Análise de alta produtividade da extinção não fotoquímica nas culturas usando fluorometria modulada de clorofila modulada de pulso

Resumo

O protocolo introduz um método de alta produtividade para medir o relaxamento da extinção não fotoquímica por fluorometria modulada de clorofila modulada de pulso. O método é aplicado ao max glycine cultivado em campo e pode ser adaptado a outras espécies para testar a diversidade genética ou populações de reprodução.

Resumo

A fotossíntese não é otimizada em variedades modernas de culturas e, portanto, oferece uma oportunidade de melhoria. Acelerar o relaxamento da extinção não fotoquímica (NPQ) provou ser uma estratégia eficaz para aumentar o desempenho fotossintético. No entanto, o potencial de procriar para melhorar o NPQ e uma compreensão completa da base genética do relaxamento do NPQ é carente devido a limitações de supersemplagem e coleta de dados de plantas cultivadas em campo. Com base em relatórios anteriores, apresentamos um ensaio de alto rendimento para análise das taxas de relaxamento do NPQ na Glycine max (soja) utilizando fluorometria de clorofila modulada por pulso (PAM). Os discos de folha são amostrados de soja cultivada em campo antes do transporte para um laboratório onde o relaxamento do NPQ é medido em um pam-fluorômetro fechado. Os parâmetros de relaxamento do NPQ são calculados encaixando uma função bi-exponencial aos valores NPQ medidos após uma transição de alta para baixa luz. Usando este método, é possível testar centenas de genótipos dentro de um dia. O procedimento tem o potencial de triagem de painéis mutantes e de diversidade para variação no relaxamento do NPQ e, portanto, pode ser aplicado tanto a questões fundamentais quanto aplicadas de pesquisa.

Introdução

A fotossíntese consiste em absorção de luz, transferência primária de elétrons, estabilização de energia e síntese e transporte de produtos fotossintéticos¹. Entender cada passo é vital para orientar os esforços para aumentar a eficiência fotossintética da cultura. A luz afeta a taxa de fotossíntese, exigindo o equilíbrio da oferta de energia, na forma de fótons, com demanda por redução de equivalentes. Quando a oferta excede a demanda, por exemplo sob alta luz ou durante a redução da fixação de CO₂ causada pelo fechamento estomatal, o acúmulo de energia reduzida aumenta a probabilidade de formação de espécies de oxigênio reativo com o potencial de danificar o aparelho fotossintético e prejudicar o transporte de elétrons. Portanto, para evitar danos, as plantas desenvolveram vários mecanismos de fotoproteção, incluindo a desintoxicação de espécies reativas de oxigênio e a extinção não fotoquímica dos estados de clorofila animados (NPQ)².

Manter altas taxas de fotossíntese é um desafio em um ambiente de campo. Mudanças sazonais e diurnas, juntamente com flutuações ambientais como movimentos de folhas induzidas pelo vento e cobertura transitória de nuvens, causam mudanças na quantidade e intensidade de luz recebidas pelas plantas para a fotossíntese³. O NPQ dissipa o excesso de energia luminosa e pode ajudar a evitar danos fotográficos, permitindo taxas sustentadas de fotossíntese em alta luz⁴. No entanto, o NPQ prolongado durante transições de alta a baixa luz continua a dissipar a energia que poderia ser usada para a redução de carbono⁵. Como resultado, acelerar o relaxamento do NPQ pode aumentar a eficiência da fotossíntese⁶, tornando o relaxamento do NPQ um alvo atraente para a melhoria da cultura.

A análise de fluorescência modulada de clorofila modulada de pulso (PAM) pode ser utilizada para calcular NPQ a partir de parâmetros mensuráveis (Tabela Suplementar 1 e Tabela Suplementar 2)^7,8,9. Este artigo tem como foco determinar as taxas de relaxamento do NPQ em plantas cultivadas em campo com o objetivo de triagem da variação natural do germoplasma. No entanto, a análise da fluorometria de clorofila PAM também pode ser usada para uma ampla variedade de propósitos, aplicada a espécies que vão de algas a plantas mais altas, e é revisada em outros lugares ^7,8,9.

Em uma folha ou célula adaptada ao escuro, os centros de reação photosystem II (PSII) estão abertos para receber elétrons e não há NPQ. Ligar uma luz de baixa intensidade provoca fluorescência de clorofila, evitando o transporte de elétrons através do PSII. A fluorescência mínima registrada neste estado adaptado ao escuro é descrita pelo parâmetro F_o. A aplicação de um pulso de luz de alta intensidade a uma folha adaptada à escuridão pode reduzir rapidamente a primeira piscina estável de aceitadores de elétrons de quinones ligada ao local da quinona A. Isso bloqueia temporariamente a capacidade de transferência de elétrons em centros de reação PSII, que são então ditos estar fechados e incapazes de receber elétrons da divisão da água. Usando uma curta duração de pulso, não há tempo suficiente para estimular o NPQ. A fluorescência de clorofila resultante equivale ao valor máximo obtido na ausência de NPQ, ou fluorescência máxima, F_m. A diferença entre fluorescência mínima e máxima é referida como fluorescência variável, F_v. O rendimento quântico fotoquímico máximo do fotossistema II (F_v/F_m) é calculado a partir desses dois parâmetros usando a seguinte equação:

F_v/F_m = (F_{m-F o})/F_m

Isso pode fornecer um indicador importante da função fotossistema e estresse. Ligar uma luz actínica (fotossintética) estimula a saciedação não fotoquímica, e a aplicação subsequente de um flash saturado permite a medição da fluorescência máxima adaptada pela luz, F_m'. Comparando a diferença entre fluorescência máxima adaptada à luz e escura, o NPQ pode ser calculado de acordo com a equação Stern-Volmer¹⁰:

NPQ = F_m/F_m' - 1

Em plantas mais altas, o NPQ tem sido descrito como consistindo de pelo menos cinco componentes distintos, incluindo qE, qT, qZ, qI e qH. Os mecanismos precisos envolvidos no NPQ não são totalmente compreendidos; no entanto, o qE é considerado o principal componente do NPQ na maioria das plantas. Fatores cruciais para o engajamento total do qE foram encontrados para incluir o acúmulo de um gradiente de prótons através da membrana de timokoide, a atividade do subunidade fotosystem II S^11,12, e xanthophylls desepoxidados, antheraxantina, luteína, e em particular zeaxantina¹³. qE relaxa o mais rápido de qualquer componente NPQ (< 2 min)¹⁴, e a ativação reversível do qE é, portanto, particularmente importante para a adaptação às intensidades de luz em mudança. Uma segunda fase mais lenta de relaxamento NPQ (~2-30 min) abrange tanto qT, relacionado às transições estaduais, quanto qZ, envolvendo interconversão de zeaxantina à violaxantina¹⁵. O relaxamento lento (> 30 min) do NPQ pode incluir tanto a saciação fotoinhibitória (qI)¹⁶ quanto processos independentes da fotodamagem^17,18, como o qH, que é mantido saciando nas antenas periféricas do PSII mediado por uma proteína lipocalina plastida^19,20.

O NPQ aumenta durante a exposição à alta luz. A transferência subsequente para a luz baixa pode resultar em queda na regulação do NPQ. A decadência de fases de relaxamento rápido, intermediário e lento pode ser capturada nos parâmetros de uma função bi-exponencial 15,21,22,23

NPQ = Aq1 ^(-t/τ1) + Aq2^(-t/τ2) + Aq3

A base teórica para a função bi-exponencial baseia-se no pressuposto da utilização de primeira ordem de quenchers hipotéticos, incluindo qE (Aq1), o relaxamento combinado de qZ e qT (Aq2), com as correspondentes constantes de tempo τq1 e τq2, e NPQ de longo prazo, que inclui processos independentes qI e fotodamage (Aq3). Como tal, a função bi-exponencial fornece uma representação mais realista dos múltiplos processos biológicos conectados envolvidos na saciação da fluorescência da clorofila em comparação com uma equação de Hill mais simples que carece de uma base teórica²⁴.

O NPQ pode ser medido usando uma variedade de fluorômetros PAM disponíveis comercialmente^25,26, desde dispositivos simples portáteis²⁷ até sistemas fechados mais avançados²⁸. No entanto, uma limitação de várias dessas abordagens é um rendimento relativamente baixo, o que torna a triagem de grandes coleções de plantas desafiadoras sem múltiplos dispositivos e uma equipe de pesquisadores. Para abordar essa questão, McAusland et al. desenvolveram um procedimento baseado no tecido da folha excisada e o utilizaram para identificar diferenças na fluorescência de clorofila entre duas cultivares^{de trigo 29}. A atração dessa abordagem é que os discos de folha de imagem, retirados de várias plantas com um único dispositivo, podem facilitar a triagem de centenas de genótipos dentro de um dia. Isso permite avaliar a variação do relaxamento do NPQ como parte de estudos de associação de genomas, ou para triagem de populações de reprodução com potencial para aumentar a eficiência fotossintética da cultura e, em última instância, produzir.

Com base nos achados de McAusland et ^al.29, utilizamos a análise de fluorescência de clorofila PAM de discos de folha para triagem de alto rendimento das taxas de relaxamento do NPQ no Glycine max (G.max; soja). Este protocolo usa o CF Imager²⁵, que é comparável a outros sistemas fechados de PAM disponíveis comercialmente, como o popular FluorCam²⁶. Com uma sala escura para adaptação de amostras, os usuários podem imaginar pratos de 96 poços, pratos de Petri e pequenas plantas. A principal vantagem dessa abordagem é o aumento da produtividade proporcionada pelo uso de discos de folha em comparação com a análise sequencial de plantas individuais. Aqui apresentamos resultados representativos e um método de amostragem, medição e análise de NPQ em plantas cultivadas em campo.

Protocolo

1. Plantio de sementes

1. Escolha um campo com solo fértil, bem drenado, mas não arenoso, e com um pH de quase 6,5. Marque 1,2 m de linha com 0,75 m de espaçamento marcando o chão com uma enxada.
2. Plante 50 sementes/m de G.max cv. IA3023 a 3 cm de profundidade ao longo de cada parcela no início da estação de cultivo, quando as temperaturas do solo estão entre 25 e 30 °C.
   NOTA: Para fins de triagem da diversidade genética, espera-se que vários genótipos diferentes sejam cultivados e comparados. Plante 2-5 linhas por genótipo disposto em um projeto de bloco aleatório. Deve-se considerar se as condições climáticas se adequam ao crescimento da soja, incluindo tipo de solo, temperatura e comprimento do dia.

2. Coleta de amostras de folhas do campo

1. Prove as plantas no local do campo 30 dias após a germinação.
   NOTA: Após 30 dias, as plantas de soja estarão em fase vegetativa. O número de dias após a germinação antes da amostragem depende da questão biológica que está sendo abordada.
2. Encha os poços de uma placa de 24 poços até 1/3^rd com água destilada. Rotule a tampa e o lado da placa com as réplicas a serem amostradas.
3. Selecione a folha mais jovem totalmente expandida no topo da planta a ser amostrada. Segure a folha contra uma rolha de borracha.
4. Pressione um borer de cortiça Humboldt #2 através da folha e torça para cortar um disco, evitando o midrib. Colete consecutivamente 5 discos da mesma folha para réplicas técnicas. Tome aproximadamente 30% mais discos de folha para cada parcela do que o necessário no caso de o tecido da folha estiver danificado em trânsito ou de amostragem.
   NOTA: O número de réplicas biológicas (parcelas ou plantas) e o número de réplicas técnicas (discos de folha da mesma planta ou enredo) podem variar dependendo do desenho experimental.
5. Empurre os discos de folha para fora do borer de cortiça em um único poço de uma placa de 24 poços usando um cotonete. Verifique se todos os discos de folha estão flutuando na água. Se não, mova suavemente discos de folhas grudando na lateral de um poço em uma posição flutuante com um cotonete.
6. Passe para a próxima trama e repita os passos 2.3 para 2.5. Empurre os discos de folha para fora do borer de cortiça em um poço separado em uma placa de 24 poços usando um cotonete. Repita este passo para coletar uma terceira réplica biológica.
7. Repita o passo 2.6 até que uma placa completa de 24 poços tenha sido amostrada. Coloque uma tampa e sele com um filme semi-transparente e flexível. Armazene a placa da luz solar direta, em um saco, caixa ou refrigerador vazio (sem gelo).

3. Preparação de amostras para análise

1. Retorne a um espaço de laboratório limpo após a amostragem. Toque na tampa da placa selada para desalojar discos de folhas presos à tampa durante o transporte. Desembrulhe o filme e remova a tampa.
2. Transfira um disco de folha da primeira posição da placa de 24 poços em uma placa fresca de 96 poços, com o disco de folha voltado para baixo na parte inferior do poço.
3. Corte um filtro aspirador nasal ao meio. Mergulhe o filtro resultante no meio da água e naufraga sobre uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Insira o filtro no poço com o disco da folha para manter a umidade.
4. Pegue um segundo disco de folha da primeira posição da placa de 24 poços e coloque de frente para baixo na próxima posição disponível da placa de 96 poços. Mergulhe a metade restante do filtro nasal produzido na etapa 3.3 em água e dab em uma toalha de papel antes de inseri-la no poço com o segundo disco de folha.
5. Repita as etapas 3.3 a 3.4 para um terceiro disco de folha da primeira posição da placa de 24 poços.
6. Vá para a segunda posição da placa de 24 poços e repita os passos de 3,3 a 3,5.
7. Coloque a tampa na placa quando todos os poços tiverem discos de folha e filtros aspiradores nasais inseridos. Grave o canto superior direito para ajudar a orientar a placa no escuro para imagens.
8. Veda matrículas com um filme semi-transparente e flexível e enrole a placa em papel alumínio. Escreva as IDs do lote e o ID da placa na folha de alumínio.
9. Coloque as placas em uma caixa escura ou armário por um mínimo de 30 minutos, para permitir o relaxamento das duas primeiras fases do NPQ (qE, qT, qZ). Use um período de incubação mais longo e escuro de 1h antes da imagem se as fases de longo prazo do NPQ forem de interesse.
10. Prepare uma placa manequim adicional para o foco durante a análise. Para isso, coloque um disco de folha em cada um dos cantos de uma placa fresca de 96 poços e uma no centro. Discos de folha seguros com filtros nasais como feito com placas anteriores. Sele a placa e incubar no escuro à temperatura ambiente (24 °C), ~50% de umidade relativa.

4. Medição da extinção não fotoquímica usando imager de fluorescência de clorofila

1. Ligue o imager e abra o software de imagem. Clique em Configurações > Protocolo para abrir uma janela para a entrada de etapas no protocolo experimental PAM. As especificações técnicas da máquina estão previstas na Tabela Suplementar 3.
2. Defina o programa para começar com um pulso saturado para medir a eficiência quântica máxima da fotossíntese adaptada ao escuro, inserindo 20 s na caixa: Após um atraso de. Clique na caixa Aplique pulso e digite 1 na caixa: Este número de vezes.
3. Defina o ppfd de pulso para 6152, o comprimento do pulso para 800 ms, e verifique as imagens da caixa Take F' & Fm' com todos os pulsos. Clique em Inserir Depois para adicionar um segundo passo ao protocolo.
4. Digite 30 s na caixa: Depois de um atraso de. Selecione a opção Alterar actinic e digitar 50 na caixa: Actinic PPFD, para definir a intensidade da luz na câmara para 50 PPFD.
5. Clique em Inserir Depois para adicionar uma nova etapa ao protocolo. Digite 150 s na caixa: Após um atraso, selecione Aplicar pulso e digite 4 na caixa: Este número de vezes, para aplicar pulsos de medição a cada 150 s, 4x em uma fileira enquanto a luz actínica é mantida em 50 PPFD.
6. As informações completas do protocolo são fornecidas na Tabela 1, utilize as etapas 4.2 e 4.3 para alterar a intensidade da luz e as etapas 4.4 e 4.5 para inserir ciclos de pulsos saturados. Ajuste o atraso e a intensidade da luz para cada etapa de acordo com os valores fornecidos na Tabela 1. Salve seu protocolo como um arquivo .pcl em um local conhecido.
7. Desligue a luz, coloque a placa falsa no estágio da amostra e ajuste a altura do estágio da amostra para que os discos da folha estejam 140 mm acima da base do instrumento. Uma placa falsa é usada como luz será repetidamente piscada na placa ao se concentrar; isso exigirá a adaptação re-escura de quaisquer amostras a serem medidas e pode causar fotodamagem.
8. Clique no ícone de câmera Connect/Disconnect to Imager e Hardware para iniciar a câmera. Clique no símbolo Focus (Fluorescence) representado por um ícone de seta de dois lados vermelho com duas linhas verdes na base. Ajuste a lente e a exposição para colocar a placa em foco.
9. Clique novamente no ícone Focus (fluorescência) para desligar a luz piscando. Trabalhando no escuro, substitua a placa falsa pela placa a ser analisada.
10. Clique no ícone da câmera Map Image . Ajuste a exposição da imagem abrindo ou fechando a abertura até que a barra na janela pop-up esteja posicionada na zona verde.
11. Clique no botão Tentar novamente após cada ajuste da abertura até que a exposição seja corretamente ajustada e o instrumento tire uma imagem. Clique com o botão direito do mouse na imagem e selecione Aplicar isolamento de imagem para bloquear sinais de fundo. A área da folha focada será exibida em cinza e o fundo em azul.
12. Selecione a área/pixels de interesse para incluir apenas os discos de folha ajustando o histograma e o nível gama do menu de retirada de imagem modificado pelo botão de botão com o botão direito clicando na imagem.
13. Clique com o botão direito do mouse na imagem e selecione Excluir cortes altos e baixos (Mapa de cores) para excluir a área destacada azul claro. Clique com o botão direito do mouse na imagem e selecione Delete Strays (Heavy) para remover quaisquer pixels que não estejam tocando pelo menos três outros pixels.
    NOTA: Todas as áreas da imagem que aparecerem como ilhas isoladas serão analisadas separadamente e incluídas na saída final de dados. O isolamento da imagem e a remoção de pixels perdidos resultam em dados limpos e compreensíveis.
14. Clique no ícone Executar protocolo para iniciar o programa, um temporizador aparecerá na parte inferior da tela informando quanto tempo o protocolo ainda tem para ser executado.
15. Aguarde até que o protocolo esteja concluído, clique em Arquivo > Salvar Como e salve os dados como um arquivo .igr. Feche a janela clicando na cruz vermelha no canto superior direito da janela antes de começar a executar outra placa de amostra.
16. Abra um novo arquivo para a próxima amostra selecionando Arquivo > Novo e repetindo etapas 4.10 a 4.15 até que todas as placas sejam medidas.
    NOTA: É aconselhável medir placas dentro de um período de 4h ou menos para minimizar o impacto potencial da regulação circadiana sobre os resultados

5. Processar dados de fluorescência de clorofila

1. Abra o arquivo .igr no software de imagem. Exporte os dados clicando em Arquivo > Exportar para Pasta para criar uma nova pasta com todos os arquivos necessários.
2. Copie os seguintes três arquivos MATLAB na pasta resultante: MapAndLabelDiscs.m (Arquivo Suplementar 1), ProcessFoFm.m (Arquivo Suplementar 2) e ProcessNPQdata.m (Arquivo Suplementar 3) e o arquivo R: create_file_to_process. R (Arquivo Complementar 4).
3. Abra MapAndLabelDiscs.m (Arquivo Suplementar 1) no MATLAB e execute. Salve o mapa de discos de folha numerados gerados em uma janela pop-up como um arquivo .png para verificar a numeração do disco da folha mais tarde.
4. Abra o processo processFoFm.m (Arquivo Suplementar 2) no MATLAB e execute para calcular valores de F_o e F_m para cada disco de folha. Execute o ProcessNPQdata.m (Arquivo Suplementar 3) para calcular valores NPQ em cada ponto de tempo.
5. Abra o arquivo create_file_to_process. R (Arquivo Suplementar 4) no Rstudio e adicione a data ao código na linha 5. Adicione o número da placa à linha 8 em create_file_to_process.R.
6. Corra create_file_to_process. R para consolidar valores F_v/F_m e dados NPQ em um arquivo que é nomeado após os dados com o sufixo -cf-resumo.csv. Verifique a numeração do disco da folha no arquivo de resumo cf da etapa 5.5 usando o arquivo .png da etapa 5.3. Informações adicionais relacionadas ao número da parcela e à adesão.
7. Abra o script R CF-data-processing_2.R (Arquivo Suplementar 5) e altere a linha 13 para o caminho do diretório de trabalho. Altere a linha 16 em CF-data-processing_2.R para o nome do arquivo da etapa 5.5.
8. Alterar a linha 48 em CF-data-processing_2.R para o nome de um arquivo de saída. Execute o script CF-data-processing_2.R para re formatar os dados para montagem da curva.
9. Abra o script MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (Arquivo Suplementar 6) no MATLAB e altere a linha 5 para o nome do arquivo de saída da etapa 5.8. Altere a linha 85 em MatLab_NPQ_5_fit_model_v5 para um novo nome de arquivo de saída. Execute o script MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m para calcular parâmetros de relaxamento do NPQ.

Resultados

A Figura 1A retrata uma medição típica do NPQ na soja cultivada em campo. As plantas foram cultivadas em Urbana, IL (latitude 40,084604°, longitude -88,227952°) durante o verão de 2021, com sementes plantadas em 5 de junho. 2021. Os discos de folha foram amostrados após 30 dias de plantio de sementes, e as medições foram feitas com o protocolo fornecido (Tabela 1). Os valores _{de F v}/F_m e NPQ foram calculados para cada disco de folha (Tabela...

Discussão

A escolha cuidadosa e o manuseio de discos de folha são fundamentais para obter medições confiáveis do NPQ. Primeiro, danos ao tecido, como manuseio áspero com pinças, introduzirão estresse, resultando em valores baixos para a máxima eficiência quântica da fotossíntese. As plantas não estressadas normalmente têm valores F_v/F_m de cerca de 0,83¹⁸, com declínios significativos indicando uma redução no desempenho fotossintético^...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012929	Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012931	Country of Origin: United States of America
Aluminum foil	Antylia Scientific	61018-56	Country of Origin: United States of America
Black marker pen	Sharpie	SAN30001	Country of Origin: United States of America
CF imager	Technologica Ltd.	N/A	chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm	Humboldt Mfg Co	H9665	Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software	Technologica Ltd.	N/A	imaging software Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters	Amazon	B07P6XCTGV	Country of Origin: United States of America
Marker stakes	John Henry Company	KN0151	Country of Origin: United States of America
Paper scissors	VWR	82027-596	Country of Origin: United States of America
Parafilm	Bemis Company Inc.	S3-594-6	Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers	Fisher Scientific	14-130M	Country of Origin: United States of America