신장 동종이식편 거부반응을 위한 쥐 동위원소 신장 이식 모델

요약

쥐 동위원소 신장 이식 모델은 신장 동종이식편 거부의 메카니즘을 조사하는 데 기여한다. 현재의 모델은 신장 이식의 종단 간 해부학과 요관 방광 문합술의 종단 간 "터널"방법을 사용하여 혈액 공급 및 정맥 역류에 간섭하지 않고 수혜자의 생존을 증가시킵니다.

초록

신장 동종이식편 거부반응은 신장 이식 후 환자의 장기 생존을 제한한다. 쥐 동위원소 신장 이식은 전임상 연구에서 신장 동종이식편 거부의 메카니즘을 조사하는 데 필수적인 모델이며, 신장 동종이식편의 장기 생존을 개선하기 위한 새로운 접근법의 개발을 도울 수 있다. 쥐 동위원소 신장 이식에서 기증자 신장 이식은 일반적으로 수혜자의 대동맥 및 열등한 정맥 카바에 대한 종단 간 해부학에 의해 수행됩니다. 이 모델에서, 기증자의 신장은 수용자의 신장 동맥 및 신장 정맥에 종단 간 해부학을 사용하여 이식되었습니다. 기증자의 요관은 종단 간 '터널' 방법으로 수혜자의 방광에 해부학적으로 분석되었습니다. 이 모델은 요관 - 방광 해부학의 더 나은 치유에 기여하고 혈액 공급과 하체의 정맥 역류에 대한 간섭을 피함으로써 수혜자의 생존을 증가시킵니다. 이 모델은 신장 동종이식편의 급성 및 만성 면역 및 병리학적 거부의 메카니즘을 조사하는데 사용될 수 있다. 여기서, 본 연구는 래트 간의 이러한 동위원소 신장 이식의 상세한 프로토콜을 기술한다.

서문

신장 이식은 말기 신장 기능 장애 환자에게 가장 효과적인 치료 접근법이되었습니다. 그러나, T 세포-매개 급성 거부반응 및 동종이항체-매개 체액성 면역 거부는 신장 동종이식편의 병리학적 손상을 초래하고, 신장 이식 후 환자의 단기 및 장기 생존을 제한한다 ^1,2,3. 불행히도, 신장 동종이식편의 거부를 방지하는 효과적인 의약품은 신장 동종이식편의 면역 및 병리학적 거부의 정확한 기전이 명확하지 않기 때문에 여전히 부족합니다. 결과적으로, 신장 동종이식편의 면역 및 병리학적 거부의 메카니즘을 밝히는 전임상 연구는 새로운 표적을 찾고 신장 동종이식편의 거부를 방지하고 궁극적으로 환자의 생존을 연장시키는 관련 효과적인 의약품을 개발하는 데 기여한다.

신장 동종이식편 거부반응의 많은 잠재적인 면역학적 및 병리생리학적 메카니즘이 최근 동위원소 신장 이식의 래트 모델 연구에서 제안되었다 ^4,5,6,7,8. 이러한 발견은 보체 조절 인자 및 항-CD59 항체⁶, 면역프로테아좀 및 에폭시케톤 억제제 ^7,8과 같은 신장 동종이식편 거부반응을 억제하는 유망한 치료제로서 몇 가지 새로운 표적 및 관련 간섭 접근법을 제안한다. 따라서, 래트 동위원소 신장 이식은 신장 이식 후 신장 동종이식편의 면역 거부 및 병리학적 손상의 기전을 조사하는 이상적인 전임상 모델이다.

쥐 신장 이식은 기증자의 신장의 이종 국소 이식⁹에서 혈관의 종단 간 해부학을 사용하거나 커프 방법^10,11,12를 사용하여 요관의 종단 간 해부학을 사용하는 동형 외과 신장 이식으로 점차 이동했습니다. 본 연구는 수용자의 신장 동맥 및 신장 정맥에 대한 종단 간 해부학을 사용하는 쥐 간의 동형 외과 신장 이식의 상세한 프로토콜과 하체의 허혈과 열등한 정맥 카바의 혈전증을 피하고 수술 후 소변 누출 및 요관의 비틀림을 감소시키는 요관 - 방광 아나구마증의 종단 간 "터널"방법을 설명합니다.

프로토콜

사육 8-10주령의 수컷 F344 및 루이스 래트(200 g 내지 250 g)를 상업적으로 수득하였다. 동종이계 좌측 신장 이식은 수컷 F344와 루이스 래트 사이에서 수행되었다. F344 래트는 기증자 및 syngeneic 수용자로 사용되었고, 루이스 래트는 동종 수용자로 사용되었다. 모든 동물 취급 절차는 NIH가 발표 한 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침을 준수하여 수행되었으며, 모든 동물 실험 프로토콜은 충칭 대학 암 병원의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 수술 도구 및 용액을 포함하여 수술 중에 사용되는 모든 소모품은 멸균됩니다. 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 기증자 절차

1. 유도 챔버를 사용하여 5% 이소플루란 흡입에 의해 래트에서 전신 마취를 유도하였다. 그런 다음 0.1 mg / kg의 buprenorphine을 피하 주사하여 동시 선제 진통을 수행하십시오.
2. 쥐를 등에 대고 코와 입 위에 안면 마스크를 사용하여 2 % 이소 플루란 흡입으로 마취를 유지하십시오. 각막의 건조를 피하기 위해 눈 윤활제를 눈에 바르십시오. 느린 호흡률과 리듬, 각막 반사의 실종, 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족은 마취의 효과를 나타냅니다.
3. 전기 면도기로 복부 모발을 면도하고 0.5 % 요오드와 70 % 알코올을 사용하여 피부를 살균하십시오.
4. 심포시스 치골에서 국소 진통제를 위해 subxiphoid까지 중간 선을 따라 0.5 % 리도카인을 피하 주사 한 다음 복부를 절개하고 리트랙터를 사용하여 절개를 엽니 다.
5. 절개 오른쪽에서 내장을 꺼내어 축축한 거즈로 감싸서 건조하지 않도록하십시오. 그런 다음 왼쪽 신장을 노출시킵니다.
6. 면봉을 사용하여 왼쪽 신장과 요관에서 지방 조직을 분리 한 다음 20x 배율의 작동 현미경으로 마이크로 포셉을 사용하여 왼쪽 신장 동맥과 정맥을 해리시킵니다. 필요한 경우 전기 응고를 사용하여 출혈을 응고하십시오.
7. 4-0 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사로 왼쪽 신장 동맥 위의 약 5mm 위의 대동맥의 결찰을 수행하십시오. 그런 다음 왼쪽 신장 정맥을 왼쪽 생식기 정맥과 부신 정맥의 결합으로 원위 방향으로 횡단하십시오.
8. 혈액이 색이 사라질 때까지 왼쪽 신장 동맥 아래의 대동맥에서 24G 두피 바늘을 사용하여 헤파린 (100 U / mL)이 보충 된 얼음처럼 차가운 UW 용액으로 신장을 씻어 내십시오. 따뜻한 허혈 시간은 평균 5 분입니다.
9. 대동맥 옆의 왼쪽 신장 동맥을 약 2mm 횡단 한 후 마이크로 포셉의 도움으로 신장과 요관을 해리시킵니다 (요관에 혈액 공급을 보장하기 위해 말초 결합 조직을 보존하십시오). 그런 다음 방광 옆의 요관을 횡단하고 기증자 왼쪽 신장을 얼음처럼 차가운 UW 용액으로 보존하십시오.
10. 대동맥을 횡단하여 혈액을 잃은 공여체 쥐를 희생시키고, 이어서_CO2 박스에 넣어 사망을 보장한다.

2. 수취인 절차

1. 받는 사람 쥐에 대해 단계 1.1-1.5에 설명된 절차를 반복합니다.
2. 면봉과 마이크로 포셉을 사용하여 수용자 쥐의 왼쪽 신장 동맥과 신장 정맥뿐만 아니라 왼쪽 신장 동맥과 신장 정맥을 20x 배율의 작동 현미경으로 해리시킵니다.
3. 비침습적 미세혈관 클램프에 의해 왼쪽 신장 동맥과 신장 정맥을 뿌리에 클립합니다. 신장 아래 약 2-3cm 떨어진 왼쪽 요관을 8-0으로 리게이트하십시오. 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사와 결찰시 이를 횡단한다.
4. 미세혈관 클램프로부터 2mm 떨어진 왼쪽 신장 동맥을 횡단하고, 신장 정맥을 근위인 왼쪽 생식기 정맥과 부신 정맥의 결합으로 횡단하여 수용자의 본래 왼쪽 신장을 절제한다. 필요한 경우 전기 응고를 사용하여 부신 정맥을 응고시킵니다.
5. 기증자 신장을 수용자 쥐의 왼쪽 신장 fossa에 이식하고 이식 된 기증자 신장 주위에 얼음을 넣으십시오. 기증자의 신장 동맥 및 신장 정맥을 수용자의 신장 동맥 및 신장 정맥에 45x 배율의 작동 현미경으로 10-0 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 종단 간 패턴으로 아나스토모스(Anastomose)를 다음과 같이 한다.
6. 중단 된 봉합사로 신장 동맥을 해부학.
   1. 체재 봉합사를 각각 문합술의 12시 및 6시 위치에 놓습니다. 10-0 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 2-3 스티치로 두 개의 체류 봉합사 사이의 해부학의 한쪽면을 등거리로 봉합한다.
   2. 체재 봉합사를 뒤집고 마찬가지로 2-3 바늘로 두 개의 체재 봉합사 사이의 해부학의 다른면을 봉합하십시오.
7. 연속 봉합사로 신장 정맥을 해부학.
   1. 체재 봉합사를 각각 문합술의 6시 및 12시 위치에 놓습니다. 실행 봉합사를 사용하여 4-5 스티치로 12시 위치에서 해부학의 한쪽면을 봉합 한 다음 10-0 폴리아미드 모노 필라멘트 봉합사로 6시 위치의 스테이 봉합사에 달리기 봉합사를 묶습니다.
   2. 체재 봉합사를 뒤집어 6시 방향에서 해부학의 다른면을 유사하게 봉합하고 마지막으로 12시 위치의 정지 봉합사에 달리기 봉합사를 묶습니다.
8. 공여체 신장을 재관류시켜 신장 정맥의 비침습적 미세혈관 클램프를 먼저 방출함으로써; 그런 다음 출혈 부위를 확인하고 추가 바늘을 만드십시오.
9. 신장 동맥의 비 침습적 인 미세 혈관 클램프를 풀어 내고 출혈 부위를 확인하고 추가 바늘을 만듭니다. 감기 허혈 시간은 평균 45 분입니다.
10. 4-0 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사로 공여체 요관의 끝을 견인으로 꿰매어 20x 배율의 작동 현미경으로 받는 사람의 방광의 "터널"을 통해 끝을 드래그합니다. 그 후, 기증자 요관의 끝을 수용자의 방광 외부의 봉합사로 횡단하십시오. 기증자 요관이 수혜자의 방광으로 다시 수축하게하십시오.
11. 8-0을 사용하여 기증자 요관의 출현을 네 개의 등거리 위치에서 수혜자의 방광 바깥쪽의 근육층으로 바느질하여 기증자 요관을 수혜자의 방광으로 고정하십시오. 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사를 45x 배율의 작동 현미경으로 봉합합니다.
12. 내장을 복강에 다시 넣고 먼저 근육층에 연속 봉합사로 복부 절개를 한 다음 4-0 폴리아미드 모노 필라멘트 봉합사로 피부층을 닫습니다.
13. 수용자 쥐를 건조하고 깨끗한 케이지의 37 ° C 가열 패드에 놓습니다. 쥐가 마취에서 회복 될 때까지 기다리십시오.
14. 수술 후 진통제를 위해 48 시간 동안 매 6 시간마다 buprenorphine (0.05 mg / kg)을 수용자 쥐에 피하 주사하십시오. 감염 예방을 위해 페니실린 (50,000 U / kg)을 하루에 한 번 수령 쥐에게 근육 내 주사하십시오. 수용자 래트는 이식 10주 후에 신장 동종이식편의 만성 거부반응을 관찰하기 위해 이를_CO2 박스에 넣음으로써 희생된다.

결과

이 래트 동위원소 신장 이식 모델에서, 수용자 래트는 수술 후 정상적으로 움직인다. 신장 동종이식편의 만성 거부를 관찰하기 위해, 수용자 래트는 이식 후 10주 동안 양육되며, 이 시점에서 수용자 래트의 총 생존율은 약 90%이다. 사망의 주요 원인은 출혈과 수술 후 소변 누출입니다. 다른 주요 합병증으로는 수술 중 출혈, 신장 혈관의 혈전증 및 히드로 신증이 포함되며 각각의 발병률은 약 15 %, 2...

토론

쥐에서의 신장 이식은 높은 수준의 미세 수술 기술을 요구하는 도전적인 작업이며 수술 기술은 여러 번 최적화되었습니다. Gonzalez 등은 처음부터 기증자 신장을 수용자의 목에 이식하고 기증자 요관을 피부에 해부학적으로 분석했습니다⁹. 그러나 기증자 요관의 요로 감염과 협착의 발생률이 높기 때문에 짧은 시간 내에 수술이 중단되었습니다. 그 후, 기증자의 우측 신장의 임플...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
4-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C1048451
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Electrocoagulator	ZJ1099
F344 and Lewis rats	Center of Experimental Animals (Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China)	NA
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
Injection syringe (1 ml and 10 ml)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Penicillin G Sodium	Wuhan HongDe Yuexin pharmatech co.,Ltd	69-57-8
Scalp needle (24 G)	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science	R500
Small Animal Surgery Kit	Beyotime	FS500
Sodium chloride injection	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274
Tape	Minnesota Mining Manufacturing Medical Equipment (Shanghai) Co., LTD	1911N68
UW solution	Bristol-Myers Squibb Company	17HB0002