パルス振幅変調クロロフィル蛍光測定を用いた作物の非光化学的急冷のハイスループット分析

要約

このプロトコルは、パルス振幅変調クロロフィル蛍光測定法による非光化学的消光の緩和を測定するためのハイスループット法を導入する。この方法は、野外で栽培された グリシンマックス に適用され、遺伝的多様性または繁殖集団をスクリーニングするために他の種に適応させることができる。

要約

光合成は現代の作物品種では最適化されていないため、改善の機会を提供します。非光化学消光(NPQ)の緩和をスピードアップすることは、光合成性能を向上させるための効果的な戦略であることが証明されています。しかし、NPQの改善とNPQ緩和の遺伝的基盤の完全な理解のために繁殖する可能性は、野外で栽培された作物植物からのオーバーサンプリングとデータ収集の制限のために欠けている。以前の報告に基づいて、我々は、パルス振幅変調(PAM)クロロフィル蛍光測定法を用いて グリシンマックス (大豆)におけるNPQ緩和率を分析するためのハイスループットアッセイを提示する。葉のディスクは、NPQ緩和が閉じたPAM蛍光光度計で測定される実験室に輸送される前に、畑で栽培された大豆からサンプリングされます。NPQ緩和パラメータは、高輝度から低照度への移行後に測定されたNPQ値に双指数関数を当てはめることによって計算されます。この方法を使用すると、1日以内に何百もの遺伝子型を検査することができます。この手順は、NPQ緩和の変動について変異体および多様性パネルをスクリーニングする可能性を秘めているため、基礎研究と応用研究の両方の質問に適用することができます。

概要

光合成は、光吸収、一次電子移動、エネルギー安定化、光合成産物の合成と輸送からなる¹.各ステップを理解することは、作物の光合成効率を高めるための努力を導くために不可欠です。光は光合成の速度に影響し、光子の形でのエネルギー供給と等価物を減らすための需要のバランスをとる必要があります。供給が需要を超える場合、例えば、高光下または気孔閉鎖によって引き起こされる_CO2 固定の減少中に、還元力の蓄積は、光合成装置を損傷し、電子輸送を損なう可能性のある活性酸素種形成の可能性を高める。したがって、損傷を防ぐために、植物は活性酸素種の無害化および励起クロロフィル状態(NPQ)²の非光化学的消光を含むいくつかの光保護機構を開発した。

光合成を高い速度で維持することは、フィールド環境下では困難です。季節的および日周的な変化は、風による葉の動きや一時的な雲量などの環境変動とともに、植物が光合成のために受け取る光の量と強度に変化を引き起こし^ます3。NPQは余分な光エネルギーを放散し、ハイライト⁴での光合成の持続速度を可能にしながら、光損傷を防ぐのに役立ちます。しかし、高光から低照度の遷移中にNPQが長引くと、炭素削減に使用できるエネルギーが散逸し続けます^5....

プロトコル

1. 種を植える

1. 肥沃で水はけがよく、砂質の土壌ではなく、pHがほぼ6.5の畑のサイトを選択してください。1.2 mの列のプロットを0.75 mの間隔でマークし、鍬で地面を得点します。
2. 土壌温度が25〜30°Cの間である成長期の初めに、各プロットに沿って3cmの深さで G.max cv. IA3023の50種子/ mを植える。
   注:遺伝的多様性をスクリーニングする目的で、複数の異なる遺伝子型が成長し、比較されることが期待される。植物は、遺伝子型あたり2〜5列をランダムブロック設計で配置する。土壌の種類、温度、日の長さなど、気候条件が大豆の成長に合っているかどうかを考慮する必要があります。

2. 畑から葉のサンプルを採取する

1. 発芽後30日目に畑の植物をサンプリングする。
   注:30日後、大豆植物は栄養段階になります。発芽後サンプリングまでの日数は、対処されている生物学的問題に依存する。
2. 24ウェルプレートのウェルを蒸留^水で1 /3まで満たします。蓋とプレートの側面に、サンプリングする反復物のラベルを付けます。
3. サンプリングする植物の上部にある最も若い完全に展開された葉を選択します。葉をゴム栓にかざします。
4. #2フンボルトコルクボーラ....

結果

図1Aは、畑で栽培された大豆におけるNPQの典型的な測定値を示しています。2021年夏にイリノイ州アーバナ(緯度40.084604°、経度-88.227952°)で植物を栽培し、6月5日に種子を植えました。種子を植え付けてから30日後にリーフディスクをサンプリングし、提供されたプロトコルで測定を行った(表1)。_Fv/_FmおよびNPQ値は各リーフディスクについて計算さ?.......

ディスカッション

リーフディスクの慎重な選択と取り扱いは、NPQの信頼性の高い測定値を得るために重要です。第一に、ピンセットによる粗い取り扱いなどの組織への損傷は、ストレスをもたらし、光合成の最大量子効率のための低い値をもたらす。非ストレス植物は、典型的には、約0.83¹⁸の_Fv/_Fm値を有し、有意な低下は光合成性能の低下を示す⁹

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012929	Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012931	Country of Origin: United States of America
Aluminum foil	Antylia Scientific	61018-56	Country of Origin: United States of America
Black marker pen	Sharpie	SAN30001	Country of Origin: United States of America
CF imager	Technologica Ltd.	N/A	chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm	Humboldt Mfg Co	H9665	Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software	Technologica Ltd.	N/A	imaging software Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters	Amazon	B07P6XCTGV	Country of Origin: United States of America
Marker stakes	John Henry Company	KN0151	Country of Origin: United States of America
Paper scissors	VWR	82027-596	Country of Origin: United States of America
Parafilm	Bemis Company Inc.	S3-594-6	Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers	Fisher Scientific	14-130M	Country of Origin: United States of America