Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم البروتوكول طريقة عالية الإنتاجية لقياس استرخاء التبريد غير الكيميائي الضوئي عن طريق قياس فلوروفيل الكلوروفيل المعدل بسعة النبض. يتم تطبيق هذه الطريقة على الجلايسين ماكس المزروع في الحقل ويمكن تكييفه مع الأنواع الأخرى للكشف عن التنوع الوراثي أو مجموعات التكاثر.

Abstract

لا يتم تحسين التمثيل الضوئي في أصناف المحاصيل الحديثة ، وبالتالي يوفر فرصة للتحسين. لقد أثبت تسريع استرخاء التبريد غير الكيميائي الضوئي (NPQ) أنه استراتيجية فعالة لزيادة أداء التمثيل الضوئي. ومع ذلك ، فإن القدرة على التكاثر من أجل تحسين NPQ والفهم الكامل للأساس الجيني لتخفيف NPQ غير موجودة بسبب القيود المفروضة على أخذ العينات الزائدة وجمع البيانات من نباتات المحاصيل المزروعة في الحقول. بناء على التقارير السابقة ، نقدم مقايسة عالية الإنتاجية لتحليل معدلات استرخاء NPQ في Glycine max (فول الصويا) باستخدام قياس فلوروفيل الكلوروفيل المعدل لسعة النبض (PAM). يتم أخذ عينات من أقراص الأوراق من فول الصويا المزروع في الحقل قبل نقله إلى المختبر حيث يتم قياس استرخاء NPQ في مقياس فلورومتر PAM مغلق. يتم حساب معلمات استرخاء NPQ عن طريق تركيب دالة ثنائية الأس لقيم NPQ المقاسة بعد الانتقال من الإضاءة العالية إلى الإضاءة المنخفضة. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن اختبار مئات الأنماط الجينية في غضون يوم واحد. هذا الإجراء لديه القدرة على فحص لوحات الطفرات والتنوع بحثا عن التباين في استرخاء NPQ ، وبالتالي يمكن تطبيقه على كل من أسئلة البحث الأساسية والتطبيقية.

Introduction

يتكون التمثيل الضوئي من امتصاص الضوء ، ونقل الإلكترون الأولي ، وتثبيت الطاقة ، وتوليف ونقل منتجات التمثيل الضوئي1. يعد فهم كل خطوة أمرا حيويا لتوجيه الجهود الرامية إلى زيادة كفاءة التمثيل الضوئي للمحاصيل. يؤثر الضوء على معدل التمثيل الضوئي ، مما يتطلب موازنة إمدادات الطاقة ، في شكل فوتونات ، مع الطلب على تقليل المعادلات. عندما يتجاوز العرض الطلب ، على سبيل المثال تحت الضوء العالي أو أثناء انخفاض تثبيت CO2 الناجم عن إغلاق الفم ، فإن تراكم الطاقة المخفضة يزيد من احتمال تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية مع إمكانية إتلاف جهاز التمثيل الضوئي وإضعاف نقل الإلكترون. لذلك ، لمنع الضرر ، طورت النباتات العديد من آليات الحماية الضوئية ، بما في ذلك إزالة السموم من أنواع الأكسجين التفاعلية والتبريد غير الكيميائي الضوئي لحالات الكلوروفيل المثارة (NPQ)2.

الحفاظ على معدلات عالية من التمثيل الضوئي أمر صعب في ظل بيئة ميدانية. التغيرات الموسمية والنهارية ، إلى جانب التقلبات البيئية مثل حركات الأوراق التي تسببها الرياح والغطاء السحابي العابر ، تسبب تحولات في كمية وشدة الضوء الذي تتلقاه النباتات لعملية التمثيل الضوئي3. يبدد NPQ الطاقة الضوئية الزائدة ويمكن أن يساعد في منع تلف الصور مع السماح بمعدلات مستدامة من التمثيل الضوئي عند الإضاءة العالية4. ومع ذلك ، فإن NPQ المطول أثناء التحولات في الإضاءة العالية إلى المنخفضة يستمر في تبديد الطاقة التي يمكن استخدامها للحد من الكربون5. ونتيجة لذلك ، فإن تسريع استرخاء NPQ يمكن أن يزيد من كفاءة التمثيل الضوئي6 ، مما يجعل استرخاء NPQ هدفا جذابا لتحسين المحاصيل.

يمكن استخدام تحليل فلورة الكلوروفيل المعدلة بسعة النبض (PAM) لحساب NPQ من المعلمات القابلة للقياس (الجدول التكميلي 1 والجدول التكميلي 2)7،8،9. تركز هذه المقالة على تحديد معدلات استرخاء NPQ في النباتات المزروعة في الحقول لغرض فحص التباين الطبيعي في البلازما الجرثومية. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام تحليل قياس فلوروفيل الكلوروفيل PAM لمجموعة واسعة من الأغراض ، وتطبيقه على الأنواع التي تتراوح من الطحالب إلى النباتات الأعلى ، ويتم مراجعته في مكان آخر 7,8,9.

في ورقة أو خلية متكيفة مع الظلام ، تكون مراكز تفاعل النظام الضوئي II (PSII) مفتوحة لاستقبال الإلكترونات ولا يوجد NPQ. يؤدي تشغيل ضوء قياس منخفض الكثافة إلى استثارة فلورة الكلوروفيل مع تجنب نقل الإلكترون عبر PSII. يتم وصف الحد الأدنى من التألق المسجل في هذه الحالة المظلمة المتكيفة بواسطة المعلمة Fo. إن تطبيق نبضة ضوئية عالية الكثافة على ورقة متكيفة مع الظلام يمكن أن يقلل بسرعة من أول تجمع مستقر لمستقبل الإلكترون من الكينونات المرتبطة بموقع الكينون أ. هذا يمنع مؤقتا قدرة نقل الإلكترون في مراكز تفاعل PSII ، والتي يقال بعد ذلك إنها مغلقة وغير قادرة على استقبال الإلكترونات من تقسيم الماء. باستخدام مدة نبض قصيرة ، لا يوجد وقت كاف لتحفيز NPQ. ويعادل تألق الكلوروفيل الناتج القيمة القصوى التي يمكن الحصول عليها في غياب NPQ أو الحد الأقصى للتألق Fm. يشار إلى الفرق بين الحد الأدنى والحد الأقصى من التألق باسم التألق المتغير ، Fv. يتم حساب الحد الأقصى للعائد الكمومي الكيميائي الضوئي للنظام الضوئي II (F v/Fm) من هاتين المعلمتين باستخدام المعادلة التالية:

Fv/F m = (F m-Fo)/F m

هذا يمكن أن يوفر مؤشرا مهما لوظيفة النظام الضوئي والإجهاد. يؤدي تشغيل ضوء أكتينيك (photoyntic) إلى تحفيز التبريد غير الكيميائي الضوئي ، ويسمح التطبيق اللاحق للفلاش المشبع بقياس التألق الأقصى المتكيف مع الضوء ، Fm'. من خلال مقارنة الفرق بين التألق الأقصى للضوء والظلام المتكيف مع الضوء ، يمكن حساب NPQ وفقا لمعادلة Stern-Volmer10:

NPQ = F m/Fm' - 1

في المصانع العليا ، تم وصف NPQ بأنه يتكون من خمسة مكونات متميزة على الأقل ، بما في ذلك qE و qT و qZ و qI و qH. والآليات الدقيقة التي ينطوي عليها الإطار الوطني للرصد ليست مفهومة تماما؛ ومع ذلك ، يعتبر qE المكون الرئيسي ل NPQ في معظم النباتات. وقد وجد أن العوامل الحاسمة للمشاركة الكاملة ل qE تشمل تراكم تدرج البروتون عبر غشاء الثايلاكويد ، ونشاط الوحدة الفرعية للنظام الضوئي II S11,12 ، و xanthophylls de-epoxided ، antheraxanthin ، lutein ، وعلى وجه الخصوص zeaxanthin13. يرتاح qE بشكل أسرع من أي مكون من مكونات NPQ (< 2 دقيقة)14 ، وبالتالي فإن التنشيط العكسي ل qE مهم بشكل خاص للتكيف مع شدة الضوء المتغيرة. تشمل المرحلة الثانية الأبطأ من استرخاء NPQ (~ 2-30 دقيقة) كلا من qT ، المتعلقة بانتقالات الحالة ، و qZ ، التي تنطوي على التحويل البيني للزياكسانثين إلى violaxanthin15. قد يشمل الاسترخاء البطيء (> 30 دقيقة) من NPQ كلا من التبريد المثبط للضوء (qI)16 والعمليات المستقلة عن الضرر الضوئي17,18 ، مثل qH ، الذي يستمر في التبريد في الهوائيات الطرفية ل PSII بوساطة بروتين ليبوكالين البلاستيد 19,20.

يزداد NPQ أثناء التعرض للضوء العالي. يمكن أن يؤدي النقل اللاحق إلى الإضاءة المنخفضة إلى خفض تنظيم NPQ. يمكن التقاط اضمحلال مراحل الاسترخاء السريعة والمتوسطة والبطيئة في معلمات الدالة ثنائية الأس 15,21,22,23

NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3

يعتمد الأساس النظري للدالة ثنائية الأس على افتراض الاستخدام من الدرجة الأولى للمروي الافتراضي ، بما في ذلك qE (Aq1) ، والاسترخاء المشترك ل qZ و qT (Aq2) ، مع الثوابت الزمنية المقابلة τq1 و τq2 ، و NPQ طويل الأجل ، والذي يتضمن عمليات مستقلة للضرر الضوئي (Aq3). على هذا النحو ، توفر الدالة ثنائية الأس تمثيلا أكثر واقعية للعمليات البيولوجية المتعددة المتصلة المشاركة في إخماد فلورة الكلوروفيل مقارنة بمعادلة هيل الأبسط التي تفتقر إلى الأساس النظري24.

يمكن قياس NPQ باستخدام مجموعة متنوعة من مقاييس الفلورومتر PAM المتاحة تجاريا 25,26 ، من الأجهزة المحمولة باليد البسيطة27 إلى الأنظمة المغلقة الأكثر تقدما28. ومع ذلك ، فإن الحد من العديد من هذه الأساليب هو الإنتاجية المنخفضة نسبيا ، مما يجعل فحص مجموعات كبيرة من النباتات أمرا صعبا بدون أجهزة متعددة وفريق من الباحثين. ولمعالجة هذه المسألة، طور ماكاوسلاند وآخرون إجراء يستند إلى أنسجة الأوراق المستثناة واستخدموه لتحديد الاختلافات في تألق الكلوروفيل بين صنفين من القمح29. وتكمن جاذبية هذا النهج في أن تصوير أقراص الأوراق، المأخوذة من نباتات متعددة بجهاز واحد، يمكن أن يسهل فحص مئات الأنماط الجينية في غضون يوم واحد. وهذا يجعل من الممكن تقييم التباين في استرخاء NPQ كجزء من دراسات الارتباط على نطاق الجينوم ، أو لفحص مجموعات التكاثر مع إمكانية زيادة كفاءة التمثيل الضوئي للمحاصيل والعائد في نهاية المطاف.

بناء على نتائج McAusland et al.29 ، نستخدم تحليل تألق الكلوروفيل PAM لأقراص الأوراق للفحص عالي الإنتاجية لمعدلات استرخاء NPQ في Glycine max (G.max ؛ فول الصويا). يستخدم هذا البروتوكول CF Imager25 ، والذي يمكن مقارنته بأنظمة PAM المغلقة الأخرى المتاحة تجاريا ، مثل FluorCam26 الشهير. مع غرفة مظلمة لتكييف العينات ، يمكن للمستخدمين تصوير 96 لوحة جيدة ، وأطباق بتري ، ونباتات صغيرة. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي الزيادة في الإنتاجية التي يوفرها استخدام أقراص الأوراق مقارنة بالتحليل المتسلسل للنباتات الفردية. نقدم هنا نتائج تمثيلية ، وطريقة لأخذ العينات وقياسها وتحليلها من NPQ في النباتات المزروعة في الحقل.

Protocol

1. زراعة البذور

  1. اختر موقعا حقليا ذا تربة خصبة جيدة التصريف ، ولكن ليس رملية ، وبدرجة حموضة تبلغ حوالي 6.5. حدد قطع الأراضي الصفية التي يبلغ طولها 1.2 متر مع تباعد 0.75 متر عن طريق تسجيل الأرض بمجرفة.
  2. زرع 50 بذرة / م من G.max السيرة الذاتية IA3023 على عمق 3 سم على طول كل قطعة أرض في بداية موسم النمو عندما تكون درجات حرارة التربة بين 25 إلى 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: لغرض فحص التنوع الجيني، من المتوقع أن يتم زراعة ومقارنة العديد من الأنماط الجينية المختلفة. زرع 2-5 صفوف لكل نمط وراثي مرتبة في تصميم كتلة عشوائية. يجب النظر فيما إذا كانت الظروف المناخية تناسب نمو فول الصويا ، بما في ذلك نوع التربة ودرجة الحرارة وطول اليوم.

2. جمع عينات الأوراق من الحقل

  1. عينة من النباتات في الموقع الميداني بعد 30 يوما من الإنبات.
    ملاحظة: بعد 30 يوما ستكون نباتات فول الصويا في المرحلة الخضرية. يعتمد عدد الأيام التي تلي الإنبات قبل أخذ العينات على المسألة البيولوجية التي يتم تناولها.
  2. املأ آبارا من 24 بئرا حتى 1/3ثانية بالماء المقطر. قم بتسمية الغطاء وجانب اللوحة باستخدام النسخ المتماثلة المراد أخذ عينات منها.
  3. اختر أصغر ورقة موسعة بالكامل في الجزء العلوي من النبات ليتم أخذ عينات منها. امسك الورقة ضد سدادة مطاطية.
  4. اضغط على حفار الفلين هومبولت # 2 من خلال الورقة وقم بلف لقطع القرص مع تجنب الضلع الأوسط. جمع 5 أقراص على التوالي من نفس الورقة للنسخ المتماثلة التقنية. خذ ما يقرب من 30٪ من أقراص الأوراق لكل قطعة أرض أكثر مما هو مطلوب في حالة تلف أنسجة الأوراق أثناء النقل أو من أخذ العينات.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف عدد النسخ المتماثلة البيولوجية (قطع الأراضي أو النباتات) وعدد النسخ المتماثلة التقنية (أقراص الأوراق من نفس النبات أو قطعة الأرض) اعتمادا على التصميم التجريبي.
  5. ادفع أقراص الأوراق خارج حفار الفلين إلى بئر واحد من صفيحة مكونة من 24 بئرا باستخدام قطعة قطن. تحقق من أن جميع أقراص الأوراق تطفو في الماء. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتحريك أقراص الأوراق بلطف ملتصقة بجانب البئر في وضع عائم باستخدام قطعة قطن.
  6. انتقل إلى المخطط التالي وكرر الخطوات من 2.3 إلى 2.5. ادفع أقراص الأوراق خارج حفار الفلين إلى بئر منفصل في صفيحة من 24 بئرا باستخدام قطعة قطن. كرر هذه الخطوة لجمع نسخة بيولوجية ثالثة.
  7. كرر الخطوة 2.6 حتى يتم أخذ عينة كاملة من 24 بئرا. ضع غطاء وختمه بفيلم شبه شفاف ومرن. قم بتخزين الطبق بعيدا عن أشعة الشمس المباشرة أو في كيس أو صندوق أو مبرد فارغ (بدون ثلج).

3. إعداد العينات للتحليل

  1. العودة إلى مساحة المختبر النظيفة بعد أخذ العينات. اضغط على غطاء اللوحة المختومة لإزاحة أقراص الأوراق العالقة بالغطاء أثناء النقل. قم بفك الفيلم وإزالة الغطاء.
  2. انقل قرص ورقة من الموضع الأول للوحة المكونة من 24 بئرا إلى صفيحة جديدة من 96 بئرا ، مع مواجهة قرص الورقة بشكل مسطح لأسفل في أسفل البئر.
  3. قطع مرشح شفاط الأنف إلى النصف. اغمس الفلتر الناتج في منتصف الطريق في الماء وربت على منشفة ورقية لإزالة السائل الزائد. أدخل الفلتر في البئر باستخدام قرص الورقة للحفاظ على الرطوبة.
  4. خذ قرصا ورقيا ثانيا من الموضع الأول للوحة المكونة من 24 بئرا وضع وجهه لأسفل في الموضع التالي المتاح للوحة 96 بئرا. اغمس النصف المتبقي من مرشح الأنف المنتج في الخطوة 3.3 في الماء وربت على منشفة ورقية قبل إدخاله في البئر باستخدام قرص الورقة الثاني.
  5. كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.4 لقرص ورقة ثالث من الموضع الأول من اللوحة المكونة من 24 بئرا.
  6. انتقل إلى الموضع الثاني من اللوحة المكونة من 24 بئرا وكرر الخطوات من 3.3 إلى 3.5.
  7. ضع الغطاء على اللوحة عندما تحتوي جميع الآبار على أقراص أوراق ومرشحات شفاط أنف مدخلة. قم بلصق الزاوية العلوية اليمنى للمساعدة في توجيه اللوحة في الظلام للتصوير.
  8. قم بختم الألواح بفيلم شبه شفاف ومرن ولف اللوحة بورق الألومنيوم. اكتب معرفات المؤامرة ومعرف اللوحة على رقائق الألومنيوم.
  9. ضع الألواح في صندوق مظلم أو خزانة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة ، للسماح باسترخاء المرحلتين الأوليين من NPQ (qE ، qT ، qZ). استخدم فترة حضانة أطول ومظلمة مدتها 1 ساعة قبل التصوير إذا كانت المراحل طويلة الأجل من NPQ ذات أهمية.
  10. قم بإعداد لوحة وهمية إضافية للتركيز أثناء التحليل. للقيام بذلك ، ضع قرصا ورقيا في كل زاوية من زوايا لوحة جديدة من 96 بئرا وواحدة في الوسط. قم بتأمين أقراص الأوراق باستخدام مرشحات الأنف كما هو الحال مع اللوحات السابقة. ختم اللوحة واحتضانها في الظلام في درجة حرارة الغرفة (24 درجة مئوية) ، ~ 50 ٪ الرطوبة النسبية.

4. قياس التبريد غير الكيميائي الضوئي باستخدام جهاز تصوير فلورة الكلوروفيل

  1. قم بتشغيل جهاز التصوير وافتح برنامج التصوير. انقر فوق إعدادات > البروتوكول لفتح نافذة لإدخال الخطوات في بروتوكول PAM التجريبي. وترد المواصفات الفنية للآلة في الجدول التكميلي 3.
  2. اضبط البرنامج ليبدأ بنبضة مشبعة لقياس أقصى قدر من الكفاءة الكمومية لعملية التمثيل الضوئي المتكيفة مع الظلام عن طريق إدخال 20 ثانية في الصندوق: بعد تأخير. انقر فوق المربع تطبيق نبض وأدخل 1 في المربع: هذا العدد من المرات.
  3. اضبط نبضة PPFD على 6152 ، وطول النبض على 800 مللي ثانية ، وحدد المربع التقط صور F و Fm مع جميع النبضات. انقر فوق إدراج بعد لإضافة خطوة ثانية إلى البروتوكول.
  4. أدخل 30 ثانية في المربع: بعد تأخير. حدد الخيار تغيير actinic وأدخل 50 في المربع: Actinic PPFD ، لضبط شدة الضوء في الغرفة على 50 PPFD.
  5. انقر فوق إدراج بعد لإضافة خطوة جديدة إلى البروتوكول. أدخل 150 ثانية في المربع: بعد تأخير ، حدد تطبيق نبضة وأدخل 4 في المربع: هذا العدد من المرات ، لتطبيق نبضات القياس كل 150 ثانية ، 4x على التوالي بينما يتم الاحتفاظ بالضوء السفعي عند 50 PPFD.
  6. وترد معلومات كاملة عن البروتوكول في الجدول 1، واستخدم الخطوتين 4-2 و4-3 لتغيير شدة الضوء، والخطوتين 4-4 و4-5 للدخول في دورات النبضات المشبعة. اضبط التأخير وشدة الضوء لكل خطوة وفقا للقيم الواردة في الجدول 1. احفظ البروتوكول كملف .pcl في موقع معروف.
  7. أطفئ الضوء، وضع اللوحة الوهمية على مرحلة العينة، واضبط ارتفاع مرحلة العينة بحيث تكون أقراص الأوراق أعلى من قاعدة الأداة بمقدار 140 مم. يتم استخدام لوحة وهمية حيث سيتم وميض الضوء بشكل متكرر على اللوحة عند التركيز ؛ سيتطلب ذلك إعادة تكييف الظلام لأي عينات يتم قياسها وقد يتسبب في تلف ضوئي.
  8. انقر فوق أيقونة اتصال/قطع الاتصال بكاميرا Imager وكاميرا الأجهزة لبدء تشغيل الكاميرا. انقر فوق رمز التركيز (التألق) الذي يمثله رمز سهم على الوجهين أحمر اللون مع خطين أخضرين في القاعدة. اضبط العدسة والتعريض الضوئي لإخراج اللوحة إلى التركيز البؤري.
  9. انقر فوق أيقونة التركيز البؤري (التألق) مرة أخرى لإيقاف تشغيل الضوء الوامض. العمل في الظلام ، استبدل اللوحة الوهمية باللوحة المراد تحليلها.
  10. انقر فوق أيقونة كاميرا صورة الخريطة . اضبط تعريض الصورة عن طريق فتح الفتحة أو إغلاقها حتى يتم وضع الشريط الموجود في النافذة المنبثقة في المنطقة الخضراء.
  11. انقر فوق الزر حاول مرة أخرى بعد كل ضبط لفتحة العدسة حتى يتم ضبط التعريض الضوئي بشكل صحيح ويلتقط الجهاز صورة. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وحدد تطبيق عزل الصورة لحجب إشارات الخلفية. سيتم عرض منطقة الأوراق المركزة باللون الرمادي والخلفية باللون الأزرق.
  12. حدد المساحة/وحدات البكسل ذات الأهمية لتضمين أقراص الأوراق فقط عن طريق ضبط الرسم البياني ومستوى غاما من القائمة المنسدلة تعديل الصورة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الصورة.
  13. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وحدد حذف القصات العالية والمنخفضة (خريطة ملونة) لحذف المنطقة المميزة باللون الأزرق الفاتح. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وحدد حذف الضالات (ثقيلة) لإزالة أي وحدات بكسل لا تلمس ثلاثة وحدات بكسل أخرى على الأقل.
    ملاحظة: سيتم تحليل أي مناطق على الصورة تظهر كجزر معزولة بشكل منفصل وتضمينها في إخراج البيانات النهائي. يؤدي عزل الصور وإزالة وحدات البكسل الضالة إلى بيانات نظيفة ومفهومة.
  14. انقر فوق رمز تشغيل البروتوكول لبدء تشغيل البرنامج ، وسيظهر مؤقت في أسفل الشاشة لإعلامك بالمدة المتبقية لتشغيل البروتوكول.
  15. انتظر حتى يتم الانتهاء من البروتوكول، انقر فوق ملف > حفظ باسم، واحفظ البيانات كملف .igr. أغلق النافذة بالنقر فوق الصليب الأحمر في أعلى يمين النافذة قبل البدء في تشغيل لوحة عينة أخرى.
  16. افتح ملفا جديدا للنموذج التالي عن طريق تحديد ملف > جديد وكرر الخطوات من 4.10 إلى 4.15 حتى يتم قياس كافة اللوحات.
    ملاحظة: من المستحسن قياس اللوحات في غضون فترة 4 ساعات أو أقل لتقليل التأثير المحتمل لتنظيم الساعة البيولوجية على النتائج

5. معالجة بيانات فلورة الكلوروفيل

  1. افتح ملف .igr في برنامج التصوير. تصدير البيانات بالنقر فوق ملف > تصدير إلى مجلد لإنشاء مجلد جديد مع كافة الملفات الضرورية.
  2. انسخ ملفات MATLAB الثلاثة التالية إلى المجلد الناتج: MapAndLabelDiscs.m (الملف التكميلي 1) وProcessFoFm.m (الملف التكميلي 2) وProcessNPQdata.m (الملف التكميلي 3) والملف R: create_file_to_process. R (الملف التكميلي 4).
  3. افتح MapAndLabelDiscs.m (الملف التكميلي 1) في MATLAB وقم بتشغيله. احفظ خريطة أقراص الأوراق المرقمة التي تم إنشاؤها في نافذة منبثقة كملف .png للتحقق من ترقيم قرص الورقة لاحقا.
  4. افتح الملف ProcessFoFm.m (الملف التكميلي 2) في MATLAB وقم بتشغيله لحساب قيم F o و Fm لكل قرص ورقة. قم بتشغيل ProcessNPQdata.m (الملف التكميلي 3) لحساب قيم NPQ في كل نقطة زمنية.
  5. افتح create_file_to_process الملفات. R (الملف التكميلي 4) في Rstudio وأضف التاريخ إلى الرمز على السطر 5. أضف رقم اللوحة إلى السطر 8 في create_file_to_process.R.
  6. تشغيل create_file_to_process. R لدمج قيم F v / Fm وبيانات NPQ في ملف واحد يتم تسميته بعد البيانات باللاحقة -cf-summary.csv. تحقق من ترقيم قرص الورقة في ملف ملخص cf من الخطوة 5.5 باستخدام ملف .png من الخطوة 5.3. معلومات إضافية تتعلق برقم قطعة الأرض والانضمام.
  7. افتح البرنامج النصي R CF-data-processing_2.R (الملف التكميلي 5) وقم بتغيير السطر 13 إلى مسار دليل العمل. تغيير السطر 16 في CF-data-processing_2.R إلى اسم الملف من الخطوة 5.5.
  8. تغيير السطر 48 في CF-data-processing_2.R إلى اسم ملف إخراج. قم بتشغيل البرنامج النصي CF-data-processing_2.R لإعادة تنسيق البيانات لتركيب المنحنى.
  9. افتح البرنامج النصي MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (الملف التكميلي 6) في MATLAB وقم بتغيير السطر 5 إلى اسم ملف الإخراج من الخطوة 5.8. تغيير السطر 85 في MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m إلى اسم ملف إخراج جديد. قم بتشغيل البرنامج النصي MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m لحساب معلمات استرخاء NPQ.

النتائج

ويصور الشكل 1 ألف قياسا نموذجيا ل NPQ في فول الصويا المزروع في الحقول. نمت النباتات في أوربانا ، إلينوي (خط العرض 40.084604 درجة ، خط الطول -88.227952 درجة) خلال صيف عام 2021 ، مع البذور المزروعة في 5 يونيو. 2021. تم أخذ عينات من أقراص الأوراق بعد 30 يوما من زراعة البذور ، وتم إجراء القياسات باستخدام ا...

Discussion

يعد الاختيار الدقيق لأقراص الأوراق والتعامل معها أمرا بالغ الأهمية للحصول على قياسات موثوقة ل NPQ. أولا ، سيؤدي تلف الأنسجة ، مثل التعامل الخشن مع الملقط ، إلى الإجهاد ، مما يؤدي إلى قيم منخفضة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة الكمومية لعملية التمثيل الضوئي. عادة ما يكون للنباتات غير المجهدة قيم F...

Disclosures

أفاد المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل من خلال المشروع البحثي تحقيق زيادة كفاءة التمثيل الضوئي (RIPE) الذي تموله مؤسسة بيل وميليندا غيتس ، ومؤسسة أبحاث الأغذية والزراعة ، ومكتب الخارجية والكومنولث والتنمية في المملكة المتحدة تحت رقم المنحة OPP1172157.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24 well tissue culture plateFisher ScientificFB012929Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plateFisher ScientificFB012931Country of Origin: United States of America
Aluminum foilAntylia Scientific 61018-56Country of Origin: United States of America
Black marker penSharpieSAN30001Country of Origin: United States of America
CF imagerTechnologica Ltd.N/Achlorophyll fluorescence imager
Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mmHumboldt Mfg CoH9665Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 SoftwareTechnologica Ltd.N/Aimaging software
Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene FiltersAmazon B07P6XCTGVCountry of Origin: United States of America
Marker stakesJohn Henry CompanyKN0151Country of Origin: United States of America
Paper scissorsVWR82027-596Country of Origin: United States of America
ParafilmBemis Company Inc. S3-594-6Semi -transparent flexible film
Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppersFisher Scientific14-130MCountry of Origin: United States of America

References

  1. Blankenship, R. E. . Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).
  2. Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
  3. Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
  4. Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
  5. Zhu, X. -. G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
  6. Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
  7. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
  8. Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
  9. Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
  10. Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
  11. Li, X. -. P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
  12. Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
  13. Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
  14. Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
  15. Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
  16. Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
  17. Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
  18. Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
  19. Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
  20. Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
  21. Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).
  22. Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
  23. Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
  24. Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
  25. Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
  26. Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
  27. Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).
  28. Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
  29. McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).
  30. Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).
  31. Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
  32. Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
  33. Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
  34. Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
  35. Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved