JoVE Logo

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي فحصا لتقييم القدرة على أكسدة الأحماض الدهنية في مزارع خلايا العظام الأولية أو خطوط الخلايا ذات الصلة.

Abstract

من المتوقع أن يتطلب تكوين العظام عن طريق التفريق بين بانيات العظم مدخلات نشطة كبيرة حيث يجب أن تقوم هذه الخلايا المتخصصة بتصنيع بروتينات مصفوفة كبيرة خارج الخلية تتكون منها أنسجة العظام ثم تركز الأيونات اللازمة لتمعدنها. تظهر البيانات المتعلقة بمتطلبات التمثيل الغذائي لتكوين العظام بسرعة. بينما لا يزال هناك الكثير مما يجب تعلمه ، من المتوقع أن تساهم الاضطرابات في التمثيل الغذائي الوسيط في الإصابة بأمراض الهيكل العظمي. هنا ، تم تحديد بروتوكول لتقييم قدرة الخلايا العظمية على أكسدة 14من الأحماض الدهنية المسمى C إلى 14ثاني أكسيد الكربون2 والمستقلبات القابلة للذوبان في الأحماض. تمثل الأحماض الدهنية احتياطيا غنيا بالطاقة يمكن امتصاصه من الدورة الدموية بعد التغذية أو بعد تحريرها من مخازن الأنسجة الدهنية. يعد الفحص ، الذي يتم إجراؤه في قوارير زراعة الأنسجة T-25 ، مفيدا لدراسة اكتساب الجينات أو فقدان الوظيفة على استخدام الأحماض الدهنية وتأثير الإشارات الابتنائية في شكل عوامل نمو أو مورفوجينات ضرورية للحفاظ على كتلة العظام. كما يتم توفير تفاصيل حول القدرة على تكييف البروتوكول لتقييم أكسدة الجلوكوز أو الأحماض الأمينية مثل الجلوتامين.

Introduction

بانيات العظم ، المشتقة من الخلايا السلفية الموجودة في نخاع العظام والسمحاق ، مسؤولة عن تصنيع وإفراز المصفوفة المعدنية الغنية بالكولاجين التي تتكون منها أنسجة العظام. لتحقيق هذا المسعى المكلف للغاية والمساهمة في الحفاظ على سلامة الهيكل العظمي مدى الحياة ، تحافظ هذه الخلايا المتخصصة على شبكة إندوبلازمية خشنة وفيرة ضرورية لتصنيع بروتينات المصفوفة خارج الخلية1،2 والعديد من الميتوكوندريا عالية الإمكانات الغشائية لحصاد الطاقة الكيميائية المطلوبة من ركائز الوقود3،4. تتجلى أهمية هذه الوظيفة الأخيرة من خلال توقف نمو العظام وتطور هشاشة العظام5،6 المرتبطة بنقص الطاقة كما هو الحال في تقييد السعرات الحرارية. تظهر هوية مصدر الوقود المفضل لبانيات العظم والبيانات المتعلقة بالمتطلبات الأيضية لبانيات العظم أثناء التمايز أو استجابة للإشارات الابتنائية7،8.

تمثل الأحماض الدهنية طويلة السلسلة إمدادا غنيا بالطاقة الكيميائية الموجودة في المصل ويتم إطلاقها من الأنسجة الدهنية استجابة لانخفاض السعرات الحرارية أو زيادة إنفاق الطاقة. بعد اجتياز غشاء الخلية والارتباط بالإنزيم المساعد A لزيادة الذوبان ، يتم نقل أسيل CoAs الدهني إلى مصفوفة الميتوكوندريا بواسطة إنزيمات بالميتويل ترانسفيراز المزدوجة الكارنيتين على أغشية الميتوكوندريا الخارجية والداخلية وترانسلوكاز الكارنيتين أسيلكارنيتين 7. ضمن مصفوفة الميتوكوندريا ، تعمل سلسلة آلات الأكسدة β على تقصير acyl-CoA في عملية من 4 خطوات تولد أسيتيل CoA التي تدخل دورة TCA (دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل) وتقليل المكافئات. تقويض البالميتات (C16) ، الأحماض الدهنية الأكثر شيوعا في ، عبر هذا المسار ينتج ~ 131 ATP ، أكثر بكثير من ~ 38 ATP الناتج عن أكسدة الجلوكوز7.

أشارت دراسات التتبع باستخدام الدهون ذات العلامات المشعة إلى أن العظام تشغل جزءا كبيرا من الدهون المنتشرة9،10 ، في حين أن الاستئصال الجيني للإنزيمات الحاسمة لتقويض الدهون يؤدي إلى انخفاض نشاط بانيات العظم وفقدان العظام9،11. يستخدم البروتوكول المقدم هنا 14حمضا دهنيا يحمل علامة C لتقييم قدرة بانيات العظم المستنبتة على استقلاب الأحماض الدهنية بالكامل إلى ثاني أكسيد الكربون2 أو المستقلبات القابلة للذوبان في الأحماض ، والتي تمثل خطوات وسيطة في عملية الأكسدة. في حين أن استخدام النشاط الإشعاعي مطلوب ، فإن الطريقة واضحة وتتطلب استثمارا محدودا وقابلة للتكيف لصالح المستقلبات وأنواع الخلايا الأخرى ذات العلامات الراديوية.

Protocol

يستخدم هذا البروتوكول تحويل [1-14درجة مئوية] - حمض الأوليك إلى 14ثاني أكسيدالكربون 2 كمؤشر على قدرة أكسدة الأحماض الدهنية. وافق مكتب السلامة الإشعاعية المحلي على بروتوكول استخدام المواد المشعة قبل بدء التجارب. تم إجراء جميع الإجراءات الإشعاعية خلف درع زجاجي باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. وافقت اللجنة المحلية لرعاية واستخدامها على البروتوكول قبل استخدام الخلايا الأولية.

1. أكسدة الأحماض الدهنية في بانيات العظم المستنبتة

  1. الزراعة الفرعية لبانيات العظم الجلجلية الأولية12 أو خط الخلايا العظمية مثل Mc3t3-E1 ، والصفيحة في قوارير T-25 (5 × 105 خلايا / قارورة) في α-MEM تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 0.1 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.
    1. بذور 3-4 قوارير لكل مجموعة علاجية (أي التحكم والضربة القاضية الجينية أو العلاج الآلي والدوائي للمركبة) لاستخدامها في التجربة. قم بزرع 1-2 قوارير إضافية لكل مجموعة معالجة لتطبيع عدد الخلايا أو تركيزات البروتين. احتضان قوارير الاستزراع في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  2. استزراع الخلايا لمدة 2-3 أيام حتى تتماسك القوارير. حث المزارع المتقاربة على التمايز عن طريق إضافة 50 ميكروغرام / مل من حمض الأسكوربيك و 10 ملي مولار من فوسفات β جلسرين (انظر جدول المواد) إلى وسط الاستزراع واستمر في الاستزراع لمدة تصل إلى 14 يوما إضافيا.
    ملاحظة: تجويع المصل (إضافة 0.5٪ -1٪ FBS) بين عشية وضحاها ضروري إذا تم التخطيط لعلاجات عامل النمو. يؤدي خفض النسبة المئوية ل FBS إلى الحد من كمية الدهون غير الملصقة بالإشعاع في المزرعة ويسمح بالتأثير الأقصى لعوامل النمو الخارجية. إذا كان سيتم اختبار تأثيرات الهرمونات ، يتم استخدام FBS المجردة من الفحم.
  3. قم بإعداد ورق الترشيح ، وسدادات الأكمام المطاطية مقاس 15 مم × 30 مم ، والآبار المركزية المصنوعة من مادة البولي بروبلين (انظر جدول المواد) في اليوم السابق للتجربة.
    1. قم بطي شريط من ورق الترشيح مقاس 1 سم × 10 سم على شكل مروحة وضعه في دلو مركز البولي بروبلين جيدا. اضغط على ذراع مركز البولي بروبلين جيدا من خلال مركز سدادة الأكمام المطاطية وقم بخفض مركز البولي بروبلين جيدا في قارورة T-25. ثم أغلق القارورة بسدادة الأكمام (الشكل 1).
      ملاحظة: قد يكون من الضروري ضبط موضع مركز البولي بروبلين جيدا للتأكد من أنه لا يتلامس مع وسط الزيادة. أثناء التجربة ، يمنع مركز البولي بروبلين جيدا ورق الترشيح من لمس وسط الملصقات ويسمح بجمع 14ثاني أكسيدالكربون 2.
  4. في يوم التجربة ، اقتران [1-14درجة مئوية] - حمض الأوليك مع ألبومين مصل الأبقار (BSA) عن طريق خلط 20٪ من ألبومين مصل الأبقار في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (5 ميكرولتر لكل قارورة) مع 0.1 ميكروCi / مل من [1-14درجة مئوية] - حمض الأوليك (0.6 ميكرولتر / قارورة) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
    1. ثم ضع الأنبوب في أنبوب مخروطي سعة 50 مل واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع رج لطيف. قم بإعداد 1-2 قوارير إضافية لاقترانات حمض الأوليك - BSA لحساب خطأ سحب العينات.
  5. قم بإزالة وسط المزرعة من قارورة زراعة الأنسجة واستبدله ب 1.5 مل من وسائط تجويع المصل الطازجة (الخطوة 1.2).
  6. لكل قارورة ، امزج 5.6 ميكرولتر من محلول حمض الأوليك BSA (الخطوة 1.4) مع 2 ميكرولتر من محلول كارنيتين 100 ملي مولار و 1 مل من وسائط الاستزراع لإنتاج محلول وضع العلامات. أضف محلول الملصقات إلى قوارير الثقافة. احتفظ بالمحلول الزائد لقراءة الأعداد الإجمالية للنشاط المضاف إلى المقايس.
    ملاحظة: لا يتم إضافة محلول الملصقات إلى القوارير الإضافية التي تهدف إلى تحديد عدد الخلايا أو تركيز البروتين.
  7. اخفض الآبار المركزية المصنوعة من مادة البولي بروبلين التي تحتوي على ورق الترشيح في القارورة ثم قم بتغطيتها بسدادة مطاطية.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان ألا يتصل مركز البولي بروبلين بوسط الاستزراع. سيؤدي ذلك إلى تلوث ورق الترشيح بالأحماض الدهنية ذات العلامات الإشعاعية بدلا من ثاني أكسيد الكربون2.
  8. احتضان مزارع الخلايا لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  9. لجمع 14ثاني أكسيدالكربون 2 ، قم بحقن 150 ميكرولتر من 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم في مركز البولي بروبلين جيدا لترطيب ورق الترشيح و 200 ميكرولتر من حمض البركلوريك 1 متر في وسط الاستزراع. حقن هيدروكسيد الصوديوم وحمض البركلوريك عن طريق دفع إبرة عبر السدادة المطاطية.
    ملاحظة: لا ينبغي إزالة السدادة المطاطية من القارورة. قد يتسبب هذا في هروب 14ثاني أكسيد الكربون. لسهولة الحقن ، احتفظ بالقارورة في وضع مستقيم ثم عد إلى وضع المزرعة بعد اكتمال الحقن.
  10. احتضان القوارير عند 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  11. افتح القوارير بعد تبريدها في غطاء مزرعة الخلية. قم بإزالة أوراق الترشيح من الآبار المركزية للبولي بروبلين بالملاقط وضعها في 3-4 مل من سائل التلألؤ (انظر جدول المواد) في قارورة التلألؤ.
    ملاحظة: يضاف 100 ميكرولتر من محلول الملصقات الزائد إلى 3-4 مل من سائل التلألؤ لقياس إجمالي عدد النشاط. يضاف 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع القاعدي (بدون [1-14درجة مئوية] - حمض الأوليك) إلى 3-4 مل من سائل التلألؤ لقياس نشاط الخلفية.
  12. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة أو بين عشية وضحاها ، قم بقياس النشاط الإشعاعي بالعدد في الدقيقة (النسخة الواحدة في الدقيقة) باستخدام عداد التلألؤ (انظر جدول المواد).
  13. لتطبيع نتائج التكلفة لكل ألف ظهور ، قم بعزل مستخلصات البروتين من قوارير T-25 غير المسماة لكل حالة مزرعة. اغسل بمحلول ملحي مخزن بفوسفات سعة 5 مل ، وأضف 1 مل من محلول تحلل الخلايا RIPA إلى كل قارورة ، واكشط سطح الخلية باستخدام مكشطة الخلية.
    1. انقل المخزن المؤقت RIPA إلى أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام ماصة وجهاز طرد مركزي عند 19,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية باستخدام ماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وحدد تركيز البروتين وفقا لبروتوكول فحص BCA (انظر جدول المواد).
    2. اقسم قراءات النسخة المتكررة في الدقيقة الخام من عداد التلألؤ على تركيز البروتين للحصول على النسخة الطبيعية من 14ثاني أكسيد الكربونالمنتج (الجدول 1).
  14. اتبع المتطلبات المحلية للتخلص من قوارير التلألؤ ، ومواد زراعة الخلايا ، والوسط ، والمحاقن ، وما إلى ذلك. تطهير أسطح العمل وإجراء اختبارات مسح النشاط الإشعاعي وفقا للمتطلبات المحلية.

2. جمع المستقلب القابل للذوبان في الحمض

ملاحظة: قد لا تكون فترة الحضانة التي تبلغ 3 ساعات المستخدمة في الخطوة 1.8 أعلاه وقتا كافيا لأكسدة كل حمض الأوليك الكامل [1-14درجة مئوية] الذي تمتصه الخلايا إلى ثاني أكسيد الكربون2. يمكن أيضا تقييم التدفق في مسار أكسدة الأحماض الدهنية عن طريق قياس النشاط الإشعاعي في الجزء القابل للذوبان في الحمض.

  1. اجمع 1 مل من الوسائط المحمضة من كل قارورة T-25 معالجة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
  2. أضف 60 ميكرولتر من 20٪ BSA و 100 ميكرولتر من حمض البيركلوريك 16 م.
  3. دوامة وتحتضن بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  4. بعد ذلك ، الدوامة وأجهزة الطرد المركزي عند 20,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. أضف 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى سائل التلألؤ وقم بقياس النشاط (الخطوة 1.12).
  6. تطبيع القراءات لتركيز البروتين أو قياسات الحمض النووي (الخطوة 1.13.1).

3. قياس أكسدة الجلوكوز أو أكسدة الأحماض الأمينية

  1. استبدل 14حمض الأوليك المسمى C ب 14من الأحماض الأمينية المسمى C أو 14من الأحماض الأمينية المسمى C لقياس أكسدة جزيئات الوقود هذه.
  2. تحضير مزارع بانيات العظم وفقا للخطوات 1.1-1.2.
  3. لبدء التجربة ، قم بإزالة وسط المزرعة من قارورة زراعة الأنسجة واستبدله ب 1.5 مل من وسائط تجويع المصل الطازجة.
  4. قم بإعداد محلول وضع العلامات على 0.6 ميكروCi من 14جلوكوز مسمى C أو 14من الأحماض الأمينية المسمى C في 1 مل من وسائط الجوع وأضفها إلى القوارير.
  5. قم بتنفيذ الخطوات 1.6-1.13.

النتائج

النشاط الأنزيمي لكل من كارنيتين بالميتويل ترانسفيراز -1 (Cpt1) والكارنيتين بالميتويل ترانسفيراز -2 (Cpt2) مطلوب لأكسدة الأحماض الدهنية طويلة السلسلة في الميتوكوندريا. Cpt1 هو الإنزيم المحدد للمعدل في المسار الأيضي ، ولكن يتم ترميز ثلاثة أشكال إسوية (Cpt-1a و Cpt-1b و Cpt-1c) في جينومات ا?...

Discussion

يسمح الإجراء الموصوف أعلاه بالتقييم المباشر لأكسدة الأحماض الدهنية حيث أن المخرجات المقاسة هي 14ثاني أكسيد الكربون2 تم جمعها على ورق الترشيح المنقوع بهيدروكسيد الصوديوم والمستقلبات القابلة للذوبان في الأحماض التي تم جمعها بعد تحمض الثقافة بحمض البيركلوريك...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال جائزة مراجعة الجدارة من خدمة البحث والتطوير في المختبرات الطبية الحيوية التابعة لمكتب البحث والتطوير لشؤون المحاربين القدامى (BX003724) ومنحة من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (DK099134).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
[1-14C]-Oleic acidPerkin ElmerNEC317050UC
15 x 30 mm rubber sleeve stoppersVWR89097-542
1 mL syringeBD precision309628
25 G needle (25 G x 1 1/2 in)BD precision305127
Ascorbic AcidSigma AldrichA4403
BCA Protein Assay KitThermo Fisher23225Other kits are also suitable
Beckman Scintillation Counter, or equivalentBeckman CoulterLS6000SC
Beta-glycerol phosphateSigma AldrichG6626
Bovine Serum AlbuminSigma Aldrich126609
CarnitineSigma AldrichC0283
Cellular lysis bufferThe protocol is amenable to typical lysis buffers (i.e. RIPA)
Dissecting forcepsAvailable from multiple sources
DNA quantification KitAvailable from multiple sources
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SalineCorning20-030-CV
Fetal Bovine SerumAvailable from multiple sources
Microcentrifuge tubes, 1.5 mLAvailable from multiple sources
Minimum Essensial Medium, Alpha modificationCorning10-022-CV
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Perchloric AcidSigma Aldrich50439
Polypropylene center wellsVWR72760-048
Sodium hydroxideSigma AldrichS5881
T-25 canted neck tissue culture flaskCorning430639
Tissue Culture Incubator
Trypsin (0.25%)-EDTAGibco25200056
Ultima Gold (Scintillation solution)PerkinElmer6013329
Whatman Chromatography paperSigma AldrichWHA3030917

References

  1. Cameron, D. A. The fine structure of osteoblasts in the metaphysis of the tibia of the young rat. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 583-595 (1961).
  2. Dudley, H. R., Spiro, D. The fine structure of bone cells. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 11 (3), 627-649 (1961).
  3. Shapiro, I., Haselgrove, J. i. n., Hall, B. K. Ch. 5, Bone Metabolism and Mineralization. Bone Vol. 4. , 99-140 (1991).
  4. Komarova, S. V., Ataullakhanov, F. I., Globus, R. K. Bioenergetics and mitochondrial transmembrane potential during differentiation of cultured osteoblasts. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 279 (4), 1220-1229 (2000).
  5. Bolton, J. G., Patel, S., Lacey, J. H., White, S. A prospective study of changes in bone turnover and bone density associated with regaining weight in women with anorexia nervosa. Osteoporosis International. 16 (12), 1955-1962 (2005).
  6. Nussbaum, M., Baird, D., Sonnenblick, M., Cowan, K., Shenker, I. R. Short stature in anorexia nervosa patients. Journal of Adolescent Health Care. 6 (6), 453-455 (1985).
  7. Alekos, N. S., Moorer, M. C., Riddle, R. C. Dual effects of lipid metabolism on osteoblast function. Frontiers in Endocrinology. 11, 578194 (2020).
  8. Karner, C. M., Long, F. Glucose metabolism in bone. Bone. 115, 2-7 (2018).
  9. Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
  10. Niemeier, A., et al. Uptake of postprandial lipoproteins into bone in vivo: impact on osteoblast function. Bone. 43 (2), 230-237 (2008).
  11. Helderman, R. C., et al. Loss of function of lysosomal acid lipase (LAL) profoundly impacts osteoblastogenesis and increases fracture risk in humans. Bone. 148, 115946 (2021).
  12. Jonason, J. H., O'Keefe, R. J. Isolation and culture of neonatal mouse calvarial osteoblasts. Methods in Molecular Biology. 1130, 295-305 (2014).
  13. Haynie, K. R., Vandanmagsar, B., Wicks, S. E., Zhang, J., Mynatt, R. L. Inhibition of carnitine palymitoyltransferase1b induces cardiac hypertrophy and mortality in mice. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16 (8), 757-760 (2014).
  14. Long, C. P., Antoniewicz, M. R. High-resolution (13)C metabolic flux analysis. Nature Protocols. 14 (13), 2856-2877 (2019).
  15. Divakaruni, A. S., et al. Etomoxir inhibits macrophage polarization by disrupting CoA homeostasis. Cell Metabolism. 28 (3), 490-503 (2018).
  16. Raud, B., et al. Etomoxir actions on regulatory and memory T cells are independent of cpt1a-mediated fatty acid oxidation. Cell Metabolism. 28 (3), 504-515 (2018).
  17. Frey, J. L., et al. Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).
  18. Frey, J. L., Kim, S. P., Li, Z., Wolfgang, M. J., Riddle, R. C. beta-catenin directs long-chain fatty acid catabolism in the osteoblasts of male mice. Endocrinology. 159 (1), 272-284 (2018).
  19. Li, Z., et al. Glucose transporter-4 facilitates insulin-stimulated glucose uptake in osteoblasts. Endocrinology. 157 (11), 4094-4103 (2016).
  20. Lee, J., et al. Loss of hepatic mitochondrial long-chain fatty acid oxidation confers resistance to diet-induced obesity and glucose intolerance. Cell Reports. 20 (3), 655-667 (2017).
  21. Kim, S. P., et al. Sclerostin influences body composition by regulating catabolic and anabolic metabolism in adipocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11238-11247 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

14C

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved