Analisi ad alto rendimento della tempra non fotochimica nelle colture utilizzando la fluorometria clorofilla modulata con ampiezza di impulso

Riepilogo

Il protocollo introduce un metodo ad alto rendimento per misurare il rilassamento della tempra non fotochimica mediante fluorometria clorofilliana modulata in ampiezza di impulso. Il metodo viene applicato alla glicina max coltivata sul campo e può essere adattato ad altre specie per lo screening della diversità genetica o delle popolazioni riproduttive.

Abstract

La fotosintesi non è ottimizzata nelle moderne varietà di colture e quindi offre un'opportunità di miglioramento. Accelerare il rilassamento della tempra non fotochimica (NPQ) si è dimostrata una strategia efficace per aumentare le prestazioni fotosintetiche. Tuttavia, il potenziale di riproduzione per migliorare NPQ e una comprensione completa delle basi genetiche del rilassamento NPQ è carente a causa delle limitazioni del sovracampionamento e della raccolta di dati da piante coltivate in campo. Sulla base di rapporti precedenti, presentiamo un test ad alto rendimento per l'analisi dei tassi di rilassamento NPQ in Glycine max (soia) utilizzando la fluorometria clorofilliana modulata dall'ampiezza dell'impulso (PAM). I dischi fogliari vengono campionati da semi di soia coltivati in campo prima del trasporto in un laboratorio dove il rilassamento NPQ viene misurato in un fluorometro PAM chiuso. I parametri di rilassamento NPQ sono calcolati adattando una funzione bie-esponenziale ai valori NPQ misurati a seguito di una transizione da alta a bassa illuminazione. Utilizzando questo metodo, è possibile testare centinaia di genotipi in un giorno. La procedura ha il potenziale per schermare i pannelli mutanti e di diversità per la variazione nel rilassamento NPQ e può quindi essere applicata a domande di ricerca sia fondamentali che applicate.

Introduzione

La fotosintesi consiste nell'assorbimento della luce, nel trasferimento di elettroni primari, nella stabilizzazione dell'energia e nella sintesi e trasporto di prodotti fotosintetici¹. Comprendere ogni passaggio è fondamentale per guidare gli sforzi per aumentare l'efficienza fotosintetica delle colture. La luce influenza il tasso di fotosintesi, richiedendo un apporto energetico di bilanciamento, sotto forma di fotoni, con la domanda di equivalenti riducenti. Quando l'offerta supera la domanda, ad esempio in condizioni di luce intensa o durante la ridotta fissazione di CO₂ causata dalla chiusura stomatica, l'accumulo di potenza riducente aumenta la probabilità di formazione di specie reattive dell'ossigeno con il potenziale di danneggiare l'apparato fotosintetico e compromettere il trasporto di elettroni. Pertanto, per prevenire danni, le piante hanno sviluppato diversi meccanismi fotoprotettivi, tra cui la disintossicazione delle specie reattive dell'ossigeno e la tempra non fotochimica degli stati eccitati della clorofilla (NPQ)².

Mantenere alti tassi di fotosintesi è difficile in un ambiente di campo. I cambiamenti stagionali e diurni, insieme alle fluttuazioni ambientali come i movimenti fogliari indotti dal vento e la copertura nuvolosa transitoria, causano cambiamenti nella quantità e nell'intensità della luce ricevuta dalle piante per la fotosintesi³. NPQ dissipa l'energia luminosa in eccesso e può aiutare a prevenire i foto-danni, consentendo al contempo tassi sostenuti di fotosintesi ad alta luminosità⁴. Tuttavia, l'NPQ prolungato durante le transizioni da alta a bassa illuminazione continua a dissipare l'energia che potrebbe essere utilizzata per la riduzione del carbonio⁵. Di conseguenza, accelerare il rilassamento di NPQ può aumentare l'efficienza della fotosintesi⁶, rendendo il rilassamento NPQ un obiettivo attraente per il miglioramento delle colture.

L'analisi di fluorescenza della clorofilla modulata in ampiezza di impulso (PAM) può essere utilizzata per calcolare NPQ da parametri misurabili (Tabella supplementare 1 e Tabella supplementare 2)^7,8,9. Questo articolo si concentra sulla determinazione dei tassi di rilassamento NPQ nelle piante coltivate sul campo allo scopo di vagliare la variazione naturale del germoplasma. Tuttavia, l'analisi fluorometrica della clorofilla PAM può anche essere utilizzata per un'ampia varietà di scopi, applicata a specie che vanno dalle alghe alle piante superiori, ed è rivista altrove ^7,8,9.

In una foglia o cellula adattata al buio, i centri di reazione del fotosistema II (PSII) sono aperti per ricevere elettroni e non c'è NPQ. L'accensione di una luce di misurazione a bassa intensità provoca la fluorescenza della clorofilla evitando il trasporto di elettroni attraverso PSII. La fluorescenza minima registrata in questo stato adattato al buio è descritta dal parametro F_o. L'applicazione di un impulso luminoso ad alta intensità a una foglia adattata al buio può ridurre rapidamente il primo pool stabile di accettori di elettroni legati al sito A del chinone. Questo blocca temporaneamente la capacità di trasferimento di elettroni nei centri di reazione PSII, che si dice siano chiusi e incapaci di ricevere elettroni dalla scissione dell'acqua. Utilizzando una breve durata dell'impulso, non c'è tempo sufficiente per stimolare NPQ. La fluorescenza della clorofilla risultante è equivalente al valore massimo ottenibile in assenza di NPQ, o fluorescenza massima, F_m. La differenza tra fluorescenza minima e massima è indicata come fluorescenza variabile, F_v. La resa quantistica fotochimica massima del fotosistema II (F_v/F_m) è calcolata da questi due parametri utilizzando la seguente equazione:

F_v/F_m = (F_{m-F o})/F_m

Questo può fornire un importante indicatore della funzione del fotosistema e dello stress. L'accensione di una luce attinica (fotosintetica) stimola la tempra non fotochimica e la successiva applicazione di un flash saturante consente la misurazione della fluorescenza massima adattata alla luce, F_m'. Confrontando la differenza tra fluorescenza massima scura e adattata alla luce, nPQ può essere calcolato secondo l'equazione di Stern-Volmer¹⁰:

NPQ = F_m/F_m' - 1

Negli impianti superiori, nPQ è stato descritto come costituito da almeno cinque componenti distinti, tra cui qE, qT, qZ, qI e qH. I meccanismi precisi coinvolti nella NPQ non sono completamente compresi; tuttavia, il qE è considerato il componente principale di NPQ nella maggior parte degli impianti. Fattori cruciali per il pieno coinvolgimento della qE sono stati trovati per includere l'accumulo di un gradiente protonico attraverso la membrana tilacoide, l'attività della subunità S^11,12 del fotosistema II e le xantofille de-epossidate, l'antheraxanthin, la luteina e in particolare la zeaxantina¹³. qE rilassa il più veloce di qualsiasi componente NPQ (< 2 min)¹⁴, e l'attivazione reversibile del qE è quindi particolarmente importante per l'adattamento alle intensità della luce mutevoli. Una seconda fase più lenta del rilassamento NPQ (~2-30 min) comprende sia qT, correlata alle transizioni di stato, sia qZ, che coinvolge l'interconversione della zeaxantina in violaxantina¹⁵. Il rilassamento lento (> 30 min) di NPQ può includere sia la tempra fotoinibitoria (qI)¹⁶ che processi indipendenti dal fotodanno^17,18, come il qH, che è una tempra sostenuta nelle antenne periferiche di PSII mediata da una proteina lipocalina plastide^19,20.

NPQ aumenta durante l'esposizione alla luce intensa. Il successivo trasferimento in condizioni di scarsa illuminazione può comportare una downregulation di NPQ. Il decadimento delle fasi di rilassamento veloce, intermedio e lento può essere catturato nei parametri di una funzione biemi esponenziale 15,21,22,23

NPQ = Aq1^(-t/τ1) + Aq2^(-t/τ2) + Aq3

La base teorica per la funzione bi-esponenziale si basa sull'assunzione dell'utilizzo del primo ordine di ipotetici quecher, tra cui qE (Aq1), il rilassamento combinato di qZ e qT (Aq2), con le corrispondenti costanti temporali τq1 e τq2, e NPQ a lungo termine, che include qI e processi indipendenti dal fotodanno (Aq3). Come tale, la funzione bi-esponenziale fornisce una rappresentazione più realistica dei molteplici processi biologici connessi coinvolti nella tempra della clorofilla rispetto a una più semplice equazione di Hill che manca di una base teorica²⁴.

NPQ può essere misurato utilizzando una varietà di fluorometri PAM disponibili in commercio ^25,26, dai semplici dispositivi portatili²⁷ ai sistemi chiusi più avanzati²⁸. Tuttavia, una limitazione di molti di questi approcci è un throughput relativamente basso, che rende difficile lo screening di grandi collezioni di piante senza più dispositivi e un team di ricercatori. Per affrontare questo problema, McAusland et al. hanno sviluppato una procedura basata sul tessuto fogliare asportato e l'hanno utilizzata per identificare le differenze nella fluorescenza della clorofilla tra due cultivar di grano²⁹. L'attrazione di questo approccio è che l'imaging dei dischi fogliari, prelevati da più piante con un singolo dispositivo, può facilitare lo screening di centinaia di genotipi in un giorno. Ciò consente di valutare la variazione nel rilassamento NPQ come parte di studi di associazione a livello di genoma o per lo screening di popolazioni riproduttive con il potenziale per aumentare l'efficienza fotosintetica delle colture e, in definitiva, la resa.

Basandoci sui risultati di McAusland et ^al.29, utilizziamo l'analisi di fluorescenza della clorofilla PAM dei dischi fogliari per lo screening ad alto rendimento dei tassi di rilassamento NPQ in Glycine max (G.max; soia). Questo protocollo utilizza il CF Imager²⁵, che è paragonabile ad altri sistemi PAM chiusi disponibili in commercio, come il popolare FluorCam²⁶. Con una stanza buia per l'adattamento dei campioni, gli utenti possono visualizzare piatti a 96 pozzetti, piastre di Petri e piccole piante. Il vantaggio principale di questo approccio è l'aumento della produttività offerto dall'utilizzo di dischi fogliari rispetto all'analisi sequenziale dei singoli impianti. Qui presentiamo risultati rappresentativi e un metodo per il campionamento, la misurazione e l'analisi di NPQ in piante coltivate sul campo.

Protocollo

1. Semina

1. Scegli un sito sul campo con terreno fertile, ben drenato, ma non sabbioso e con un pH di quasi 6,5. Segna i lotti di fila da 1,2 m con una spaziatura di 0,75 m segnando il terreno con una zappa.
2. Piantare 50 semi/m di G.max cv. IA3023 a 3 cm di profondità lungo ogni appezzamento all'inizio della stagione di crescita quando le temperature del suolo sono comprese tra 25 e 30 °C.
   NOTA: Ai fini dello screening della diversità genetica, si prevede che vengano coltivati e confrontati più genotipi diversi. Pianta 2-5 righe per genotipo disposte in un design a blocchi casuali. Si dovrebbe considerare se le condizioni climatiche si adattano alla crescita della soia, incluso il tipo di suolo, la temperatura e la durata del giorno.

2. Raccolta di campioni di foglie dal campo

1. Campionare le piante nel sito del campo 30 giorni dopo la germinazione.
   NOTA: Dopo 30 giorni le piante di soia saranno in fase vegetativa. Il numero di giorni dopo la germinazione prima del campionamento dipende dalla questione biologica affrontata.
2. Riempire i pozzetti di una piastra a 24 pozzetti fino a 1/3^{di °} con acqua distillata. Etichettare il coperchio e il lato della piastra con le repliche da campionare.
3. Seleziona la foglia più giovane completamente espansa nella parte superiore della pianta da campionare. Tenere la foglia contro un tappo di gomma.
4. Premere una piralide di sughero Humboldt #2 attraverso la foglia e ruotare per tagliare un disco evitando la costola centrale. Raccogli consecutivamente 5 dischi dalla stessa foglia per le repliche tecniche. Prendi circa il 30% in più di dischi fogliari per ogni appezzamento di quanto richiesto nel caso in cui il tessuto fogliare sia danneggiato durante il trasporto o dal campionamento.
   NOTA: Il numero di repliche biologiche (appezzamenti o piante) e il numero di repliche tecniche (dischi fogliari della stessa pianta o appezzamento) possono variare a seconda del progetto sperimentale.
5. Spingere i dischi fogliari fuori dalla piralide del sughero in un unico pozzetto di un piatto a 24 pozzetti usando un batuffolo di cotone. Controllare che tutti i dischi fogliari galleggino nell'acqua. In caso contrario, spostare delicatamente i dischi fogliari che si attaccano al lato di un pozzo in posizione fluttuante con un batuffolo di cotone.
6. Passare al plottaggio successivo e ripetere i passaggi da 2.3 a 2.5. Spingere i dischi fogliari fuori dalla piralide del sughero in un pozzo separato in un piatto a 24 pozzetti usando un batuffolo di cotone. Ripetere questo passaggio per raccogliere una terza replica biologica.
7. Ripetere il passaggio 2.6 fino a quando non è stata campionata una piastra completa a 24 pozzetti. Posizionare un coperchio e sigillare con un film semitrasparente e flessibile. Conservare la piastra al riparo dalla luce solare diretta, in un sacchetto, in una scatola o in un dispositivo di raffreddamento vuoto (senza ghiaccio).

3. Preparazione dei campioni per l'analisi

1. Tornare in uno spazio di laboratorio pulito dopo il campionamento. Toccare il coperchio della piastra sigillata per rimuovere i dischi fogliari attaccati al coperchio durante il trasporto. Scartare il film e rimuovere il coperchio.
2. Trasferire un disco fogliare dalla prima posizione della piastra a 24 pozzetti in una piastra fresca a 96 pozzetti, con il disco fogliare rivolto verso il basso nella parte inferiore del pozzetto.
3. Tagliare a metà un filtro aspiratore nasale. Immergere il filtro risultante a metà dell'acqua e tamponare su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Inserire il filtro nel pozzetto con il disco fogliare per mantenere l'umidità.
4. Prendere un secondo disco fogliare dalla prima posizione della piastra a 24 pozzetti e posizionarlo a faccia in giù nella successiva posizione disponibile della piastra a 96 pozzetti. Immergere in acqua la restante metà del filtro nasale prodotto al punto 3.3 e tamponare su un tovagliolo di carta prima di inserirlo nel pozzo con il secondo disco fogliare.
5. Ripetere i passaggi da 3,3 a 3,4 per un terzo disco fogliare dalla prima posizione della piastra a 24 pozzetti.
6. Passare alla seconda posizione della piastra a 24 pozzetti e ripetere i passaggi da 3,3 a 3,5.
7. Posizionare il coperchio sulla piastra quando tutti i pozzetti hanno dischi fogliari e filtri aspiratori nasali inseriti. Nastro nell'angolo in alto a destra per orientare la lastra al buio per l'imaging.
8. Sigillare le piastre con un film semitrasparente e flessibile e avvolgere la piastra in un foglio di alluminio. Scrivi gli ID del plottaggio e l'ID della piastra sul foglio di alluminio.
9. Posizionare le piastre in una scatola o in un armadio scuro per un minimo di 30 minuti, per consentire il rilassamento delle prime due fasi di NPQ (qE, qT, qZ). Utilizzare un periodo di incubazione più lungo e scuro di 1 ora prima dell'imaging se le fasi a lungo termine di NPQ sono di interesse.
10. Preparare una piastra fittizia aggiuntiva per la messa a fuoco durante l'analisi. Per fare questo, posizionare un disco fogliare in ciascuno degli angoli di un piatto fresco a 96 pozzetti e uno al centro. Fissare i dischi fogliari con filtri nasali come fatto con le piastre precedenti. Sigillare la piastra e incubare al buio a temperatura ambiente (24 °C), ~ 50% di umidità relativa.

4. Misurazione della tempra non fotochimica utilizzando imager a fluorescenza clorofilla

1. Accendere l'imager e aprire il software di imaging. Fare clic su Impostazioni > protocollo per aprire una finestra per l'immissione dei passaggi nel protocollo sperimentale PAM. Le specifiche tecniche della macchina sono fornite nella tabella supplementare 3.
2. Impostare il programma per iniziare con un impulso di saturazione per misurare la massima efficienza quantistica della fotosintesi adattata al buio inserendo 20 s nella scatola: Dopo un ritardo di. Fare clic sulla casella Applica impulso e immettere 1 nella casella: questo numero di volte.
3. Imposta l'impulso PPFD su 6152, la lunghezza dell'impulso su 800 ms e seleziona la casella Prendi immagini F ' & Fm' con tutti gli impulsi. Fare clic su Inserisci dopo per aggiungere un secondo passaggio al protocollo.
4. Inserisci 30 s nella casella: Dopo un ritardo di. Selezionare l'opzione Cambia attinico e immettere 50 nella casella: Actinic PPFD, per impostare l'intensità della luce nella camera su 50 PPFD.
5. Fare clic su Inserisci dopo per aggiungere un nuovo passaggio al protocollo. Immettere 150 s nella casella: dopo un ritardo di, selezionare Applica impulso e immettere 4 nella casella: questo numero di volte, per applicare impulsi di misurazione ogni 150 s, 4 volte di fila mentre la luce attinica è mantenuta a 50 PPFD.
6. Le informazioni complete del protocollo sono fornite nella Tabella 1, utilizzare i passaggi 4.2 e 4.3 per modificare l'intensità della luce e i passaggi 4.4 e 4.5 per entrare nei cicli di impulsi di saturazione. Regolare il ritardo e l'intensità della luce per ogni passo in base ai valori forniti nella Tabella 1. Salvare il protocollo come file con estensione pcl in una posizione nota.
7. Spegnere la luce, posizionare la piastra fittizia sullo stadio del campione e impostare l'altezza dello stadio del campione in modo che i dischi fogliari si trovino a 140 mm sopra la base dello strumento. Una piastra fittizia viene utilizzata poiché la luce verrà ripetutamente lampeggiata sulla piastra durante la messa a fuoco; ciò richiederà l'adattamento ri-scuro di qualsiasi campione da misurare e potrebbe causare fotodanni.
8. Fare clic sull'icona Connetti/Disconnetti a Imager Camera e Hardware per avviare la fotocamera. Fare clic sul simbolo Di messa a fuoco (fluorescenza) rappresentato da un'icona a forma di freccia a due lati di colore rosso con due linee verdi alla base. Regolare l'obiettivo e l'esposizione per mettere a fuoco la piastra.
9. Fare di nuovo clic sull'icona Messa a fuoco (fluorescenza) per spegnere la luce lampeggiante. Lavorando al buio, sostituire la piastra fittizia con la piastra da analizzare.
10. Fare clic sull'icona Della fotocamera Immagine mappa . Regola l'esposizione dell'immagine aprendo o chiudendo l'apertura fino a quando la barra nella finestra pop-up non è posizionata nella zona verde.
11. Fare clic sul pulsante Riprova dopo ogni regolazione dell'apertura fino a quando l'esposizione non viene regolata correttamente e lo strumento acquisisce un'immagine. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionare Applica isolamento immagine per bloccare i segnali di sfondo. L'area foglia focalizzata verrà visualizzata in grigio e lo sfondo in blu.
12. Selezionare l'area/i pixel di interesse per includere solo i dischi foglia regolando l'istogramma e il livello di gamma dal menu a discesa Modifica immagine facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine.
13. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionare Elimina tagli alti e bassi (mappa a colori) per eliminare l'area evidenziata in azzurro. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionare Elimina randagi (pesanti) per rimuovere tutti i pixel che non toccano almeno altri tre pixel.
    NOTA: tutte le aree dell'immagine che appaiono come isole isolate verranno analizzate separatamente e incluse nell'output finale dei dati. L'isolamento dell'immagine e la rimozione dei pixel vaganti si traducono in dati puliti e comprensibili.
14. Fare clic sull'icona Esegui protocollo per avviare il programma, nella parte inferiore dello schermo verrà visualizzato un timer che informa l'esecuzione del protocollo.
15. Attendere il termine del protocollo, fare clic su File > Salva con nome e salvare i dati come file con estensione igr. Chiudi la finestra facendo clic sulla croce rossa in alto a destra della finestra prima di iniziare a eseguire un'altra piastra campione.
16. Aprire un nuovo file per l'esempio successivo selezionando File > Nuovo e ripetere i passaggi da 4.10 a 4.15 fino a quando tutte le piastre non sono state misurate.
    NOTA: Si consiglia di misurare le piastre entro un periodo di 4 ore o meno per ridurre al minimo il potenziale impatto della regolazione circadiana sui risultati

5. Elaborazione dei dati di fluorescenza della clorofilla

1. Aprire il file .igr nel software di imaging. Esportare i dati facendo clic su File > Esporta in cartella per creare una nuova cartella con tutti i file necessari.
2. Copia i seguenti tre file MATLAB nella cartella risultante: MapAndLabelDiscs.m (File supplementare 1), ProcessFoFm.m (File supplementare 2) e ProcessNPQdata.m (File supplementare 3) e il file R: create_file_to_process. R (Fascicolo complementare 4).
3. Apri MapAndLabelDiscs.m (File supplementare 1) in MATLAB ed eseguilo. Salvare la mappa dei dischi foglia numerati generati in una finestra popup come file .png per controllare la numerazione dei dischi foglia in un secondo momento.
4. Aprire il file ProcessFoFm.m (File supplementare 2) in MATLAB ed eseguire per calcolare i valori F_o e F_m per ogni disco foglia. Eseguire ProcessNPQdata.m (File supplementare 3) per calcolare i valori NPQ in ogni punto temporale.
5. Aprire il create_file_to_process del file. R (Supplementary File 4) in Rstudio e aggiungere la data nel codice alla riga 5. Aggiungere il numero di targa alla riga 8 in create_file_to_process.R.
6. Esegui create_file_to_process. R per consolidare i valori F_v/F_m e i dati NPQ in un unico file che prende il nome dai dati con il suffisso -cf-summary.csv. Controllare la numerazione del disco foglia nel file di riepilogo cf dal passaggio 5.5 utilizzando il file .png dal passaggio 5.3. Informazioni aggiuntive relative al numero di appezzamento e all'adesione.
7. Aprire lo script R CF-data-processing_2.R (file supplementare 5) e modificare la riga 13 nel percorso della directory di lavoro. Modificare la riga 16 in CF-data-processing_2.R con il nome del file dal passaggio 5.5.
8. Modificare la riga 48 in CF-data-processing_2.R con il nome di un file di output. Eseguite lo script CF-data-processing_2.R per riformattare i dati per l'adattamento della curva.
9. Apri lo script MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (File supplementare 6) in MATLAB e cambia la riga 5 con il nome del file di output dal passaggio 5.8. Modificare la riga 85 in MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m con un nuovo nome di file di output. Eseguire script MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m per calcolare i parametri di rilassamento NPQ.

Risultati

La Figura 1A illustra una misura tipica di NPQ nella soia coltivata in campo. Le piante sono state coltivate a Urbana, IL (latitudine 40.084604°, longitudine -88.227952°) durante l'estate 2021, con semi piantati il 5 giugno. 2021. I dischi fogliari sono stati campionati dopo 30 giorni di semina e le misurazioni sono state effettuate con il protocollo fornito (Tabella 1). I valori F_v/F_m e NPQ sono stati calcolati per ciascun disco fogliare (Tabella...

Discussione

La scelta accurata e la gestione dei dischi fogliari sono fondamentali per ottenere misurazioni affidabili di NPQ. In primo luogo, i danni al tessuto, come la manipolazione approssimativa con una pinzetta, introdurranno stress, con conseguenti valori bassi per la massima efficienza quantistica della fotosintesi. Le piante non stressate hanno tipicamente valori F_v/F_m di circa 0,83¹⁸, con cali significativi che indicano una riduzione delle prestazioni fotosint...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012929	Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012931	Country of Origin: United States of America
Aluminum foil	Antylia Scientific	61018-56	Country of Origin: United States of America
Black marker pen	Sharpie	SAN30001	Country of Origin: United States of America
CF imager	Technologica Ltd.	N/A	chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm	Humboldt Mfg Co	H9665	Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software	Technologica Ltd.	N/A	imaging software Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters	Amazon	B07P6XCTGV	Country of Origin: United States of America
Marker stakes	John Henry Company	KN0151	Country of Origin: United States of America
Paper scissors	VWR	82027-596	Country of Origin: United States of America
Parafilm	Bemis Company Inc.	S3-594-6	Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers	Fisher Scientific	14-130M	Country of Origin: United States of America