Модель ортотопической трансплантации почки крыс для отторжения почечного аллотрансплантата

Резюме

Модель ортотопической трансплантации почек крыс способствует исследованию механизма отторжения почечного аллотрансплантата. Текущая модель повышает выживаемость реципиентов без вмешательства в кровоснабжение и венозный рефлюкс нижней части тела с помощью сквозного анастомоза имплантации почек и сквозного «туннельного» метода анастомоза мочеточника-мочевого пузыря.

Аннотация

Отторжение почечного аллотрансплантата ограничивает долгосрочную выживаемость пациентов после трансплантации почки. Ортотопическая трансплантация почек крыс является важной моделью для исследования механизма отторжения почечного аллотрансплантата в доклинических исследованиях и может помочь в разработке новых подходов к улучшению долгосрочной выживаемости почечных аллотрансплантатов. Имплантация донорской почки при ортотопической трансплантации почек крыс обычно выполняется путем сквозного анастомоза аорты реципиентов и нижней полой вены. В этой модели почка донора была имплантирована с использованием сквозного анастомоза в почечную артерию и почечную вену реципиентов. Мочеточник донора был анастомозирован в мочевой пузырь реципиента сквозным «туннельным» методом. Эта модель способствует лучшему заживлению анастомоза мочеточника и мочевого пузыря и повышает выживаемость реципиентов, избегая вмешательства в кровоснабжение и венозный рефлюкс нижней части тела. Данная модель может быть использована для исследования механизмов острого и хронического иммунного и патологического отторжения почечных аллотрансплантатов. Здесь исследование описывает подробные протоколы этой ортотопической трансплантации почек между крысами.

Введение

Трансплантация почки стала наиболее эффективным терапевтическим подходом для пациентов с терминальной стадией почечной функциональной недостаточности. Однако Т-клеточно-опосредованное острое отторжение и аллоантитела-опосредованное гуморальное иммунное отторжение приводят к патологическому повреждению почечных аллотрансплантатов и ограничивают краткосрочную и долгосрочную выживаемость пациентов после трансплантации почки ^1,2,3. К сожалению, эффективных фармацевтических препаратов, препятствующих отторжению почечных аллотрансплантатов, до сих пор не хватает, поскольку точные механизмы иммунного и патологического отторжения почечных аллотрансплантатов не ясны. Следовательно, доклинические исследования, которые выясняют механизмы иммунного и патологического отторжения почечных аллотрансплантатов, способствуют поиску новых мишеней и разработке соответствующих эффективных фармацевтических препаратов для предотвращения отторжения почечных аллотрансплантатов и в конечном итоге продления выживаемости пациентов.

Многие потенциальные иммунологические и патофизиологические механизмы отторжения почечного аллотрансплантата были предложены недавно в исследованиях модели ортотопической трансплантации почки^на крысах 4,5,6,7,8. Эти результаты предлагают несколько новых мишеней и соответствующих интерферирующих подходов в качестве перспективных терапевтических средств для подавления отторжения почечного аллотрансплантата, таких как регуляторные факторы комплемента и антитела против CD59⁶, иммунопротеасомы и ингибиторы эпоксикетона ^7,8. Таким образом, ортотопическая трансплантация почки крыс является идеальной доклинической моделью для исследования механизмов иммунного отторжения и патологического повреждения почечных аллотрансплантатов после трансплантации почки.

Трансплантация почки крыс постепенно перешла от гетеротопной имплантации почек донора⁹ к ортотопической почечной имплантации с использованием сквозного анастомоза сосудов или с использованием сквозного анастомоза мочеточника с использованием манжеты методом 10,11,12. В настоящем исследовании описаны подробные протоколы ортотопической трансплантации почек между крысами с использованием сквозного анастомоза к почечной артерии и почечной вене реципиентов, а также сквозной «туннельный» метод анастомоза мочеточника и мочевого пузыря, который позволяет избежать ишемии нижней части тела и тромбоза нижней полой вены и уменьшает послеоперационную утечку мочи и скручивание мочеточника.

протокол

Инбредные 8-10-недельные самцы F344 и крысы Льюиса (от 200 г до 250 г) были коммерчески получены. Аллогенная трансплантация левой почки была выполнена между самцами F344 и крысами Льюиса. Крысы F344 использовались в качестве доноров и сингенных реципиентов, а крысы Льюиса служили аллогенными реципиентами. Все процедуры обращения с животными проводились в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованными NIH, и все протоколы экспериментов на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Онкологической больницы Чунцинского университета. Все расходные материалы, используемые во время операции, включая хирургические инструменты и растворы, являются стерильными. Схема протокола показана на рисунке 1.

1. Донорская процедура

1. Индуцируют общую анестезию у крыс путем 5% вдыхания изофлурана с использованием индукционной камеры. Затем подкожно вводят бупренорфин в дозе 0,1 мг/кг для одновременного выполнения упреждающей анальгезии.
2. Поместите крысу на спину и поддерживайте анестезию с 2% ингаляцией изофлурана, используя маску для лица над носом и ртом. Нанесите смазку для глаз на глаза, чтобы избежать высыхания роговицы. Замедленная частота дыхания и ритм, исчезновение рефлекса роговицы, отсутствие реакции на защемление пальца ноги свидетельствуют об эффективности анестезии.
3. Сбрить волосы в животе электрической бритвой и стерилизовать кожу, используя 0,5% йода и 70% спирта.
4. Подкожно вводят 0,5% лидокаина вдоль средней линии от симфиза лобка до субксифоида для местных анальгетиков, а затем разрезают брюшную полость и вскрывают разрез с помощью втягивающего устройства.
5. Выньте кишечник с правой стороны разреза и оберните их смоченной марлей, чтобы они не высохли. Затем обнажите левую почку.
6. Отделите жировые ткани от левой почки и мочеточника с помощью ватных тампонов, а затем диссоциируют левую почечную артерию и вену с помощью микрощипцов под операционным микроскопом с 20-кратным увеличением. Коагулируйте любое кровотечение с помощью электрокоагуляции, если это необходимо.
7. Выполняют перевязку аорты примерно на 5 мм выше левой почечной артерии с помощью 4-0 полиамидного монофиламентного шва. Затем трансецируют левую почечную вену дистально к соединению левой генитальной вены и надпочечниковой вены.
8. Промывайте почки ледяным раствором UW, дополненным гепарином (100 Ед / мл), используя иглу для кожи головы 24 г из аорты ниже левой почечной артерии, пока кровь не исчезнет в цвете. Время теплой ишемии составляет в среднем 5 мин.
9. После перерезания левой почечной артерии примерно на 2 мм рядом с аортой диссоциируют почку и мочеточник с помощью микрощипцов (сохраняют периферические соединительные ткани для обеспечения кровоснабжения мочеточника). Затем переретезируйте мочеточник рядом с мочевым пузырем и сохраните донорскую левую почку в ледяном растворе UW.
10. Принесите в жертву крысу-донора с потерей крови, перерезав аорту и впоследствии поместив ее в коробку с_СО2 , чтобы обеспечить смерть.

2. Процедура получения

1. Повторите процедуру, описанную в шагах 1.1-1.5 для крысы-реципиента.
2. Диссоциируют левую почку и мочеточник, а также левую почечную артерию и почечную вену крысы-реципиента с помощью ватных тампонов и микрощипцов под операционным микроскопом с 20-кратным увеличением.
3. Обрежьте левую почечную артерию и почечную вену у корня неинвазивными микрососудистыми зажимами. Лигат левого мочеточника примерно на 2-3 см ниже почки с 8-0 полиамидный монофиламентный шов и транссектировать его при перевязке.
4. Резецировать нативную левую почку реципиента путем трансекции левой почечной артерии на расстоянии 2 мм от микрососудистого зажима и трансекции почечной вены проксимально к соединению левой генитальной вены и надпочечниковой вены. Коагулируйте надпочечниковую вену с помощью электрокоагуляции, если это необходимо.
5. Имплантировать донорскую почку в левую почечную ямку крысы-реципиента и положить лед вокруг имплантированной донорской почки. Анастомозировать почечную артерию донора и почечную вену к почечной артерии и почечной вене реципиента по сквозной схеме с использованием 10-0 полиамидных монофиламентных швов под операционным микроскопом с 45-кратным увеличением, как показано ниже.
6. Анастомоз почечной артерии с прерванными швами.
   1. Накладывайте на стойкие швы в 12 и 6-часовом положениях анастомоза соответственно. Равноудаленно зашивают одну сторону анастомоза между двумя остающимися швами с 2-3 швами с использованием 10-0 полиамидного монофиламентного шва.
   2. Переверните оставшиеся швы и аналогично зашить другую сторону анастомоза между двумя оставшимися швами с помощью 2-3 швов.
7. Анастомоз почечной вены сплошными швами.
   1. Накладывайте на стойкие швы в 6 и 12 часов в положениях анастомоза соответственно. Зашить одну сторону анастомоза из положения «12 часов» с помощью 4-5 швов с помощью бегущих швов, а затем привязать бегущий шов к удерживаемому шву в положении «6 часов» полиамидным монофиламентным швом 10-0.
   2. Переверните стоп-швы и аналогичным образом зашить другую сторону анастомоза из положения «6 часов» и, наконец, привяжите бегущий шов к стоп-шову в положении «12 часов».
8. Повторно перфузировать донорскую почку, сначала высвобождая неинвазивный микрососудистый зажим почечной вены; затем выявляют места кровотечения и делают дополнительные швы.
9. Отпустите неинвазивный микрососудистый зажим почечной артерии, определите места кровотечения и сделайте дополнительные швы. Время холодной ишемии составляет в среднем 45 мин.
10. Сшить конец донорского мочеточника полиамидным монофиламентным швом 4-0 в качестве буксира, чтобы протащить конец через «туннель» мочевого пузыря реципиента под операционным микроскопом с 20-кратным увеличением. После этого переведите конец донорского мочеточника швом за пределы мочевого пузыря реципиента. Позвольте донорскому мочеточнику сжаться обратно в мочевой пузырь реципиента.
11. Зафиксируйте донорский мочеточник с мочевым пузырем реципиента путем сшивания адвентиции донорского мочеточника мышечным слоем мочевого пузыря реципиента снаружи в четырех равноудаленных положениях с использованием 8-0 полиамидный монофиламентный шов под операционным микроскопом с 45-кратным увеличением.
12. Поместите кишечник обратно в брюшную полость и закройте брюшной разрез непрерывными швами в мышечном слое, а затем слой кожи швом 4-0 полиамидной мононити.
13. Поместите крысу-реципиента на грелку с температурой 37°C в сухую и чистую клетку. Подождите, пока крыса оправится от анестезии.
14. Подкожно вводят бупренорфин (0,05 мг/кг) крысе-реципиенту каждые 6 ч в течение 48 ч для послеоперационного обезболивания. Внутримышечно вводят пенициллин (50 000 Ед/кг) крысе-реципиенту один раз в день в течение 3 дней для профилактики инфекции. Крысу-реципиент приносят в жертву, помещая ее в коробку_СО2 для наблюдения за хроническим отторжением почечного аллотрансплантата после 10 недель трансплантации.

Результаты

В этой модели ортотопической трансплантации почки крыс крысы-реципиенты нормально двигаются после операции. Для наблюдения хронического отторжения почечного аллотрансплантата крыс-реципиентов выращивают в течение 10 недель после трансплантации, а общая выживаемость крыс-реципиенто...

Обсуждение

Трансплантация почек у крыс является сложной работой, требующей высокого уровня микрохирургических методов, и методы операции были оптимизированы несколько раз. С самого начала Gonzalez et al. имплантировали донорскую почку в шею реципиента и анастомозировали донорский мочеточник к коже

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
4-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C1048451
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Electrocoagulator	ZJ1099
F344 and Lewis rats	Center of Experimental Animals (Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China)	NA
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
Injection syringe (1 ml and 10 ml)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Penicillin G Sodium	Wuhan HongDe Yuexin pharmatech co.,Ltd	69-57-8
Scalp needle (24 G)	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science	R500
Small Animal Surgery Kit	Beyotime	FS500
Sodium chloride injection	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274
Tape	Minnesota Mining Manufacturing Medical Equipment (Shanghai) Co., LTD	1911N68
UW solution	Bristol-Myers Squibb Company	17HB0002