Analyse à haut débit de la trempe non photochimique dans les cultures à l’aide de la fluorométrie de chlorophylle modulée en amplitude d’impulsion

Résumé

Le protocole introduit une méthode à haut débit pour mesurer la relaxation de la trempe non photochimique par fluorométrie de chlorophylle modulée en amplitude d’impulsion. La méthode est appliquée à Glycine max cultivée en plein champ et peut être adaptée à d’autres espèces pour dépister la diversité génétique ou les populations reproductrices.

Résumé

La photosynthèse n’est pas optimisée dans les variétés de cultures modernes et offre donc une opportunité d’amélioration. Accélérer la relaxation de la trempe non photochimique (NPQ) s’est avéré être une stratégie efficace pour augmenter les performances photosynthétiques. Cependant, le potentiel de sélection pour améliorer le NPQ et une compréhension complète de la base génétique de la relaxation du NPQ font défaut en raison des limites du suréchantillonnage et de la collecte de données à partir de plantes cultivées en plein champ. En nous appuyant sur des rapports précédents, nous présentons un test à haut débit pour l’analyse des taux de relaxation NPQ dans Glycine max (soja) en utilisant la fluorométrie de chlorophylle modulée en amplitude d’impulsion (PAM). Les disques de feuilles sont échantillonnés à partir de soja cultivé en plein champ avant d’être transportés vers un laboratoire où la relaxation du NPQ est mesurée dans un fluoromètre PAM fermé. Les paramètres de relaxation NPQ sont calculés en adaptant une fonction bi-exponentielle aux valeurs NPQ mesurées après une transition de la lumière haute à la lumière faible. En utilisant cette méthode, il est possible de tester des centaines de génotypes en une journée. La procédure a le potentiel de filtrer les panels mutants et de diversité pour la variation de la relaxation NPQ, et peut donc être appliquée à des questions de recherche fondamentale et appliquée.

Introduction

La photosynthèse consiste en l’absorption de la lumière, le transfert d’électrons primaires, la stabilisation de l’énergie, ainsi que la synthèse et le transport de produits photosynthétiques¹. Comprendre chaque étape est essentiel pour guider les efforts visant à augmenter l’efficacité photosynthétique des cultures. La lumière affecte le taux de photosynthèse, nécessitant un apport énergétique d’équilibrage, sous forme de photons, avec une demande d’équivalents réducteurs. Lorsque l’offre dépasse la demande, par exemple sous haute lumière ou lors d’une fixation réduite du CO₂ causée par la fermeture stomatique, l’accumulation de puissance réductrice augmente la probabilité de formation d’espèces réactives de l’oxygène susceptibles d’endommager l’appareil photosynthétique et d’entraver le transport des électrons. Par conséquent, pour prévenir les dommages, les plantes ont développé plusieurs mécanismes photoprotecteurs, y compris la désintoxication des espèces réactives de l’oxygène et la trempe non photochimique des états chlorophylliens excités (NPQ)².

Maintenir des taux élevés de photosynthèse est difficile dans un environnement de terrain. Les changements saisonniers et diurnes, ainsi que les fluctuations environnementales telles que les mouvements des feuilles induits par le vent et la couverture nuageuse transitoire, provoquent des changements dans la quantité et l’intensité de la lumière reçue par les plantes pour la photosynthèse³. Le NPQ dissipe l’excès d’énergie lumineuse et peut aider à prévenir les photo-dommages tout en permettant des taux soutenus de photosynthèse à haute luminosité⁴. Cependant, le NPQ prolongé pendant les transitions de lumière élevée à faible luminosité continue de dissiper l’énergie qui pourrait être utilisée pour la réduction du carbone⁵. En conséquence, accélérer la relaxation du NPQ peut augmenter l’efficacité de la photosynthèse⁶, faisant de la relaxation du NPQ une cible attrayante pour l’amélioration des cultures.

L’analyse de fluorescence de la chlorophylle (PAM) modulée en amplitude d’impulsion (PAM) peut être utilisée pour calculer le NPQ à partir de paramètres mesurables (tableau supplémentaire 1 et tableau supplémentaire 2)^7,8,9. Cet article se concentre sur la détermination des taux de relaxation du NPQ chez les plantes cultivées en plein champ dans le but de dépister la variation naturelle du matériel génétique. Cependant, l’analyse de la fluorométrie de la chlorophylle PAM peut également être utilisée à des fins très diverses, appliquée à des espèces allant des algues aux plantes supérieures, et est examinée ailleurs ^7,8,9.

Dans une feuille ou une cellule adaptée à l’obscurité, les centres de réaction du photosystème II (PSII) sont ouverts pour recevoir des électrons et il n’y a pas de NPQ. L’allumage d’une lumière de mesure de faible intensité provoque une fluorescence de la chlorophylle tout en évitant le transport d’électrons à travers PSII. La fluorescence minimale enregistrée dans cet état adapté à l’obscurité est décrite par le paramètre F_o. L’application d’une impulsion lumineuse de haute intensité à une feuille adaptée à l’obscurité peut rapidement réduire le premier pool d’accepteurs d’électrons stables de quinones liés au site de la quinone A. Cela bloque temporairement la capacité de transfert d’électrons dans les centres de réaction PSII, qui sont alors dits fermés et incapables de recevoir des électrons de la division de l’eau. En utilisant une courte durée d’impulsion, il n’y a pas assez de temps pour stimuler le NPQ. La fluorescence chlorophyllienne résultante est équivalente à la valeur maximale pouvant être obtenue en l’absence de NPQ, ou fluorescence maximale, F_m. La différence entre la fluorescence minimale et la fluorescence maximale est appelée fluorescence variable, F_v. Le rendement quantique photochimique maximal du photosystème II (F_v/F_m) est calculé à partir de ces deux paramètres à l’aide de l’équation suivante :

F_v/F_m = (F_{m-F o})/F_m

Cela peut fournir un indicateur important de la fonction du photosystème et du stress. L’allumage d’une lumière actinique (photosynthétique) stimule la trempe non photochimique, et l’application ultérieure d’un flash saturant permet de mesurer la fluorescence maximale adaptée à la lumière, F m'. En comparant la différence entre la fluorescence maximale sombre et la fluorescence maximale adaptée à la lumière, le NPQ peut être calculé selon l’équation de Stern-Volmer¹⁰ :

NPQ = F_m/F_m' - 1

Dans les usines supérieures, le NPQ a été décrit comme composé d’au moins cinq composants distincts, notamment qE, qT, qZ, qI et qH. Les mécanismes précis impliqués dans le NPQ ne sont pas entièrement compris; cependant, le qE est considéré comme le principal composant du NPQ dans la plupart des usines. Des facteurs cruciaux pour un engagement complet de l’QE comprennent l’accumulation d’un gradient de protons à travers la membrane thylakoïde, l’activité de la sous-unité S^11,12 du photosystème II et les xanthophylles époxydées, l’anthéroaxanthine, la lutéine et en particulier la zéaxanthine¹³. Le qE se détend le plus rapidement de tous les composants NPQ (< 2 min)¹⁴, et l’activation réversible du qE est donc particulièrement importante pour l’adaptation aux intensités lumineuses changeantes. Une deuxième phase plus lente de relaxation NPQ (~2-30 min) englobe à la fois qT, liée aux transitions d’état, et qZ, impliquant l’interconversion de la zéaxanthine en violaxanthine¹⁵. La relaxation lente (> 30 min) de NPQ peut inclure à la fois une trempe photoinhibitoire (qI)¹⁶ et des processus indépendants des photodommages^17,18, tels que qH, qui est une trempe soutenue dans les antennes périphériques du PSII médiée par une protéine de lipocaline plaste^19,20.

NPQ augmente pendant l’exposition à la lumière élevée. Le transfert ultérieur à une faible luminosité peut entraîner une régulation négative du NPQ. La désintégration des phases de relaxation rapides, intermédiaires et lentes peut être capturée dans les paramètres d’une fonction bi-exponentielle 15,21,22,23

NPQ = Aq1^(-t/τ1) + Aq2^(-t/τ2) + Aq3

La base théorique de la fonction bi-exponentielle est basée sur l’hypothèse de l’utilisation de premier ordre de quenchers hypothétiques, y compris qE (Aq1), la relaxation combinée de qZ et qT (Aq2), avec les constantes de temps correspondantes τq1 et τq2, et NPQ à long terme, qui comprend qI et des processus indépendants de photodommages (Aq3). En tant que telle, la fonction bi-exponentielle fournit une représentation plus réaliste des multiples processus biologiques connectés impliqués dans l’extinction de la fluorescence de la chlorophylle par rapport à une équation de Hill plus simple qui manque d’une base théorique²⁴.

Le NPQ peut être mesuré à l’aide d’une variété de fluoromètres PAM^25,26 disponibles ^dans le commerce, des simples appareils portatifs²⁷ aux systèmes fermés plus avancés²⁸. Cependant, une limitation de plusieurs de ces approches est un débit relativement faible, ce qui rend difficile le criblage de grandes collections de plantes sans plusieurs dispositifs et une équipe de chercheurs. Pour résoudre ce problème, McAusland et al. ont développé une procédure basée sur le tissu foliaire excisé et l’ont utilisée pour identifier les différences de fluorescence de la chlorophylle entre deux cultivars de blé²⁹. L’attrait de cette approche est que l’imagerie des disques de feuilles, prélevés sur plusieurs plantes avec un seul appareil, peut faciliter le dépistage de centaines de génotypes en une journée. Cela permet d’évaluer la variation de la relaxation du NPQ dans le cadre d’études d’association à l’échelle du génome, ou de dépister les populations reproductrices ayant le potentiel d’augmenter l’efficacité photosynthétique des cultures et, en fin de compte, le rendement.

En nous appuyant sur les résultats de McAusland et ^al.29, nous utilisons l’analyse de fluorescence de la chlorophylle PAM des disques foliaires pour le criblage à haut débit des taux de relaxation NPQ dans Glycine max (G.max; soja). Ce protocole utilise le CF Imager²⁵, qui est comparable à d’autres systèmes PAM fermés disponibles dans le commerce, tels que le populaire FluorCam²⁶. Avec une pièce sombre pour l’adaptation des échantillons, les utilisateurs peuvent imager des assiettes à 96 puits, des boîtes de Petri et de petites plantes. Le principal avantage de cette approche est l’augmentation du débit offerte par l’utilisation de disques de feuilles par rapport à l’analyse séquentielle de plantes individuelles. Nous présentons ici des résultats représentatifs et une méthode d’échantillonnage, de mesure et d’analyse du NPQ dans les plantes cultivées en plein champ.

Protocole

1. Plantation de semences

1. Choisissez un site de champ avec un sol fertile, bien drainé, mais pas sablonneux, et avec un pH de près de 6,5. Marquez les parcelles en rangée de 1,2 m avec un espacement de 0,75 m en marquant le sol avec une houe.
2. Plantez 50 graines/m de G.max cv. IA3023 à 3 cm de profondeur le long de chaque parcelle au début de la saison de croissance lorsque les températures du sol sont comprises entre 25 et 30 °C.
   REMARQUE: Aux fins du dépistage de la diversité génétique, on s’attend à ce que plusieurs génotypes différents soient cultivés et comparés. Plantez 2 à 5 rangées par génotype disposées dans un plan de bloc aléatoire. Il faut se demander si les conditions climatiques conviennent à la croissance du soja, y compris le type de sol, la température et la durée du jour.

2. Prélèvement d’échantillons de feuilles sur le terrain

1. Échantillonnez les plantes sur le site de terrain 30 jours après la germination.
   REMARQUE: Après 30 jours, les plants de soja seront en phase végétative. Le nombre de jours suivant la germination avant l’échantillonnage dépend de la question biologique traitée.
2. Remplissez les puits d’une plaque de 24 puits jusqu’à 1/3^{avec de} l’eau distillée. Étiquetez le couvercle et le côté de la plaque avec les répliques à échantillonner.
3. Sélectionnez la plus jeune feuille entièrement expansée au sommet de la plante à échantillonner. Tenez la feuille contre un bouchon en caoutchouc.
4. Appuyez sur un foreur de liège Humboldt #2 à travers la feuille et tournez pour couper un disque tout en évitant la nervure médiane. Collectez consécutivement 5 disques de la même feuille pour les répliques techniques. Prenez environ 30 % plus de disques foliaires pour chaque placette que nécessaire au cas où le tissu foliaire serait endommagé pendant le transport ou par échantillonnage.
   REMARQUE: Le nombre de répliques biologiques (placettes ou plantes) et le nombre de répliques techniques (disques de feuilles de la même plante ou parcelle) peuvent varier en fonction de la conception expérimentale.
5. Poussez les disques de feuilles hors de l’agrile du liège dans un seul puits d’une plaque de 24 puits à l’aide d’un coton-tige. Vérifiez que tous les disques de feuilles flottent dans l’eau. Sinon, déplacez doucement les disques de feuilles collés sur le côté d’un puits en position flottante avec un coton-tige.
6. Passez à l’intrigue suivante et répétez les étapes 2.3 à 2.5. Poussez les disques de feuilles hors de l’agrile du liège dans un puits séparé dans une plaque de 24 puits à l’aide d’un coton-tige. Répétez cette étape pour collecter une troisième réplique biologique.
7. Répétez l’étape 2.6 jusqu’à ce qu’une plaque complète de 24 puits ait été échantillonnée. Placez un couvercle et scellez-le avec un film semi-transparent et flexible. Conservez l’assiette à l’abri de la lumière directe du soleil, dans un sac, une boîte ou une glacière vide (pas de glace).

3. Préparation des échantillons pour analyse

1. Retournez dans un espace de laboratoire propre après l’échantillonnage. Appuyez sur le couvercle de la plaque scellée pour déloger les disques de feuilles collés au couvercle pendant le transport. Déballez le film et retirez le couvercle.
2. Transférez un disque de feuilles de la première position de la plaque de 24 puits dans une plaque fraîche de 96 puits, avec le disque de feuilles tourné vers le bas au bas du puits.
3. Coupez un filtre d’aspirateur nasal en deux. Trempez le filtre résultant à mi-chemin dans l’eau et tamponnez sur une serviette en papier pour éliminer l’excès de liquide. Insérez le filtre dans le puits avec le disque de feuilles pour maintenir l’humidité.
4. Prenez un deuxième disque de feuilles à partir de la première position de la plaque de 24 puits et placez-le face vers le bas dans la position disponible suivante de la plaque de 96 puits. Trempez la moitié restante du filtre nasal produit à l’étape 3.3 dans de l’eau et tamponnez sur une serviette en papier avant de l’insérer dans le puits avec le deuxième disque de feuilles.
5. Répétez les étapes 3.3 à 3.4 pour un troisième disque de feuilles à partir de la première position de la plaque de 24 puits.
6. Passez à la deuxième position de la plaque de 24 puits et répétez les étapes 3.3 à 3.5.
7. Placez le couvercle sur la plaque lorsque tous les puits ont des disques de feuilles et des filtres d’aspirateur nasal insérés. Collez le coin supérieur droit pour aider à orienter la plaque dans l’obscurité pour l’imagerie.
8. Scellez les plaques avec un film semi-transparent et flexible et enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium. Écrivez les ID de tracé et l’ID de plaque sur la feuille d’aluminium.
9. Placez les plaques dans une boîte ou une armoire sombre pendant au moins 30 min, pour permettre la relaxation des deux premières phases de NPQ (qE, qT, qZ). Utilisez une période d’incubation plus longue et sombre de 1 h avant l’imagerie si des phases à long terme de NPQ présentent un intérêt.
10. Préparez une plaque factice supplémentaire pour la mise au point pendant l’analyse. Pour ce faire, placez un disque de feuilles dans chacun des coins d’une plaque fraîche de 96 puits et un au centre. Fixez les disques de feuilles avec des filtres nasaux comme cela a été fait avec les plaques précédentes. Scellez la plaque et incubez dans l’obscurité à température ambiante (24 °C), ~50% d’humidité relative.

4. Mesure de la trempe non photochimique à l’aide d’un imageur de fluorescence de chlorophylle

1. Allumez l’imageur et ouvrez le logiciel d’imagerie. Cliquez sur Paramètres > protocole pour ouvrir une fenêtre d’entrée des étapes dans le protocole expérimental PAM. Les spécifications techniques de la machine sont fournies dans le tableau supplémentaire 3.
2. Réglez le programme pour commencer avec une impulsion saturante pour mesurer l’efficacité quantique maximale de la photosynthèse adaptée à l’obscurité en entrant 20 s dans la boîte: Après un délai de. Cliquez sur la case Appliquer l’impulsion et entrez 1 dans la case : Ce nombre de fois.
3. Réglez l’impulsion PPFD sur 6152, la longueur de l’impulsion sur 800 ms, et cochez la case Prendre des images F' & Fm' avec toutes les impulsions. Cliquez sur Insérer après pour ajouter une deuxième étape au protocole.
4. Entrez 30 s dans la boîte: Après un délai de. Sélectionnez l’option Changer actinique et entrez 50 dans la case : Actinic PPFD, pour régler l’intensité lumineuse dans la chambre à 50 PPFD.
5. Cliquez sur Insérer après pour ajouter une nouvelle étape au protocole. Entrez 150 s dans la boîte: Après un délai de, sélectionnez Appliquer l’impulsion et entrez 4 dans la boîte: Ce nombre de fois, pour appliquer des impulsions de mesure toutes les 150 s, 4x d’affilée pendant que la lumière actinique est maintenue à 50 PPFD.
6. Des informations complètes sur le protocole sont fournies dans le tableau 1, utilisez les étapes 4.2 et 4.3 pour modifier l’intensité lumineuse et les étapes 4.4 et 4.5 pour entrer dans les cycles d’impulsions saturantes. Ajustez le délai et l’intensité lumineuse pour chaque étape en fonction des valeurs indiquées dans le tableau 1. Enregistrez votre protocole en tant que fichier .pcl dans un emplacement connu.
7. Éteignez la lumière, placez la plaque factice sur la scène d’échantillonnage et réglez la hauteur de la scène d’échantillonnage de manière à ce que les disques de feuilles soient à 140 mm au-dessus de la base de l’instrument. Une plaque factice est utilisée car la lumière sera clignotée à plusieurs reprises sur la plaque lors de la mise au point; cela nécessitera une adaptation à l’obscurité de tous les échantillons à mesurer et peut entraîner des dommages photo.
8. Cliquez sur l’icône Connecter/Déconnecter à l’appareil photo imageur et à l’appareil photo matériel pour démarrer l’appareil photo. Cliquez sur le symbole Focus (Fluorescence) représenté par une icône de flèche à deux côtés de couleur rouge avec deux lignes vertes à la base. Ajustez l’objectif et l’exposition pour mettre la plaque au point.
9. Cliquez à nouveau sur l’icône Focus (fluorescence) pour éteindre la lumière clignotante. En travaillant dans l’obscurité, remplacez la plaque factice par la plaque à analyser.
10. Cliquez sur l’icône de la caméra Map Image . Réglez l’exposition de l’image en ouvrant ou en fermant l’ouverture jusqu’à ce que la barre de la fenêtre contextuelle soit positionnée dans la zone verte.
11. Cliquez sur le bouton Réessayer après chaque réglage de l’ouverture jusqu’à ce que l’exposition soit correctement ajustée et que l’instrument prenne une image. Cliquez avec le bouton droit sur l’image et sélectionnez Appliquer l’isolation d’image pour bloquer les signaux d’arrière-plan. La zone foliaire focalisée sera affichée en gris et l’arrière-plan en bleu.
12. Sélectionnez la zone/les pixels d’intérêt pour inclure uniquement les disques de feuilles en ajustant l’histogramme et le niveau gamma dans le menu déroulant Modifier l’image en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’image.
13. Cliquez avec le bouton droit sur l’image et sélectionnez Supprimer les coupes hautes et basses (carte couleur) pour supprimer la zone en surbrillance bleu clair. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’image et sélectionnez Supprimer les pixels parasites (lourds) pour supprimer tous les pixels qui ne touchent pas au moins trois autres pixels.
    REMARQUE: Toutes les zones de l’image qui apparaissent comme des îles isolées seront analysées séparément et incluses dans la sortie de données finale. L’isolation de l’image et la suppression des pixels parasites permettent d’obtenir des données propres et compréhensibles.
14. Cliquez sur l’icône Exécuter le protocole pour démarrer le programme, une minuterie apparaîtra en bas de l’écran vous informant du temps qu’il reste au protocole pour s’exécuter.
15. Attendez que le protocole soit terminé, cliquez sur Fichier > Enregistrer sous, puis enregistrez les données en tant que fichier .igr. Fermez la fenêtre en cliquant sur la croix rouge en haut à droite de la fenêtre avant de commencer à exécuter une autre plaque d’échantillonnage.
16. Ouvrez un nouveau fichier pour l’échantillon suivant en sélectionnant Fichier > Nouveau et répétez les étapes 4.10 à 4.15 jusqu’à ce que toutes les plaques aient été mesurées.
    REMARQUE: Il est conseillé de mesurer les plaques dans un délai de 4 h ou moins pour minimiser l’impact potentiel de la régulation circadienne sur les résultats

5. Traitement des données de fluorescence de la chlorophylle

1. Ouvrez le fichier .igr dans le logiciel d’imagerie. Exportez les données en cliquant sur Fichier > Exporter vers un dossier pour créer un nouveau dossier avec tous les fichiers nécessaires.
2. Copiez les trois fichiers MATLAB suivants dans le dossier résultant : MapAndLabelDiscs.m (fichier supplémentaire 1), ProcessFoFm.m (fichier supplémentaire 2) et ProcessNPQdata.m (fichier supplémentaire 3), et le fichier R : create_file_to_process. R (Dossier supplémentaire 4).
3. Ouvrez MapAndLabelDiscs.m (fichier supplémentaire 1) dans MATLAB et exécutez-le. Enregistrez la carte des disques feuilles numérotés générés dans une fenêtre contextuelle en tant que fichier .png pour vérifier la numérotation des disques feuilles ultérieurement.
4. Ouvrez le fichier ProcessFoFm.m (fichier supplémentaire 2) dans MATLAB et exécutez-le pour calculer les valeurs F_o et F_m pour chaque disque feuille. Exécutez ProcessNPQdata.m (fichier supplémentaire 3) pour calculer les valeurs NPQ à chaque point temporel.
5. Ouvrez le fichier create_file_to_process. R (fichier supplémentaire 4) dans Rstudio et ajoutez la date dans le code à la ligne 5. Ajoutez le numéro de plaque à la ligne 8 dans create_file_to_process.R.
6. Exécutez create_file_to_process. R pour consolider les valeurs F_v/F_m et les données NPQ dans un fichier nommé d’après les données avec le suffixe -cf-summary.csv. Vérifiez la numérotation du disque feuille dans le fichier cf-summary à partir de l’étape 5.5 à l’aide du fichier .png de l’étape 5.3. Informations complémentaires relatives au numéro de parcelle et à l’accession.
7. Ouvrez le script R CF-data-processing_2.R (fichier supplémentaire 5) et remplacez la ligne 13 par le chemin du répertoire de travail. Remplacez la ligne 16 dans CF-data-processing_2.R par le nom du fichier à partir de l’étape 5.5.
8. Remplacez la ligne 48 dans CF-data-processing_2.R par le nom d’un fichier de sortie. Exécutez le script CF-data-processing_2.R pour reformater les données pour l’ajustement de courbe.
9. Ouvrez le script MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (fichier supplémentaire 6) dans MATLAB et remplacez la ligne 5 par le nom du fichier de sortie à partir de l’étape 5.8. Remplacez la ligne 85 dans MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m par un nouveau nom de fichier de sortie. Exécutez le script MatLab_NPQ_5_fit_model_v5 pour calculer les paramètres de relaxation NPQ.

Résultats

La figure 1A illustre une mesure typique du NPQ dans le soja cultivé en plein champ. Les plantes ont été cultivées à Urbana, IL (latitude 40.084604°, longitude -88.227952°) au cours de l’été 2021, avec des graines plantées le 5 juin. 2021. Les disques de feuilles ont été échantillonnés après 30 jours de plantation de semences, et des mesures ont été effectuées avec le protocole fourni (tableau 1). Les valeurs F_v/F_m et NPQ ont été calcu...

Discussion

Un choix et une manipulation minutieux des disques de feuilles sont essentiels pour obtenir des mesures fiables du NPQ. Tout d’abord, les dommages aux tissus, tels qu’une manipulation brutale avec une pince à épiler, introduiront un stress, ce qui entraînera de faibles valeurs pour l’efficacité quantique maximale de la photosynthèse. Les plantes non stressées ont généralement des valeurs F_v/F_m d’environ 0,83¹⁸, avec des baisses significatives...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012929	Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012931	Country of Origin: United States of America
Aluminum foil	Antylia Scientific	61018-56	Country of Origin: United States of America
Black marker pen	Sharpie	SAN30001	Country of Origin: United States of America
CF imager	Technologica Ltd.	N/A	chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm	Humboldt Mfg Co	H9665	Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software	Technologica Ltd.	N/A	imaging software Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters	Amazon	B07P6XCTGV	Country of Origin: United States of America
Marker stakes	John Henry Company	KN0151	Country of Origin: United States of America
Paper scissors	VWR	82027-596	Country of Origin: United States of America
Parafilm	Bemis Company Inc.	S3-594-6	Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers	Fisher Scientific	14-130M	Country of Origin: United States of America