’ischémie chaude est de 5 min en moyenne.
9. Après avoir transecté l’artère rénale gauche d’environ 2 mm à côté de l’aorte, dissocier le rein et l’uretère à l’aide de micro-forceps (préserver les tissus conjonctifs périphériques pour assurer l’apport sanguin à l’uretère). Ensuite, transectez l’uretère à côté de la vessie et préservez le rein gauche du donneur dans une solution UW glacée.
10. Sacrifiez le rat donneur avec perte de sang en transectant l’aorte et en la plaçant ensuite dans une boîte de CO₂ pour assurer la mort.

2. Procédure du destinataire

1. Répétez la procédure décrite aux étapes 1.1 à 1.5 pour le rat receveur.
2. Dissocier le rein gauche et l’uretère ainsi que l’artère rénale gauche et la veine rénale du rat receveur à l’aide de cotons-tiges et de micro-pinces sous un microscope opératoire avec un grossissement de 20x.
3. Coupez l’artère rénale gauche et la veine rénale à la racine à l’aide de pinces micro-vasculaires non invasives. Ligaturez l’uretère gauche à environ 2-3 cm sous le rein avec un 8-0 suture monofilament polyamide et transect à la ligature.
4. Réséquez le rein gauche natif du receveur en transectant l’artère rénale gauche à 2 mm de la pince micro-vasculaire et en transectant la veine rénale proximale à la conjonction de la veine génitale gauche et de la veine surrénale. Coaguler la veine surrénale en utilisant l’électrocoagulation, si nécessaire.
5. Implantez le rein du donneur dans la fosse rénale gauche du rat receveur et mettez de la glace autour du rein du donneur implanté. Anastomose l’artère rénale et la veine rénale du donneur à l’artère rénale et à la veine rénale du receveur selon un schéma de bout en bout à l’aide de sutures monofilaments en polyamide 10-0 sous un microscope opératoire avec grossissement 45x, comme suit.
6. Anastomose l’artère rénale avec des sutures interrompues.
   1. Placez les sutures de séjour à 12 et 6 heures des positions d’anastomose, respectivement. Suturer équidistant un côté de l’anastomose entre les deux sutures de séjour avec 2-3 points de suture à l’aide d’une suture monofilament en polyamide 10-0.
   2. Retournez les sutures de hauban et suturez de la même manière l’autre côté de l’anastomose entre les deux sutures de séjour avec 2-3 points de suture.
7. Anastomose la veine rénale avec des sutures continues.
   1. Placez les sutures de séjour à 6 et 12 heures des positions d’anastomose, respectivement. Suturez un côté de l’anastomose à partir de la position 12 heures avec 4-5 points de suture à l’aide des sutures de course, puis attachez la suture de course à la suture de séjour à la position de 6 heures avec une suture monofilament de polyamide 10-0.
   2. Retournez les sutures de hauban et suturez de la même manière l’autre côté de l’anastomose à partir de la position de 6 heures, et enfin attachez la suture de course à la suture de hauban à la position de 12 heures.
8. Répercutez le rein du donneur en libérant d’abord la pince micro-vasculaire non invasive de la veine rénale; ensuite, identifiez les sites de saignement et faites des points de suture supplémentaires.
9. Relâchez la pince micro-vasculaire non invasive de l’artère rénale, identifiez les sites de saignement et faites des points de suture supplémentaires. Le temps d’ischémie froide est de 45 min en moyenne.
10. Coudre l’extrémité de l’uretère donneur avec une suture monofilament en polyamide 4-0 comme remorquage pour faire glisser l’extrémité à travers le « tunnel » de la vessie du receveur sous un microscope opératoire avec un grossissement 20x. Ensuite, transectez l’extrémité de l’uretère du donneur avec la suture à l’extérieur de la vessie du receveur. Laissez l’uretère du donneur rétrécir dans la vessie du receveur.
11. Fixez l’uretère du donneur avec la vessie du receveur en cousant l’adventice de l’uretère du donneur avec la couche musculaire de la vessie du receveur à l’extérieur à quatre positions équidistantes à l’aide d’un 8-0 suture monofilament polyamide sous microscope opératoire avec grossissement 45x.
12. Replacez les intestins dans la cavité abdominale et fermez l’incision abdominale avec des sutures continues dans la couche musculaire d’abord, puis la couche de peau avec une suture monofilament en polyamide 4-0.
13. Placez le rat receveur sur un coussin chauffant à 37 °C dans une cage sèche et propre. Attendez que le rat se rétablisse de l’anesthésie.
14. Injecter par voie sous-cutanée de la buprénorphine (0,05 mg/kg) chez le rat receveur toutes les 6 h pendant 48 h pour une analgésie postopératoire. Injecter par voie intramusculaire de la pénicilline (50 000 U/kg) chez le rat receveur une fois par jour pendant 3 jours pour prévenir l’infection. Le rat receveur est sacrifié en le plaçant dans une boîte de CO₂ pour observer le rejet chronique de l’allogreffe rénale après 10 semaines de transplantation.

Résultats

Dans ce modèle de transplantation rénale orthotopique chez le rat, les rats receveurs se déplacent normalement après l’opération. Pour observer le rejet chronique de l’allogreffe rénale, les rats receveurs sont élevés pendant 10 semaines après la transplantation, et le taux de survie total des rats receveurs à ce stade est d’environ 90%. Les principales causes de décès sont les saignements et les fuites d’urine après l’opération. Les autres complications majeures comprennent les saignements pendan...

Discussion

La transplantation rénale chez le rat est un travail difficile nécessitant un haut niveau de techniques de micro-chirurgie et les techniques opératoires ont été optimisées à plusieurs reprises. Dès le début, Gonzalez et al. ont implanté le rein du donneur dans le cou du receveur et ont anastomisé l’uretère du donneur sur la peau⁹. Cependant, en raison de l’incidence élevée d’infection urinaire et de sténose de l’uretère du donneur, l’opération a été abandonnée en peu ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
4-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C1048451
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Electrocoagulator	ZJ1099
F344 and Lewis rats	Center of Experimental Animals (Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China)	NA
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
Injection syringe (1 ml and 10 ml)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Penicillin G Sodium	Wuhan HongDe Yuexin pharmatech co.,Ltd	69-57-8
Scalp needle (24 G)	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science	R500
Small Animal Surgery Kit	Beyotime	FS500
Sodium chloride injection	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274
Tape	Minnesota Mining Manufacturing Medical Equipment (Shanghai) Co., LTD	1911N68
UW solution	Bristol-Myers Squibb Company	17HB0002