A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يصف البروتوكول الحالي فحصا لتقييم القدرة على أكسدة الأحماض الدهنية في مزارع خلايا العظام الأولية أو خطوط الخلايا ذات الصلة.
من المتوقع أن يتطلب تكوين العظام عن طريق التفريق بين بانيات العظم مدخلات نشطة كبيرة حيث يجب أن تقوم هذه الخلايا المتخصصة بتصنيع بروتينات مصفوفة كبيرة خارج الخلية تتكون منها أنسجة العظام ثم تركز الأيونات اللازمة لتمعدنها. تظهر البيانات المتعلقة بمتطلبات التمثيل الغذائي لتكوين العظام بسرعة. بينما لا يزال هناك الكثير مما يجب تعلمه ، من المتوقع أن تساهم الاضطرابات في التمثيل الغذائي الوسيط في الإصابة بأمراض الهيكل العظمي. هنا ، تم تحديد بروتوكول لتقييم قدرة الخلايا العظمية على أكسدة 14من الأحماض الدهنية المسمى C إلى 14ثاني أكسيد الكربون2 والمستقلبات القابلة للذوبان في الأحماض. تمثل الأحماض الدهنية احتياطيا غنيا بالطاقة يمكن امتصاصه من الدورة الدموية بعد التغذية أو بعد تحريرها من مخازن الأنسجة الدهنية. يعد الفحص ، الذي يتم إجراؤه في قوارير زراعة الأنسجة T-25 ، مفيدا لدراسة اكتساب الجينات أو فقدان الوظيفة على استخدام الأحماض الدهنية وتأثير الإشارات الابتنائية في شكل عوامل نمو أو مورفوجينات ضرورية للحفاظ على كتلة العظام. كما يتم توفير تفاصيل حول القدرة على تكييف البروتوكول لتقييم أكسدة الجلوكوز أو الأحماض الأمينية مثل الجلوتامين.
بانيات العظم ، المشتقة من الخلايا السلفية الموجودة في نخاع العظام والسمحاق ، مسؤولة عن تصنيع وإفراز المصفوفة المعدنية الغنية بالكولاجين التي تتكون منها أنسجة العظام. لتحقيق هذا المسعى المكلف للغاية والمساهمة في الحفاظ على سلامة الهيكل العظمي مدى الحياة ، تحافظ هذه الخلايا المتخصصة على شبكة إندوبلازمية خشنة وفيرة ضرورية لتصنيع بروتينات المصفوفة خارج الخلية1،2 والعديد من الميتوكوندريا عالية الإمكانات الغشائية لحصاد الطاقة الكيميائية المطلوبة من ركائز الوقود3،4. تتجلى أهمية هذه الوظيفة الأخيرة من خلال توقف نمو العظام وتطور هشاشة العظام5،6 المرتبطة بنقص الطاقة كما هو الحال في تقييد السعرات الحرارية. تظهر هوية مصدر الوقود المفضل لبانيات العظم والبيانات المتعلقة بالمتطلبات الأيضية لبانيات العظم أثناء التمايز أو استجابة للإشارات الابتنائية7،8.
تمثل الأحماض الدهنية طويلة السلسلة إمدادا غنيا بالطاقة الكيميائية الموجودة في المصل ويتم إطلاقها من الأنسجة الدهنية استجابة لانخفاض السعرات الحرارية أو زيادة إنفاق الطاقة. بعد اجتياز غشاء الخلية والارتباط بالإنزيم المساعد A لزيادة الذوبان ، يتم نقل أسيل CoAs الدهني إلى مصفوفة الميتوكوندريا بواسطة إنزيمات بالميتويل ترانسفيراز المزدوجة الكارنيتين على أغشية الميتوكوندريا الخارجية والداخلية وترانسلوكاز الكارنيتين أسيلكارنيتين 7. ضمن مصفوفة الميتوكوندريا ، تعمل سلسلة آلات الأكسدة β على تقصير acyl-CoA في عملية من 4 خطوات تولد أسيتيل CoA التي تدخل دورة TCA (دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل) وتقليل المكافئات. تقويض البالميتات (C16) ، الأحماض الدهنية الأكثر شيوعا في ، عبر هذا المسار ينتج ~ 131 ATP ، أكثر بكثير من ~ 38 ATP الناتج عن أكسدة الجلوكوز7.
أشارت دراسات التتبع باستخدام الدهون ذات العلامات المشعة إلى أن العظام تشغل جزءا كبيرا من الدهون المنتشرة9،10 ، في حين أن الاستئصال الجيني للإنزيمات الحاسمة لتقويض الدهون يؤدي إلى انخفاض نشاط بانيات العظم وفقدان العظام9،11. يستخدم البروتوكول المقدم هنا 14حمضا دهنيا يحمل علامة C لتقييم قدرة بانيات العظم المستنبتة على استقلاب الأحماض الدهنية بالكامل إلى ثاني أكسيد الكربون2 أو المستقلبات القابلة للذوبان في الأحماض ، والتي تمثل خطوات وسيطة في عملية الأكسدة. في حين أن استخدام النشاط الإشعاعي مطلوب ، فإن الطريقة واضحة وتتطلب استثمارا محدودا وقابلة للتكيف لصالح المستقلبات وأنواع الخلايا الأخرى ذات العلامات الراديوية.
يستخدم هذا البروتوكول تحويل [1-14درجة مئوية] - حمض الأوليك إلى 14ثاني أكسيدالكربون 2 كمؤشر على قدرة أكسدة الأحماض الدهنية. وافق مكتب السلامة الإشعاعية المحلي على بروتوكول استخدام المواد المشعة قبل بدء التجارب. تم إجراء جميع الإجراءات الإشعاعية خلف درع زجاجي باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. وافقت اللجنة المحلية لرعاية واستخدامها على البروتوكول قبل استخدام الخلايا الأولية.
1. أكسدة الأحماض الدهنية في بانيات العظم المستنبتة
2. جمع المستقلب القابل للذوبان في الحمض
ملاحظة: قد لا تكون فترة الحضانة التي تبلغ 3 ساعات المستخدمة في الخطوة 1.8 أعلاه وقتا كافيا لأكسدة كل حمض الأوليك الكامل [1-14درجة مئوية] الذي تمتصه الخلايا إلى ثاني أكسيد الكربون2. يمكن أيضا تقييم التدفق في مسار أكسدة الأحماض الدهنية عن طريق قياس النشاط الإشعاعي في الجزء القابل للذوبان في الحمض.
3. قياس أكسدة الجلوكوز أو أكسدة الأحماض الأمينية
النشاط الأنزيمي لكل من كارنيتين بالميتويل ترانسفيراز -1 (Cpt1) والكارنيتين بالميتويل ترانسفيراز -2 (Cpt2) مطلوب لأكسدة الأحماض الدهنية طويلة السلسلة في الميتوكوندريا. Cpt1 هو الإنزيم المحدد للمعدل في المسار الأيضي ، ولكن يتم ترميز ثلاثة أشكال إسوية (Cpt-1a و Cpt-1b و Cpt-1c) في جينومات ا?...
يسمح الإجراء الموصوف أعلاه بالتقييم المباشر لأكسدة الأحماض الدهنية حيث أن المخرجات المقاسة هي 14ثاني أكسيد الكربون2 تم جمعها على ورق الترشيح المنقوع بهيدروكسيد الصوديوم والمستقلبات القابلة للذوبان في الأحماض التي تم جمعها بعد تحمض الثقافة بحمض البيركلوريك...
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.
تم دعم هذا العمل من خلال جائزة مراجعة الجدارة من خدمة البحث والتطوير في المختبرات الطبية الحيوية التابعة لمكتب البحث والتطوير لشؤون المحاربين القدامى (BX003724) ومنحة من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (DK099134).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
[1-14C]-Oleic acid | Perkin Elmer | NEC317050UC | |
15 x 30 mm rubber sleeve stoppers | VWR | 89097-542 | |
1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
25 G needle (25 G x 1 1/2 in) | BD precision | 305127 | |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | Other kits are also suitable |
Beckman Scintillation Counter, or equivalent | Beckman Coulter | LS6000SC | |
Beta-glycerol phosphate | Sigma Aldrich | G6626 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 126609 | |
Carnitine | Sigma Aldrich | C0283 | |
Cellular lysis buffer | The protocol is amenable to typical lysis buffers (i.e. RIPA) | ||
Dissecting forceps | Available from multiple sources | ||
DNA quantification Kit | Available from multiple sources | ||
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Corning | 20-030-CV | |
Fetal Bovine Serum | Available from multiple sources | ||
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Available from multiple sources | ||
Minimum Essensial Medium, Alpha modification | Corning | 10-022-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Perchloric Acid | Sigma Aldrich | 50439 | |
Polypropylene center wells | VWR | 72760-048 | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
T-25 canted neck tissue culture flask | Corning | 430639 | |
Tissue Culture Incubator | |||
Trypsin (0.25%)-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
Whatman Chromatography paper | Sigma Aldrich | WHA3030917 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved