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要約

このプロトコルは、パルス振幅変調クロロフィル蛍光測定法による非光化学的消光の緩和を測定するためのハイスループット法を導入する。この方法は、野外で栽培された グリシンマックス に適用され、遺伝的多様性または繁殖集団をスクリーニングするために他の種に適応させることができる。

要約

光合成は現代の作物品種では最適化されていないため、改善の機会を提供します。非光化学消光(NPQ)の緩和をスピードアップすることは、光合成性能を向上させるための効果的な戦略であることが証明されています。しかし、NPQの改善とNPQ緩和の遺伝的基盤の完全な理解のために繁殖する可能性は、野外で栽培された作物植物からのオーバーサンプリングとデータ収集の制限のために欠けている。以前の報告に基づいて、我々は、パルス振幅変調(PAM)クロロフィル蛍光測定法を用いて グリシンマックス (大豆)におけるNPQ緩和率を分析するためのハイスループットアッセイを提示する。葉のディスクは、NPQ緩和が閉じたPAM蛍光光度計で測定される実験室に輸送される前に、畑で栽培された大豆からサンプリングされます。NPQ緩和パラメータは、高輝度から低照度への移行後に測定されたNPQ値に双指数関数を当てはめることによって計算されます。この方法を使用すると、1日以内に何百もの遺伝子型を検査することができます。この手順は、NPQ緩和の変動について変異体および多様性パネルをスクリーニングする可能性を秘めているため、基礎研究と応用研究の両方の質問に適用することができます。

概要

光合成は、光吸収、一次電子移動、エネルギー安定化、光合成産物の合成と輸送からなる1.各ステップを理解することは、作物の光合成効率を高めるための努力を導くために不可欠です。光は光合成の速度に影響し、光子の形でのエネルギー供給と等価物を減らすための需要のバランスをとる必要があります。供給が需要を超える場合、例えば、高光下または気孔閉鎖によって引き起こされるCO2 固定の減少中に、還元力の蓄積は、光合成装置を損傷し、電子輸送を損なう可能性のある活性酸素種形成の可能性を高める。したがって、損傷を防ぐために、植物は活性酸素種の無害化および励起クロロフィル状態(NPQ)2の非光化学的消光を含むいくつかの光保護機構を開発した。

光合成を高い速度で維持することは、フィールド環境下では困難です。季節的および日周的な変化は、風による葉の動きや一時的な雲量などの環境変動とともに、植物が光合成のために受け取る光の量と強度に変化を引き起こします3。NPQは余分な光エネルギーを放散し、ハイライト4での光合成の持続速度を可能にしながら、光損傷を防ぐのに役立ちます。しかし、高光から低照度の遷移中にNPQが長引くと、炭素削減に使用できるエネルギーが散逸し続けます5。その結果、NPQの緩和を高速化することで、光合成6の効率を高めることができ、NPQ緩和は作物改良のための魅力的なターゲットとなる。

パルス振幅変調クロロフィル蛍光(PAM)分析は、測定可能なパラメータ(補足表1および補足表 2)7、8、9からNPQを計算するために使用することができる。本稿では、生殖質の自然変動をスクリーニングする目的で、野外植物におけるNPQ緩和率の決定に焦点を当てる。しかしながら、PAMクロロフィル蛍光測定分析は、藻類から高等植物に至るまでの種に適用され、多種多様な目的にも使用することができ、他の場所でレビューされている7、8、9。

暗く適応した葉や細胞では、光系II(PSII)反応中心は電子を受け取るために開いており、NPQはありません。低強度の測定光をオンにすると、PSIIを介した電子輸送を回避しながらクロロフィル蛍光を誘発します。この暗適応状態で記録された最小蛍光は、パラメータFoによって記述される。暗に適応した葉に高強度の光パルスを印加すると、キノンA部位に結合したキノンの第一の安定電子受容体プールを急速に減少させることができる。これは、PSII反応中心における電子移動能力を一時的に遮断し、PSII反応中心は閉鎖的であり、水分解から電子を受け取ることができないと言われる。短いパルス持続時間を使用することにより、NPQを刺激するのに十分な時間がない。得られたクロロフィル蛍光は、NPQの非存在下で得られる最大値、または最大蛍光、Hmに相当する。最小蛍光と最大蛍光の差は、可変蛍光Fvと呼ばれます。光系IIの最大光化学量子収率(Fv/Fm)は、次の式を使用してこれら2つのパラメータから計算されます。

Fv/F m = (F m-Fo)/F m

これは、光系の機能とストレスの重要な指標を提供することができます。活性(光合成)光をオンにすると、非光化学的消光が刺激され、その後の飽和フラッシュの適用により、光に適応した最大蛍光Fm'の測定が可能になります。暗と光に適合した最大蛍光の差を比較することにより、NPQはスターン・ボルマー式10に従って計算できます。

NPQ = F m/Fm' - 1

高等植物では、NPQはqE、qT、qZ、qIおよびqHを含む少なくとも5つの異なる成分からなると記載されている。NPQに関わる正確なメカニズムは完全には理解されていません。しかし、qEはほとんどの植物においてNPQの主要な構成要素であると考えられている。qEの完全な関与のための重要な要因には、チラコイド膜を横切る陽子勾配の蓄積、光系IIサブユニットS11,12の活性、および脱エポキシ化キサントフィル、アンテラキサンチン、ルテイン、および特にゼアキサンチン13が含まれることが見出されている。qEはNPQ成分の中で最も速く(<2分)14を緩和し、したがってqEの可逆的活性化は光強度のシフトへの適応にとって特に重要である。NPQ緩和の第2のより遅い段階(〜2〜30分)は、状態遷移に関連するqTと、ゼアキサンチンからビオラキサンチン15への相互変換を伴うqZの両方を包含する。NPQの緩慢弛緩(>30分)は、プラスチドリポカリンタンパク質19,20によって媒介されるPSIIの末梢アンテナにおける持続的な消光であるqHなどの光損傷17,18とは無関係の光阻害性消光(qI)16およびプロセスの両方を含み得る。

NPQは、高光に曝されると増加します。その後の低照度への転送は、NPQのダウンレギュレーションにつながる可能性があります。高速、中間、および低速の緩和位相の減衰は、双指数関数15,21,22,23のパラメータに取り込むことができます。

NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3

双指数関数の理論的基礎は、qE(Aq1)、qZとqTの結合緩和(Aq2)、対応する時定数τq1とτq2、およびqIと光損傷に依存しないプロセス(Aq3)を含む長期NPQを含む仮説的なクエンチャーの一次利用の仮定に基づいています。このように、双指数関数は、理論的根拠を欠いているより単純なヒル方程式と比較して、クロロフィル蛍光の消光に関与する複数の接続された生物学的プロセスのより現実的な表現を提供する24。

NPQは、単純なハンドヘルド装置27からより高度なクローズドシステム28まで、様々な市販のPAM蛍光光度計25、26を用いて測定することができる。しかし、これらのアプローチのいくつかの制限は、比較的低いスループットであり、複数のデバイスと研究者のチームなしで植物の大規模なコレクションをスクリーニングすることは困難です。この問題に対処するために、McAuslandらは、摘出した葉組織に基づく手順を開発し、それを使用して、2つの小麦品種間のクロロフィル蛍光の違いを同定した29。このアプローチの魅力は、単一の装置で複数の植物から採取されたイメージングリーフディスクが、1日以内に何百もの遺伝子型のスクリーニングを容易にすることができることです。これにより、ゲノムワイド関連研究の一環としてNPQ緩和の変動を評価したり、作物の光合成効率を高め、最終的に収量を増加させる可能性のある育種集団をスクリーニングしたりすることができます。

McAusland et al.29の知見に基づいて、我々はグリシンマックス(G.max;ダイズ)におけるNPQ緩和率のハイスループットスクリーニングのために、葉ディスクのPAMクロロフィル蛍光分析を使用する。このプロトコルは、一般的なFluorCam26などの他の市販のクローズドPAMシステムに匹敵するCFイメージャ25を使用します。サンプルを適応させるための暗い部屋で、ユーザーは96ウェルプレート、ペトリ皿、小さな植物を画像化できます。このアプローチの主な利点は、個々のプラントのシーケンシャル分析と比較して、リーフディスクを使用することによって得られるスループットの増加です。本明細書では、代表的な結果、および野外栽培植物におけるNPQのサンプリング、測定、および分析のための方法を提示する。

プロトコル

1. 種を植える

  1. 肥沃で水はけがよく、砂質の土壌ではなく、pHがほぼ6.5の畑のサイトを選択してください。1.2 mの列のプロットを0.75 mの間隔でマークし、鍬で地面を得点します。
  2. 土壌温度が25〜30°Cの間である成長期の初めに、各プロットに沿って3cmの深さで G.max cv. IA3023の50種子/ mを植える。
    注:遺伝的多様性をスクリーニングする目的で、複数の異なる遺伝子型が成長し、比較されることが期待される。植物は、遺伝子型あたり2〜5列をランダムブロック設計で配置する。土壌の種類、温度、日の長さなど、気候条件が大豆の成長に合っているかどうかを考慮する必要があります。

2. 畑から葉のサンプルを採取する

  1. 発芽後30日目に畑の植物をサンプリングする。
    注:30日後、大豆植物は栄養段階になります。発芽後サンプリングまでの日数は、対処されている生物学的問題に依存する。
  2. 24ウェルプレートのウェルを蒸留水で1 /3まで満たします。蓋とプレートの側面に、サンプリングする反復物のラベルを付けます。
  3. サンプリングする植物の上部にある最も若い完全に展開された葉を選択します。葉をゴム栓にかざします。
  4. #2フンボルトコルクボーラーを葉に押し込み、中肋骨を避けながら円盤を切るためにねじります。技術的な複製のために、同じリーフから 5 つのディスクを連続して収集します。各プロットについて、輸送中またはサンプリングによって葉組織が損傷した場合に必要以上に約30%多くの葉ディスクを採取する。
    注:生物学的複製(プロットまたは植物)の数および技術的複製数(同じ植物またはプロットからのリーフディスク)の数は、実験計画によって異なる場合があります。
  5. 綿棒を使用して、コルクボーラーからリーフディスクを24ウェルプレートの1つのウェルに押し込みます。すべてのリーフディスクが水に浮かんでいることを確認します。そうでない場合は、井戸の側面にくっついているリーフディスクを綿棒で浮遊位置に静かに動かします。
  6. 次のプロットに進み、手順2.3~2.5を繰り返します。綿棒を使用して、コルクボーラーからリーフディスクを24ウェルプレートの別のウェルに押し込みます。このステップを繰り返して、3 番目の生物学的複製を収集します。
  7. 完全な24ウェルプレートがサンプリングされるまで、ステップ2.6を繰り返します。蓋をし、半透明の柔軟なフィルムで密封します。プレートは直射日光の当たらない場所、バッグ、箱、または空のクーラー(氷なし)に保管してください。

3. 分析用サンプルの準備

  1. サンプリング後、清潔な実験室スペースに戻ります。密封プレートの蓋をタップすると、輸送中に蓋に貼り付けられたリーフディスクが外れます。フィルムをほどき、蓋を外します。
  2. リーフディスクを24ウェルプレートの最初の位置から新しい96ウェルプレートに移し、リーフディスクをウェルの底で平らに向けます。
  3. 鼻吸引フィルターを半分に切る。得られたフィルターを半分水に浸し、ペーパータオルを軽くたたいて余分な液体を取り除きます。湿度を維持するために、リーフディスクでフィルターを井戸に挿入します。
  4. 24ウェルプレートの最初の位置から2番目のリーフディスクを取り出し、96ウェルプレートの次に利用可能な位置に下向きに置きます。ステップ3.3で作成した鼻フィルターの残りの半分を水に浸し、ペーパータオルを軽く叩いてから、2番目のリーフディスクで井戸に挿入します。
  5. 24ウェルプレートの最初の位置から3番目のリーフディスクについて、ステップ3.3〜3.4を繰り返します。
  6. 24ウェルプレートの2番目の位置に移動し、ステップ3.3~3.5を繰り返します。
  7. すべてのウェルにリーフディスクと鼻アスピレーターフィルターが挿入されている場合は、プレートに蓋を置きます。右上隅にテープを貼って、暗闇の中でプレートの向きを合わせてイメージングできるようにします。
  8. 半透明の柔軟なフィルムでプレートをシールし、プレートをアルミ箔で包みます。アルミ箔にプロットIDとプレートIDを書き込みます。
  9. プレートを暗い箱またはキャビネットに最低30分間入れて、NPQの最初の2つの相(qE、qT、qZ)を緩和できるようにします。NPQの長期相が興味深い場合は、イメージングの前に1時間のより長く暗いインキュベーション期間を使用してください。
  10. 分析中に焦点を合わせるために追加のダミープレートを準備します。これを行うには、新しい96ウェルプレートの各コーナーにリーフディスクを置き、中央に1つを置きます。以前のプレートと同様に、鼻フィルターでリーフディスクを固定します。プレートを密封し、室温(24°C)、〜50%相対湿度の暗所でインキュベートする。

4. クロロフィル蛍光イメージャーを用いた非光化学消光の測定

  1. イメージャーの電源を入れ、イメージングソフトウェアを開きます。「 プロトコル>設定 」をクリックして、PAM 実験プロトコルのステップを入力するためのウィンドウを開きます。機械の技術仕様は、 補足表3に示されています。
  2. 飽和パルスで開始するようにプログラムを設定し、ボックスに20秒を入力することによって暗適応光合成の最大量子効率を測定します。 「パルスの適用」 ボックスをクリックし、「ボックスに「1:この回数」と入力します。
  3. パルスPPFDを6152に設定し、パルス長を800ミリ秒に設定し、 すべてのパルスでF'&Fm'画像を撮影するボックスにチェックを入れます。「 後に挿入 」をクリックして、プロトコルに 2 番目のステップを追加します。
  4. ボックスに「30 秒」と入力します: の遅延の後。[ 活性成分の変更] オプションを選択し、[50]ボックスに「Actinic PPFD」と入力して、チャンバ内の光強度を50 PPFDに設定します。
  5. 「 後に挿入 」をクリックして、プロトコルに新しいステップを追加します。ボックスに150秒と入力:遅延後、「パルスを適用」を選択し、「ボックスに4」と入力します:この回数は、活性光が50 PPFDに保持されている間、150秒ごとに測定 パルスを 連続して4倍に印加します。
  6. プロトコルの完全な情報は 表1に示されており、ステップ4.2および4.3を使用して光強度を変更し、ステップ4.4および4.5を使用して飽和パルスのサイクルを入力します。 表 1 に示す値に従って、各ステップの遅延と光強度を調整します。プロトコルを .pcl ファイルとして既知の場所に保存します。
  7. ライトを消し、ダミープレートをサンプルステージの上に置き、リーフディスクが器具のベースから140mm上になるようにサンプルステージの高さを設定します。ダミープレートは、焦点を合わせるときに光がプレートに繰り返し点滅するために使用されます。これは、測定されるサンプルの再暗適応を必要とし、光損傷を引き起こす可能性があります。
  8. イメージャーカメラとハードウェアカメラへの接続/切断アイコンをクリックして、カメラを起動します。フォーカス (蛍光) シンボルをクリックして、ベースに 2 本の緑色の線が付いた赤色の両面矢印アイコンで表されます。レンズと露出を調整して、プレートに焦点を合わせます。
  9. フォーカス(蛍光)アイコンをもう一度クリックして、点滅するライトをオフにします。暗闇の中で作業する場合は、ダミー プレートを分析対象のプレートと交換します。
  10. [ マップ イメージ カメラ] アイコンをクリックします。ポップアップウィンドウのバーがグリーンゾーンに配置されるまで絞りを開閉して、画像の露出を調整します。
  11. 絞りを調整するたびに、露出が正しく調整され、機器が画像を撮影するまで、 再試行 ボタンをクリックします。画像を右クリックし、「画像 分離を適用」 を選択して背景信号をブロックします。焦点が合ったリーフ領域は灰色で、背景は青で表示されます。
  12. 画像を右クリックして、画像の変更プルダウンメニューからヒストグラムとガンマレベルを調整して、リーフディスクのみを含める領域/ピクセルを選択します。
  13. 画像を右クリックし、[ ハイカットとローカットの削除(カラーマップ) ]を選択して、水色の強調表示された領域を削除します。画像を右クリックし、「 ストレイを削除(重) 」を選択して、少なくとも他の3つのピクセルに触れていないピクセルを削除します。
    注: 孤立した島として表示される画像上の領域は、個別に分析され、最終的なデータ出力に含まれます。画像の分離と浮遊ピクセルの除去により、クリーンでわかりやすいデータが得られます。
  14. [ プロトコルの実行] アイコンをクリックしてプログラムを起動すると、プロトコルの実行時間が残っていることを通知するタイマーが画面の下部に表示されます。
  15. プロトコルが終了するまで待ち、[ファイル] > [ 名前を付けて保存] をクリックし、データを .igr ファイルとして保存します。ウィンドウの右上にある赤い十字をクリックしてウィンドウを閉じてから、別のサンプルプレートの実行を開始します。
  16. [ファイル] > [新規] を選択して次のサンプル 用に新しいファイル を開き、すべてのプレートが測定されるまで手順 4.10 ~ 4.15 を繰り返します。
    注:概日調節が結果に与える潜在的な影響を最小限に抑えるために、4時間以内の期間内にプレートを測定することをお勧めします。

5. クロロフィル蛍光データの処理

  1. イメージングソフトウェアで.igrファイルを開きます。[ ファイル] > [フォルダーにエクスポート] をクリックしてデータをエクスポートし、必要なすべてのファイルを含む新しいフォルダーを作成します。
  2. MapAndLabelDiscs.m (補足ファイル 1)、ProcessFoFm.m (補足ファイル 2)、および ProcessNPQdata.m (補足ファイル 3) の 3 つの MATLAB ファイルを結果のフォルダーにコピーし、R ファイル: create_file_to_process。R(補足ファイル4)。
  3. MATLAB で MapAndLabelDiscs.m (Supplementary File 1) を開き、実行します。ポップアップ ウィンドウで生成された番号付きリーフ ディスクのマップを.pngファイルとして保存し、後でリーフ ディスクの番号付けを確認します。
  4. MATLAB でファイル ProcessFoFm.m (補足ファイル 2) を開き、実行して各リーフ ディスクの Fo 値と Fm 値を計算します。プロセスNPQdata.m (補足ファイル 3) を実行して、各時点での NPQ 値を計算します。
  5. create_file_to_processファイルを開きます。Rstudio の R (補足ファイル 4) をクリックし、5 行目のコードに日付を追加します。プレート番号を create_file_to_process.R の 8 行目に追加します。
  6. create_file_to_processを実行します。R は、 Fv/Fm 値と NPQ データを、接尾部 -cf-summary.csv を持つデータにちなんで名付けられた 1 つのファイルに統合します。手順 5.3 の .png ファイルを使用して、手順 5.5 の cf-summary ファイル内のリーフディスク番号を確認します。プロット番号とアクセッションに関するアドイン情報。
  7. R スクリプト CF-data-processing_2.R (補足ファイル 5) を開き、13 行目を作業ディレクトリー・パスに変更します。CF-data-processing_2.R の 16 行目を、ステップ 5.5 のファイルの名前に変更します。
  8. CF-data-processing_2.R の 48 行目を出力ファイルの名前に変更します。スクリプト CF-data-processing_2.R を実行して、カーブフィッティング用にデータを再フォーマットします。
  9. MATLAB でスクリプト MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (補足ファイル 6) を開き、5 行目をステップ 5.8 の出力ファイルの名前に変更します。MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m の 85 行目を新しい出力ファイル名に変更します。スクリプト MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m を実行して、NPQ 緩和パラメーターを計算します。

結果

図1Aは、畑で栽培された大豆におけるNPQの典型的な測定値を示しています。2021年夏にイリノイ州アーバナ(緯度40.084604°、経度-88.227952°)で植物を栽培し、6月5日に種子を植えました。種子を植え付けてから30日後にリーフディスクをサンプリングし、提供されたプロトコルで測定を行った(表1)。Fv/FmおよびNPQ値は各リーフディスクについて計算さ?...

ディスカッション

リーフディスクの慎重な選択と取り扱いは、NPQの信頼性の高い測定値を得るために重要です。第一に、ピンセットによる粗い取り扱いなどの組織への損傷は、ストレスをもたらし、光合成の最大量子効率のための低い値をもたらす。非ストレス植物は、典型的には、約0.8318のFv/Fm値を有し、有意な低下は光合成性能の低下を示す9

開示事項

著者らは利益相反を報告していない

謝辞

この研究は、Bill & Melinda Gates Foundation、Foundation for Food and Agriculture Research、および英国外国、連邦および開発局が助成金番号OPP1172157で資金提供している研究プロジェクトRealize Increasing Photosynthetic Efficiency(RIPE)によって支援されています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
24 well tissue culture plateFisher ScientificFB012929Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plateFisher ScientificFB012931Country of Origin: United States of America
Aluminum foilAntylia Scientific 61018-56Country of Origin: United States of America
Black marker penSharpieSAN30001Country of Origin: United States of America
CF imagerTechnologica Ltd.N/Achlorophyll fluorescence imager
Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mmHumboldt Mfg CoH9665Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 SoftwareTechnologica Ltd.N/Aimaging software
Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene FiltersAmazon B07P6XCTGVCountry of Origin: United States of America
Marker stakesJohn Henry CompanyKN0151Country of Origin: United States of America
Paper scissorsVWR82027-596Country of Origin: United States of America
ParafilmBemis Company Inc. S3-594-6Semi -transparent flexible film
Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppersFisher Scientific14-130MCountry of Origin: United States of America

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