Ein orthotopes Nierentransplantationsmodell für die renale Allotransplantatabstoßung

Zusammenfassung

Das orthotope Nierentransplantationsmodell der Ratte trägt dazu bei, den Mechanismus der renalen Allotransplantatabstoßung zu untersuchen. Das aktuelle Modell erhöht das Überleben der Empfänger ohne Beeinträchtigung der Blutversorgung und venösen Reflux des Unterkörpers unter Verwendung einer End-to-End-Anastomose der Nierenimplantation und einer End-to-Side-"Tunnel" -Methode der Harnleiter-Blasen-Anastomose.

Zusammenfassung

Die Abstoßung des renalen Allotransplantats begrenzt das Langzeitüberleben der Patienten nach einer Nierentransplantation. Die orthotope Nierentransplantation von Ratten ist ein wesentliches Modell zur Untersuchung des Mechanismus der renalen Allotransplantatabstoßung in präklinischen Studien und könnte bei der Entwicklung neuartiger Ansätze zur Verbesserung des Langzeitüberlebens von renalen Allotransplantaten helfen. Die Implantation der Spenderniere bei der orthotopen Nierentransplantation von Ratten wird üblicherweise durch End-to-Side-Anastomose an der Aorta der Empfänger und der unteren Hohlvene durchgeführt. In diesem Modell wurde die Niere des Spenders mittels End-to-End-Anastomose in die Nierenarterie und Nierenvene des Empfängers implantiert. Der Harnleiter des Spenders wurde in einer End-to-Side-Tunnelmethode an der Blase des Empfängers anastomosiert. Dieses Modell trägt zu einer besseren Heilung der Harnleiter-Blasen-Anastomose bei und erhöht das Überleben der Empfänger, indem es Störungen der Blutversorgung und venösen Reflux des Unterkörpers vermeidet. Mit diesem Modell können die Mechanismen der akuten und chronischen Immun- und pathologischen Abstoßung von Nierenallotransplantaten untersucht werden. Hier beschreibt die Studie die detaillierten Protokolle dieser orthotopen Nierentransplantation zwischen Ratten.

Einleitung

Die Nierentransplantation hat sich zum effektivsten therapeutischen Ansatz für Patienten mit Nierenfunktionsstörungen im Endstadium entwickelt. T-Zell-vermittelte akute Abstoßung und alloantikörpervermittelte humorale Immunabstoßung führen jedoch zur pathologischen Schädigung von Nierenallotransplantaten und begrenzen das Kurz- und Langzeitüberleben von Patienten nach Nierentransplantation ^1,2,3. Leider fehlen immer noch die wirksamen Arzneimittel, die die Abstoßung von Nierenallotransplantaten verhindern, da die genauen Mechanismen der immunen und pathologischen Abstoßung von Nierenallotransplantaten nicht klar sind. Folglich tragen die präklinischen Studien, die die Mechanismen der immunen und pathologischen Abstoßung von Nierenallotransplantaten aufklären, dazu bei, neue Ziele zu finden und relevante wirksame Arzneimittel zu entwickeln, um die Abstoßung von Nierenallotransplantaten zu verhindern und schließlich das Überleben der Patienten zu verlängern.

Viele potenzielle immunologische und pathophysiologische Mechanismen der renalen Allotransplantatabstoßung wurden kürzlich in Rattenmodellstudien zur orthotopen Nierentransplantation 4,5,6,7,8 vorgeschlagen. Diese Ergebnisse schlagen mehrere neuartige Ziele und relevante Störansätze als vielversprechende Therapeutika zur Unterdrückung der renalen Allotransplantatabstoßung vor, wie z.B. komplementäre regulatorische Faktoren und Anti-CD59-Antikörper⁶, Immunproteasom und Epoxyketon-Inhibitoren ^7,8. Daher ist die orthotope Nierentransplantation bei Ratten ein ideales präklinisches Modell, um die Mechanismen der Immunabstoßung und der pathologischen Schädigung von Nierenallotransplantaten nach Nierentransplantationen zu untersuchen.

Die Nierentransplantation von Ratten hat sich allmählich von der heterotopen Implantation der Nieren des Spenders⁹ zur orthotopen renalen Implantation mit End-to-Side-Anastomose der Gefäße oder mit End-to-End-Anastomose des Harnleiters unter Verwendung einer Manschettenmethode^10,11,12 verlagert. Die vorliegende Studie beschreibt detaillierte Protokolle der orthotopen Nierentransplantation zwischen Ratten unter Verwendung der End-to-End-Anastomose der Nierenarterie und der Nierenvene der Empfänger sowie eine End-to-Side-"Tunnel" -Methode der Harnleiter-Blasen-Anastomose, die die Ischämie des Unterkörpers und die Thrombose der unteren Hohlvene vermeidet und den postoperativen Urinverlust und die Verdrehung des Harnleiters reduziert.

Protokoll

Inzucht von 8-10 Wochen alten männlichen F344- und Lewis-Ratten (200 g bis 250 g) wurden kommerziell gewonnen. Die allogene linke Nierentransplantation wurde zwischen männlichen F344- und Lewis-Ratten durchgeführt. F344-Ratten wurden als Spender und syngene Empfänger verwendet, und Lewis-Ratten dienten als allogene Empfänger. Alle Tierhandhabungsverfahren wurden in Übereinstimmung mit den vom NIH veröffentlichten Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, und alle Tierversuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee des Chongqing University Cancer Hospital genehmigt. Alle Verbrauchsmaterialien, die während der Operation verwendet werden, einschließlich chirurgischer Instrumente und Lösungen, sind steril. Ein Schema des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Ablauf des Spenders

1. Induzieren Sie eine Vollnarkose bei der Ratte durch 5% Isofluran-Inhalation unter Verwendung einer Induktionskammer. Dann injizieren Sie subkutan Buprenorphin bei 0,1 mg / kg, um gleichzeitig eine präventive Analgesie durchzuführen.
2. Legen Sie die Ratte auf den Rücken und halten Sie die Anästhesie mit 2% Isofluran-Inhalation unter Verwendung einer Gesichtsmaske über Nase und Mund aufrecht. Tragen Sie Augengleitmittel auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu vermeiden. Langsame Atemfrequenz und Rhythmus, das Verschwinden des Hornhautreflexes und die mangelnde Reaktion auf die Zehenklemme weisen auf die Wirksamkeit der Anästhesie hin.
3. Rasieren Sie die Bauchhaare mit einem elektrischen Rasierer und sterilisieren Sie die Haut mit 0,5% Jod und 70% Alkohol.
4. Subkutan injizieren Sie 0,5% Lidocain entlang der Mittellinie von der Symphyse pubis zu subxiphoid für lokale Analgetika, schneiden Sie dann den Bauch ein und ziehen Sie den Schnitt mit einem Retraktor auf.
5. Nehmen Sie den Darm von der rechten Seite des Einschnitts und wickeln Sie ihn mit angefeuchteter Gaze ein, um zu verhindern, dass er austrocknet. Legen Sie dann die linke Niere frei.
6. Trennen Sie Fettgewebe von der linken Niere und dem Harnleiter mit Wattestäbchen und dissoziieren Sie dann die linke Nierenarterie und Vena mit der Mikrozange unter einem Operationsmikroskop mit 20-facher Vergrößerung. Koagulieren Sie bei Bedarf Blutungen durch Elektrokoagulation.
7. Führen Sie eine Ligatur der Aorta etwa 5 mm über der linken Nierenarterie mit einer 4-0 Polyamid-Monofilamentnaht durch. Transezieren Sie dann die linke Nierenvene distal zur Konjunktion der linken Genitalvene und der Nebennierenvene.
8. Spülen Sie die Niere mit eiskalter UW-Lösung, ergänzt mit Heparin (100 U / ml), mit einer 24 G Kopfhautnadel von der Aorta unterhalb der linken Nierenarterie, bis das Blut in der Farbe verblasst. Die warme Ischämiezeit beträgt durchschnittlich 5 Minuten.
9. Nach der Transekt der linken Nierenarterie ca. 2 mm neben der Aorta dissoziieren Sie die Niere und den Harnleiter mit Hilfe einer Mikrozange (bewahren Sie das periphere Bindegewebe, um die Blutversorgung des Harnleiters sicherzustellen). Transektieren Sie dann den Harnleiter neben der Blase und bewahren Sie die linke Spenderniere in eiskalter UW-Lösung.
10. Opfere die Spenderratte mit Blutverlust, indem du die Aorta durchquerst und anschließend in eine CO_2-Box legst, um den Tod sicherzustellen.

2. Empfängerverfahren

1. Wiederholen Sie das in den Schritten 1.1-1.5 beschriebene Verfahren für die Empfängerratte.
2. Dissoziieren Sie die linke Niere und den Harnleiter sowie die linke Nierenarterie und Nierenvene der Empfängerratte mit Wattestäbchen und Mikropinzetten unter einem Operationsmikroskop mit 20-facher Vergrößerung.
3. Schneiden Sie die linke Nierenarterie und die Nierenvene an der Wurzel mit nichtinvasiven mikrovaskulären Klemmen ab. Ligatieren Sie den linken Harnleiter ca. 2-3 cm unterhalb der Niere mit einem 8-0 Polyamid monofil nähen und transektieren es bei der Ligatur.
4. Resektieren Sie die native linke Niere des Empfängers, indem Sie die linke Nierenarterie 2 mm von der Mikrovaskulärklemme entfernt transzieren und die Nierenvene proximal zur Verbindung der linken Genitalvene und der Nebennierenvene transzieren. Koagulieren Sie die Nebennierenvene bei Bedarf mittels Elektrokoagulation.
5. Implantieren Sie die Spenderniere in die linke Nierengrube der Empfängerratte und legen Sie Eis um die implantierte Spenderniere. Anastomose der Nierenarterie und Nierenvene des Spenders zur Nierenarterie und Nierenvene des Empfängers in einem End-to-End-Muster unter Verwendung von 10-0 Polyamid-Monofilamentnähten unter einem Operationsmikroskop mit 45-facher Vergrößerung, wie folgt.
6. Anastomose der Nierenarterie mit unterbrochenen Nähten.
   1. Platzieren Sie die Aufenthaltsnähte an der 12- bzw. 6-Uhr-Position der Anastomose. Nähen Sie eine Seite der Anastomose zwischen den beiden Bleibähten mit 2-3 Stichen mit einer 10-0 Polyamid-Monofilament-Naht.
   2. Drehen Sie die Bleibähte um und nähen Sie die andere Seite der Anastomose zwischen den beiden Bleibähten mit 2-3 Stichen.
7. Anastomose die Nierenvene mit kontinuierlichen Nähten.
   1. Platzieren Sie die Aufenthaltsnähte in den Positionen 6 bzw. 12 Uhr der Anastomose. Nähen Sie eine Seite der Anastomose aus der 12-Uhr-Position mit 4-5 Stichen unter Verwendung der laufenden Nähte und binden Sie dann die laufende Naht mit einer 10-0-Polyamid-Monofilamentnaht an der Stehnaht in der 6-Uhr-Position.
   2. Drehen Sie die Strebenähte um und nähen Sie die andere Seite der Anastomose aus der 6-Uhr-Position und binden Sie schließlich die laufende Naht an der Strebenaht in der 12-Uhr-Position.
8. Perfusionieren Sie die Spenderniere erneut, indem Sie zuerst die nichtinvasive mikrovaskuläre Klemme der Nierenvene freigeben; Identifizieren Sie dann die Blutungsstellen und machen Sie zusätzliche Stiche.
9. Lösen Sie die nichtinvasive mikrovaskuläre Klemme der Nierenarterie, identifizieren Sie die Blutungsstellen und machen Sie zusätzliche Stiche. Die Zeit für kalte Ischämie beträgt durchschnittlich 45 Minuten.
10. Nähen Sie das Ende des Spenderharnleiters mit einer 4-0 Polyamid-Monofilamentnaht als Schlepptau, um das Ende durch den "Tunnel" der Empfängerblase unter einem Operationsmikroskop mit 20-facher Vergrößerung zu ziehen. Danach transektieren Sie das Ende des Spenderharnleiters mit der Naht außerhalb der Blase des Empfängers. Lassen Sie den Spenderharnleiter wieder in die Blase des Empfängers schrumpfen.
11. Befestigen Sie den Spenderharnleiter mit der Blase des Empfängers, indem Sie die Adventitia des Spenderharnleiters mit der Muskelschicht der Blase des Empfängers außen an vier gleich weit entfernten Positionen mit einem 8-0 nähen Polyamid-Monofilament-Naht unter einem Operationsmikroskop mit 45-facher Vergrößerung.
12. Legen Sie den Darm zurück in die Bauchhöhle und schließen Sie den Bauchschnitt zuerst mit kontinuierlichen Nähten in der Muskelschicht und dann die Hautschicht mit einer 4-0 Polyamid-Monofilamentnaht.
13. Legen Sie die Empfängerratte auf ein 37 ° C-Heizkissen in einen trockenen und sauberen Käfig. Warten Sie, bis sich die Ratte von der Anästhesie erholt hat.
14. Subkutan wird Buprenorphin (0,05 mg/kg) zur postoperativen Analgesie alle 6 h für 48 h in die Empfängerratte injiziert. Injizieren Sie Penicillin (50.000 U / kg) intramuskulär in die Empfängerratte einmal täglich für 3 Tage zur Vorbeugung einer Infektion. Die Empfängerratte wird geopfert, indem sie in eine CO₂ -Box gelegt wird, um die chronische Abstoßung des renalen Allotransplantats nach 10 Wochen Transplantation zu beobachten.

Ergebnisse

In diesem orthotopen Nierentransplantationsmodell der Ratte bewegen sich die Empfängerratten nach der Operation normal. Um die chronische Abstoßung des renalen Allotransplantats zu beobachten, werden Empfängerratten für 10 Wochen nach der Transplantation aufgezogen, und die Gesamtüberlebensrate der Empfängerratten beträgt zu diesem Zeitpunkt etwa 90%. Die Haupttodesursachen sind Blutungen und Austreten von Urin nach der Operation. Zu den anderen Hauptkomplikationen gehören Blutungen während der Operation, Thromb...

Diskussion

Die Nierentransplantation bei der Ratte ist eine anspruchsvolle Arbeit, die ein hohes Maß an mikrochirurgischen Techniken erfordert, und die Operationstechniken wurden mehrmals optimiert. Von Anfang an implantierten Gonzalez et al. die Spenderniere in den Hals des Empfängers und anastomosierten den Spenderharnleiter auf die Haut⁹. Aufgrund der hohen Inzidenz von Harnwegsinfektionen und Stenosen des Spenderharnleiters wurde die Operation jedoch in kurzer Zeit abgebrochen. Anschließend wurde die ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
4-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C1048451
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Electrocoagulator	ZJ1099
F344 and Lewis rats	Center of Experimental Animals (Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China)	NA
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
Injection syringe (1 ml and 10 ml)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Penicillin G Sodium	Wuhan HongDe Yuexin pharmatech co.,Ltd	69-57-8
Scalp needle (24 G)	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science	R500
Small Animal Surgery Kit	Beyotime	FS500
Sodium chloride injection	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274
Tape	Minnesota Mining Manufacturing Medical Equipment (Shanghai) Co., LTD	1911N68
UW solution	Bristol-Myers Squibb Company	17HB0002