تقييم أكسدة الأحماض الدهنية في خلايا العظام المستنبتة

Summary

يصف البروتوكول الحالي فحصا لتقييم القدرة على أكسدة الأحماض الدهنية في مزارع خلايا العظام الأولية أو خطوط الخلايا ذات الصلة.

Abstract

من المتوقع أن يتطلب تكوين العظام عن طريق التفريق بين بانيات العظم مدخلات نشطة كبيرة حيث يجب أن تقوم هذه الخلايا المتخصصة بتصنيع بروتينات مصفوفة كبيرة خارج الخلية تتكون منها أنسجة العظام ثم تركز الأيونات اللازمة لتمعدنها. تظهر البيانات المتعلقة بمتطلبات التمثيل الغذائي لتكوين العظام بسرعة. بينما لا يزال هناك الكثير مما يجب تعلمه ، من المتوقع أن تساهم الاضطرابات في التمثيل الغذائي الوسيط في الإصابة بأمراض الهيكل العظمي. هنا ، تم تحديد بروتوكول لتقييم قدرة الخلايا العظمية على أكسدة ¹⁴من الأحماض الدهنية المسمى C إلى ¹⁴ثاني أكسيد الكربون₂ والمستقلبات القابلة للذوبان في الأحماض. تمثل الأحماض الدهنية احتياطيا غنيا بالطاقة يمكن امتصاصه من الدورة الدموية بعد التغذية أو بعد تحريرها من مخازن الأنسجة الدهنية. يعد الفحص ، الذي يتم إجراؤه في قوارير زراعة الأنسجة T-25 ، مفيدا لدراسة اكتساب الجينات أو فقدان الوظيفة على استخدام الأحماض الدهنية وتأثير الإشارات الابتنائية في شكل عوامل نمو أو مورفوجينات ضرورية للحفاظ على كتلة العظام. كما يتم توفير تفاصيل حول القدرة على تكييف البروتوكول لتقييم أكسدة الجلوكوز أو الأحماض الأمينية مثل الجلوتامين.

Introduction

بانيات العظم ، المشتقة من الخلايا السلفية الموجودة في نخاع العظام والسمحاق ، مسؤولة عن تصنيع وإفراز المصفوفة المعدنية الغنية بالكولاجين التي تتكون منها أنسجة العظام. لتحقيق هذا المسعى المكلف للغاية والمساهمة في الحفاظ على سلامة الهيكل العظمي مدى الحياة ، تحافظ هذه الخلايا المتخصصة على شبكة إندوبلازمية خشنة وفيرة ضرورية لتصنيع بروتينات المصفوفة خارج الخلية^1،2 والعديد من الميتوكوندريا عالية الإمكانات الغشائية لحصاد الطاقة الكيميائية المطلوبة من ركائز الوقود^3،4. تتجلى أهمية هذه الوظيفة الأخيرة من خلال توقف نمو العظام وتطور هشاشة العظام^5،6 المرتبطة بنقص الطاقة كما هو الحال في تقييد السعرات الحرارية. تظهر هوية مصدر الوقود المفضل لبانيات العظم والبيانات المتعلقة بالمتطلبات الأيضية لبانيات العظم أثناء التمايز أو استجابة للإشارات الابتنائية^7،8.

تمثل الأحماض الدهنية طويلة السلسلة إمدادا غنيا بالطاقة الكيميائية الموجودة في المصل ويتم إطلاقها من الأنسجة الدهنية استجابة لانخفاض السعرات الحرارية أو زيادة إنفاق الطاقة. بعد اجتياز غشاء الخلية والارتباط بالإنزيم المساعد A لزيادة الذوبان ، يتم نقل أسيل CoAs الدهني إلى مصفوفة الميتوكوندريا بواسطة إنزيمات بالميتويل ترانسفيراز المزدوجة الكارنيتين على أغشية الميتوكوندريا الخارجية والداخلية وترانسلوكاز الكارنيتين أسيل^{كارنيتين 7}. ضمن مصفوفة الميتوكوندريا ، تعمل سلسلة آلات الأكسدة β على تقصير acyl-CoA في عملية من 4 خطوات تولد أسيتيل CoA التي تدخل دورة TCA (دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل) وتقليل المكافئات. تقويض البالميتات (C₁₆) ، الأحماض الدهنية الأكثر شيوعا في ، عبر هذا المسار ينتج ~ 131 ATP ، أكثر بكثير من ~ 38 ATP الناتج عن أكسدة الجلوكوز⁷.

أشارت دراسات التتبع باستخدام الدهون ذات العلامات المشعة إلى أن العظام تشغل جزءا كبيرا من الدهون المنتشرة^9،10 ، في حين أن الاستئصال الجيني للإنزيمات الحاسمة لتقويض الدهون يؤدي إلى انخفاض نشاط بانيات العظم وفقدان العظام^9،11. يستخدم البروتوكول المقدم هنا ¹⁴حمضا دهنيا يحمل علامة C لتقييم قدرة بانيات العظم المستنبتة على استقلاب الأحماض الدهنية بالكامل إلى ثاني أكسيد الكربون₂ أو المستقلبات القابلة للذوبان في الأحماض ، والتي تمثل خطوات وسيطة في عملية الأكسدة. في حين أن استخدام النشاط الإشعاعي مطلوب ، فإن الطريقة واضحة وتتطلب استثمارا محدودا وقابلة للتكيف لصالح المستقلبات وأنواع الخلايا الأخرى ذات العلامات الراديوية.

Protocol

يستخدم هذا البروتوكول تحويل [^1-14درجة مئوية] - حمض الأوليك إلى ¹⁴ثاني أكسيد_{الكربون 2} كمؤشر على قدرة أكسدة الأحماض الدهنية. وافق مكتب السلامة الإشعاعية المحلي على بروتوكول استخدام المواد المشعة قبل بدء التجارب. تم إجراء جميع الإجراءات الإشعاعية خلف درع زجاجي باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. وافقت اللجنة المحلية لرعاية واستخدامها على البروتوكول قبل استخدام الخلايا الأولية.

1. أكسدة الأحماض الدهنية في بانيات العظم المستنبتة

1. الزراعة الفرعية لبانيات العظم الجلجلية الأولية¹² أو خط الخلايا العظمية مثل Mc3t3-E1 ، والصفيحة في قوارير T-25 (5 × 10⁵ خلايا / قارورة) في α-MEM تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 0.1 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.
   1. بذور 3-4 قوارير لكل مجموعة علاجية (أي التحكم والضربة القاضية الجينية أو العلاج الآلي والدوائي للمركبة) لاستخدامها في التجربة. قم بزرع 1-2 قوارير إضافية لكل مجموعة معالجة لتطبيع عدد الخلايا أو تركيزات البروتين. احتضان قوارير الاستزراع في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. استزراع الخلايا لمدة 2-3 أيام حتى تتماسك القوارير. حث المزارع المتقاربة على التمايز عن طريق إضافة 50 ميكروغرام / مل من حمض الأسكوربيك و 10 ملي مولار من فوسفات β جلسرين (انظر جدول المواد) إلى وسط الاستزراع واستمر في الاستزراع لمدة تصل إلى 14 يوما إضافيا.
   ملاحظة: تجويع المصل (إضافة 0.5٪ -1٪ FBS) بين عشية وضحاها ضروري إذا تم التخطيط لعلاجات عامل النمو. يؤدي خفض النسبة المئوية ل FBS إلى الحد من كمية الدهون غير الملصقة بالإشعاع في المزرعة ويسمح بالتأثير الأقصى لعوامل النمو الخارجية. إذا كان سيتم اختبار تأثيرات الهرمونات ، يتم استخدام FBS المجردة من الفحم.
3. قم بإعداد ورق الترشيح ، وسدادات الأكمام المطاطية مقاس 15 مم × 30 مم ، والآبار المركزية المصنوعة من مادة البولي بروبلين (انظر جدول المواد) في اليوم السابق للتجربة.
   1. قم بطي شريط من ورق الترشيح مقاس 1 سم × 10 سم على شكل مروحة وضعه في دلو مركز البولي بروبلين جيدا. اضغط على ذراع مركز البولي بروبلين جيدا من خلال مركز سدادة الأكمام المطاطية وقم بخفض مركز البولي بروبلين جيدا في قارورة T-25. ثم أغلق القارورة بسدادة الأكمام (الشكل 1).
      ملاحظة: قد يكون من الضروري ضبط موضع مركز البولي بروبلين جيدا للتأكد من أنه لا يتلامس مع وسط الزيادة. أثناء التجربة ، يمنع مركز البولي بروبلين جيدا ورق الترشيح من لمس وسط الملصقات ويسمح بجمع ¹⁴ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
4. في يوم التجربة ، اقتران [^1-14درجة مئوية] - حمض الأوليك مع ألبومين مصل الأبقار (BSA) عن طريق خلط 20٪ من ألبومين مصل الأبقار في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (5 ميكرولتر لكل قارورة) مع 0.1 ميكروCi / مل من [^1-14درجة مئوية] - حمض الأوليك (0.6 ميكرولتر / قارورة) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
   1. ثم ضع الأنبوب في أنبوب مخروطي سعة 50 مل واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع رج لطيف. قم بإعداد 1-2 قوارير إضافية لاقترانات حمض الأوليك - BSA لحساب خطأ سحب العينات.
5. قم بإزالة وسط المزرعة من قارورة زراعة الأنسجة واستبدله ب 1.5 مل من وسائط تجويع المصل الطازجة (الخطوة 1.2).
6. لكل قارورة ، امزج 5.6 ميكرولتر من محلول حمض الأوليك BSA (الخطوة 1.4) مع 2 ميكرولتر من محلول كارنيتين 100 ملي مولار و 1 مل من وسائط الاستزراع لإنتاج محلول وضع العلامات. أضف محلول الملصقات إلى قوارير الثقافة. احتفظ بالمحلول الزائد لقراءة الأعداد الإجمالية للنشاط المضاف إلى المقايس.
   ملاحظة: لا يتم إضافة محلول الملصقات إلى القوارير الإضافية التي تهدف إلى تحديد عدد الخلايا أو تركيز البروتين.
7. اخفض الآبار المركزية المصنوعة من مادة البولي بروبلين التي تحتوي على ورق الترشيح في القارورة ثم قم بتغطيتها بسدادة مطاطية.
   ملاحظة: من الأهمية بمكان ألا يتصل مركز البولي بروبلين بوسط الاستزراع. سيؤدي ذلك إلى تلوث ورق الترشيح بالأحماض الدهنية ذات العلامات الإشعاعية بدلا من ثاني أكسيد الكربون₂.
8. احتضان مزارع الخلايا لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
9. لجمع ¹⁴ثاني أكسيد_{الكربون 2} ، قم بحقن 150 ميكرولتر من 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم في مركز البولي بروبلين جيدا لترطيب ورق الترشيح و 200 ميكرولتر من حمض البركلوريك 1 متر في وسط الاستزراع. حقن هيدروكسيد الصوديوم وحمض البركلوريك عن طريق دفع إبرة عبر السدادة المطاطية.
   ملاحظة: لا ينبغي إزالة السدادة المطاطية من القارورة. قد يتسبب هذا في هروب ¹⁴ثاني أكسيد الكربون. لسهولة الحقن ، احتفظ بالقارورة في وضع مستقيم ثم عد إلى وضع المزرعة بعد اكتمال الحقن.
10. احتضان القوارير عند 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
11. افتح القوارير بعد تبريدها في غطاء مزرعة الخلية. قم بإزالة أوراق الترشيح من الآبار المركزية للبولي بروبلين بالملاقط وضعها في 3-4 مل من سائل التلألؤ (انظر جدول المواد) في قارورة التلألؤ.
    ملاحظة: يضاف 100 ميكرولتر من محلول الملصقات الزائد إلى 3-4 مل من سائل التلألؤ لقياس إجمالي عدد النشاط. يضاف 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع القاعدي (بدون [^1-14درجة مئوية] - حمض الأوليك) إلى 3-4 مل من سائل التلألؤ لقياس نشاط الخلفية.
12. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة أو بين عشية وضحاها ، قم بقياس النشاط الإشعاعي بالعدد في الدقيقة (النسخة الواحدة في الدقيقة) باستخدام عداد التلألؤ (انظر جدول المواد).
13. لتطبيع نتائج التكلفة لكل ألف ظهور ، قم بعزل مستخلصات البروتين من قوارير T-25 غير المسماة لكل حالة مزرعة. اغسل بمحلول ملحي مخزن بفوسفات سعة 5 مل ، وأضف 1 مل من محلول تحلل الخلايا RIPA إلى كل قارورة ، واكشط سطح الخلية باستخدام مكشطة الخلية.
    1. انقل المخزن المؤقت RIPA إلى أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام ماصة وجهاز طرد مركزي عند 19,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية باستخدام ماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وحدد تركيز البروتين وفقا لبروتوكول فحص BCA (انظر جدول المواد).
    2. اقسم قراءات النسخة المتكررة في الدقيقة الخام من عداد التلألؤ على تركيز البروتين للحصول على النسخة الطبيعية من ¹⁴ثاني أكسيد الكربون_المنتج (الجدول 1).
14. اتبع المتطلبات المحلية للتخلص من قوارير التلألؤ ، ومواد زراعة الخلايا ، والوسط ، والمحاقن ، وما إلى ذلك. تطهير أسطح العمل وإجراء اختبارات مسح النشاط الإشعاعي وفقا للمتطلبات المحلية.

2. جمع المستقلب القابل للذوبان في الحمض

ملاحظة: قد لا تكون فترة الحضانة التي تبلغ 3 ساعات المستخدمة في الخطوة 1.8 أعلاه وقتا كافيا لأكسدة كل حمض الأوليك الكامل [^1-14درجة مئوية] الذي تمتصه الخلايا إلى ثاني أكسيد الكربون₂. يمكن أيضا تقييم التدفق في مسار أكسدة الأحماض الدهنية عن طريق قياس النشاط الإشعاعي في الجزء القابل للذوبان في الحمض.

1. اجمع 1 مل من الوسائط المحمضة من كل قارورة T-25 معالجة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
2. أضف 60 ميكرولتر من 20٪ BSA و 100 ميكرولتر من حمض البيركلوريك 16 م.
3. دوامة وتحتضن بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
4. بعد ذلك ، الدوامة وأجهزة الطرد المركزي عند 20,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
5. أضف 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى سائل التلألؤ وقم بقياس النشاط (الخطوة 1.12).
6. تطبيع القراءات لتركيز البروتين أو قياسات الحمض النووي (الخطوة 1.13.1).

3. قياس أكسدة الجلوكوز أو أكسدة الأحماض الأمينية

1. استبدل ¹⁴حمض الأوليك المسمى C ب ¹⁴من الأحماض الأمينية المسمى C أو ¹⁴من الأحماض الأمينية المسمى C لقياس أكسدة جزيئات الوقود هذه.
2. تحضير مزارع بانيات العظم وفقا للخطوات 1.1-1.2.
3. لبدء التجربة ، قم بإزالة وسط المزرعة من قارورة زراعة الأنسجة واستبدله ب 1.5 مل من وسائط تجويع المصل الطازجة.
4. قم بإعداد محلول وضع العلامات على 0.6 ميكروCi من ¹⁴جلوكوز مسمى C أو ¹⁴من الأحماض الأمينية المسمى C في 1 مل من وسائط الجوع وأضفها إلى القوارير.
5. قم بتنفيذ الخطوات 1.6-1.13.

النتائج

النشاط الأنزيمي لكل من كارنيتين بالميتويل ترانسفيراز -1 (Cpt1) والكارنيتين بالميتويل ترانسفيراز -2 (Cpt2) مطلوب لأكسدة الأحماض الدهنية طويلة السلسلة في الميتوكوندريا. Cpt1 هو الإنزيم المحدد للمعدل في المسار الأيضي ، ولكن يتم ترميز ثلاثة أشكال إسوية (Cpt-1a و Cpt-1b و Cpt-1c) في جينومات ا?...

Discussion

يسمح الإجراء الموصوف أعلاه بالتقييم المباشر لأكسدة الأحماض الدهنية حيث أن المخرجات المقاسة هي ¹⁴ثاني أكسيد الكربون₂ تم جمعها على ورق الترشيح المنقوع بهيدروكسيد الصوديوم والمستقلبات القابلة للذوبان في الأحماض التي تم جمعها بعد تحمض الثقافة بحمض البيركلوريك...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
[1-14C]-Oleic acid	Perkin Elmer	NEC317050UC
15 x 30 mm rubber sleeve stoppers	VWR	89097-542
1 mL syringe	BD precision	309628
25 G needle (25 G x 1 1/2 in)	BD precision	305127
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A4403
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225	Other kits are also suitable
Beckman Scintillation Counter, or equivalent	Beckman Coulter	LS6000SC
Beta-glycerol phosphate	Sigma Aldrich	G6626
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	126609
Carnitine	Sigma Aldrich	C0283
Cellular lysis buffer			The protocol is amenable to typical lysis buffers (i.e. RIPA)
Dissecting forceps			Available from multiple sources
DNA quantification Kit			Available from multiple sources
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Corning	20-030-CV
Fetal Bovine Serum			Available from multiple sources
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL			Available from multiple sources
Minimum Essensial Medium, Alpha modification	Corning	10-022-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Perchloric Acid	Sigma Aldrich	50439
Polypropylene center wells	VWR	72760-048
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S5881
T-25 canted neck tissue culture flask	Corning	430639
Tissue Culture Incubator
Trypsin (0.25%)-EDTA	Gibco	25200056
Ultima Gold (Scintillation solution)	PerkinElmer	6013329
Whatman Chromatography paper	Sigma Aldrich	WHA3030917