培养骨细胞中脂肪酸氧化的评价

摘要

本方案描述了一种测定法，用于评估原代骨细胞或相关细胞系培养物中脂肪酸氧化的能力。

摘要

通过分化成骨细胞形成骨预计需要大量的能量输入，因为这些特化细胞必须合成构成骨组织的大细胞外基质蛋白，然后浓缩其矿化所需的离子。关于骨形成代谢需求的数据正在迅速出现。虽然还有很多东西有待了解，但预计中间代谢的紊乱会导致骨骼疾病。这里概述了一种方案，以评估成骨细胞将 ¹⁴个 C 标记的脂肪酸氧化成 ¹⁴个 CO₂ 和酸溶性代谢物的能力。脂肪酸代表着一种丰富的能量储备，可以在进食后或从脂肪组织储存中释放出来后从循环中吸收。该测定在 T-25 组织培养瓶中进行，有助于研究基因增益或功能丧失对脂肪酸利用的影响，以及维持骨量所必需的生长因子或形态发生素形式的合成代谢信号的影响。还提供了有关调整方案以评估葡萄糖或氨基酸（如谷氨酰胺）氧化的能力的详细信息。

引言

成骨细胞来源于骨髓和骨膜中的祖细胞，负责合成和分泌构成骨组织的矿化、富含胶原蛋白的基质。为了实现这项耗费精力的工作并有助于终生维持骨骼完整性，这些特化细胞维持着丰富的粗糙内质网，这些内质网对于合成细胞外基质蛋白 ^1,2 和许多高膜电位线粒体至关重要，以从燃料底物中收集必要的化学能 ^3,4.后一种功能的重要性表现为骨骼生长的停止和骨质减少 ^5,6 的发展，这与热量限制中的能量不足有关。成骨细胞首选燃料来源的身份以及分化或响应合成代谢信号传导期间成骨细胞代谢需求的数据正在出现 ^7,8。

长链脂肪酸代表血清中存在的丰富化学能供应，并随着热量摄入减少或能量消耗增加而从脂肪组织中释放出来。穿过细胞膜并连接到辅酶 A 以增加溶解度后，脂肪酰基辅酶 A 通过线粒体外膜和内膜上的双肉碱棕榈酰转移酶和肉碱-酰基肉碱转位酶⁷ 穿梭到线粒体基质中。在线粒体基质中，β-氧化机械链在 4 步过程中缩短酰基辅酶 A，产生乙酰辅酶 A，进入 TCA 循环（三羧酸循环）和还原当量。棕榈酸酯 （C₁₆） 是动物中最常见的脂肪酸， 通过 该途径分解代谢产生 ~131 个 ATP，大大超过葡萄糖氧化产生的 ~38 个 ATP⁷。

使用放射性标记脂质的追踪研究表明，骨骼占据了循环脂质的很大一部分 ^9,10，而对脂质分解代谢至关重要的酶的遗传消融导致成骨细胞活性降低和骨流失 ^9,11。这里介绍的方案使用 ¹⁴个 C 标记的脂肪酸来评估培养的成骨细胞将脂肪酸完全代谢为 CO₂ 或酸溶性代谢物的能力，这代表了氧化过程中的中间步骤。虽然需要使用放射性，但该方法简单明了，需要的投资有限，并且适用于其他放射性标记的代谢物和细胞类型。

研究方案

该方案使用 [^1-14C] - 油酸转化为 ¹⁴CO₂ 作为脂肪酸氧化能力的指标。当地辐射安全办公室在开始实验之前批准了使用放射性材料的协议。所有辐射程序均在有机玻璃防护罩后使用适当的个人防护设备进行。当地动物护理和使用委员会在使用原代细胞之前批准了该方案。

1. 培养成骨细胞中的脂肪酸氧化

1. 传代颅骨成骨细胞¹² 或成骨细胞系（如 Mc3t3-E1），并在含有 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 0.1 μg/mL 链霉素的 α-MEM 中的 T-25 培养瓶（5 x 10⁵ 个细胞/培养瓶）中接种。
   1. 为每个处理组（即，对照和基因敲除或载体和药物治疗）接种 3-4 个烧瓶，用于实验。为每个处理组接种额外的 1-2 个烧瓶，以标准化为细胞数量或蛋白质浓度。将培养瓶置于 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿细胞培养箱中孵育。
2. 将细胞培养 2-3 天，直到培养瓶汇合。通过向培养基中加入 50 μg/mL 抗坏血酸和 10 mM β-甘油磷酸酯（参见 材料表）来诱导汇合培养物分化，并继续培养长达 14 天。
   注：如果计划进行生长因子处理，则需要血清饥饿（添加 0.5%-1% FBS）过夜。降低 FBS 的百分比限制了培养物中非放射性标记脂质的量，并允许外源性生长因子发挥最大作用。如果要测试激素的效果，则使用木炭剥离的 FBS。
3. 在实验前一天准备滤纸、15 mm x 30 mm 橡胶套塞和聚丙烯中心孔（参见 材料表）。
   1. 将一条 1 cm x 10 cm 的滤纸折叠成风扇形状，然后将其放入聚丙烯中心孔的桶中。将聚丙烯中心的臂充分压入橡胶套塞的中心，然后将聚丙烯中心充分放入 T-25 培养瓶中。然后用套筒塞密封烧瓶（图 1）。
      注意：可能需要调整聚丙烯中心的位置，以确保它不会与培养基接触。在实验过程中，聚丙烯中心很好地防止滤纸接触标记介质，并允许收集 ¹⁴个 CO₂。
4. 实验当天，将 20% 牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲盐水（每个培养瓶 5 μL）中，与 0.1 μCi/mL [^1-14C]-油酸（0.6 μL/培养瓶）混合，在 1.5 mL 微量离心管中，使 [^1-14C]-油酸与牛血清白蛋白 （BSA） 偶联。
   1. 然后将试管放入 50 mL 锥形管中，在 37 °C 下轻轻摇动孵育 30 分钟。为油酸-BSA 偶联物准备 1-2 个额外的烧瓶，以解决移液错误。
5. 从组织培养瓶中取出培养基，并用 1.5 mL 新鲜血清饥饿培养基替换（步骤 1.2）。
6. 对于每个培养瓶，将 5.6 μL 油酸-BSA 溶液（步骤 1.4）与 2 μL 100 mM 肉碱溶液和 1 mL 培养基混合，以制备标记溶液。将标记溶液添加到培养瓶中。保留过量的溶液以读取添加到测定中的活性总数。
   注：标记溶液未添加到用于定量细胞数量或蛋白质浓度的额外培养瓶中。
7. 降低烧瓶中装有滤纸的聚丙烯中心孔，然后用橡胶塞盖住。
   注意：聚丙烯中心孔不得接触培养基，这一点至关重要。这将导致滤纸被放射性标记的脂肪酸而不是 CO₂ 交叉污染。
8. 将细胞培养物在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 3 小时。
9. 要收集 ¹⁴CO₂，将 150 μL 1 N NaOH 注入聚丙烯中心孔中以润湿滤纸，并将 200 μL 1 M 高氯酸注入培养基中。通过将针头推入橡胶塞来注入 NaOH 和高氯酸。
   注意：不应从烧瓶中取出橡胶塞。这可能会导致 ¹⁴CO₂ 逸出。为了便于注射，请将培养瓶保持直立位置，然后在注射完成后返回培养位置。
10. 将烧瓶在 55 °C 下孵育 1 小时。
11. 在细胞培养罩中冷却后打开培养瓶。用镊子从聚丙烯中心孔中取出滤纸，并将它们放入闪烁瓶中的 3-4 mL 闪烁液（参见 材料表）中。
    注：将 100 μL 过量标记溶液添加到 3-4 mL 闪烁液中，以测量活性总数。将 100 μL 基础培养基（不含 [^1-14C]-油酸）加入 3-4 mL 闪烁液中以测量背景活性。
12. 在室温下孵育 1 小时或过夜后，使用闪烁计数器以每分钟计数 （cpm） 为单位测量放射性（参见 材料表）。
13. 为了使 cpm 结果标准化，在每种培养条件下从未标记的 T-25 培养瓶中分离蛋白质提取物。用 5 mL 磷酸盐缓冲盐水洗涤，向每个培养瓶中加入 1 mL RIPA 细胞裂解缓冲液，然后用细胞刮刀刮擦细胞表面。
    1. 用移液管将 RIPA 缓冲液转移到微量离心管中，并在 4 °C 下以 19,000 x g 离心 20 分钟。 用移液管将上清液转移到新鲜的微量离心管中，并根据 BCA 测定方案测定蛋白质浓度（参见 材料表）。
    2. 将闪烁计数器中的原始 cpm 读数除以蛋白质浓度，以获得产生的 ¹⁴CO₂ 的标准化 cpm（表 1）。
14. 按照当地要求处理闪烁瓶、细胞培养材料、培养基、注射器等。对工作表面进行净化，并按照当地要求进行放射性擦拭测试。

2. 酸溶性代谢物收集

注意：上述步骤 1.8 中使用的 3 小时孵育期可能没有足够的时间将细胞吸收的所有 [^1-14C] 全油酸氧化为 CO₂。脂肪酸氧化途径中的通量也可以通过测量酸溶性馏分中的放射性来评估。

1. 从每个处理过的 T-25 培养瓶中收集 1 mL 酸化培养基，并将其转移到 1.5 mL 微量离心管中。
2. 加入 60 μL 20% BSA 和 100 μL 16 M 高氯酸。
3. 涡旋并在 4 °C 下孵育过夜。
4. 接下来，涡旋并在 4 °C 下以 20,000 x g 离心 30 分钟。
5. 将 200 μL 上清液加入闪烁液中并测量活性（步骤 1.12）。
6. 将读数标准化为蛋白质浓度或 DNA 测量值（步骤 1.13.1）。

3. 葡萄糖氧化或氨基酸氧化的测量

1. 用 ¹⁴个 C 标记的葡萄糖或 ¹⁴个 C 标记的氨基酸代替 ¹⁴个 C 标记的油酸，以测量这些燃料分子的氧化。
2. 根据步骤 1.1-1.2 准备成骨细胞培养物。
3. 要开始实验，请从组织培养瓶中取出培养基，并用 1.5 mL 新鲜血清饥饿培养基替换。
4. 在 1 mL 饥饿培养基中制备 0.6 μCi ^{的 14}个 C 标记葡萄糖或 ¹⁴个 C 标记氨基酸的标记溶液，并添加到培养瓶中。
5. 执行步骤 1.6-1.13。

结果

肉碱棕榈酰转移酶-1 （Cpt1） 和肉碱棕榈酰转移酶-2 （Cpt2） 的酶活性是线粒体长链脂肪酸氧化所必需的。Cpt1 是代谢途径中的限速酶，但三种亚型 （Cpt-1a、Cpt-1b 和 Cpt-1c） 在哺乳动物基因组中编码，一种亚型的遗传破坏可导致另一种亚型¹³ 的代偿性上调。相比之下，Cpt2 由单个基因编码。在 图 2A 所示的实验中，Cpt2 的遗传消融导?...

讨论

上述程序允许直接评估脂肪酸氧化，因为测量输出是在 NaOH 浸泡的滤纸上收集的 ¹⁴个 CO₂ 和用高氯酸酸化培养物后收集的酸溶性代谢物。使用荧光标记的脂质分子或脂质类似物的市售检测试剂盒可以测量脂质摄取，但它们不能确定能量产生的分解代谢。其他分解代谢指标，例如 ¹³C-代谢通量¹⁴，需要专门的分析设备。该测定法灵敏...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
[1-14C]-Oleic acid	Perkin Elmer	NEC317050UC
15 x 30 mm rubber sleeve stoppers	VWR	89097-542
1 mL syringe	BD precision	309628
25 G needle (25 G x 1 1/2 in)	BD precision	305127
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A4403
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225	Other kits are also suitable
Beckman Scintillation Counter, or equivalent	Beckman Coulter	LS6000SC
Beta-glycerol phosphate	Sigma Aldrich	G6626
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	126609
Carnitine	Sigma Aldrich	C0283
Cellular lysis buffer			The protocol is amenable to typical lysis buffers (i.e. RIPA)
Dissecting forceps			Available from multiple sources
DNA quantification Kit			Available from multiple sources
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Corning	20-030-CV
Fetal Bovine Serum			Available from multiple sources
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL			Available from multiple sources
Minimum Essensial Medium, Alpha modification	Corning	10-022-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Perchloric Acid	Sigma Aldrich	50439
Polypropylene center wells	VWR	72760-048
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S5881
T-25 canted neck tissue culture flask	Corning	430639
Tissue Culture Incubator
Trypsin (0.25%)-EDTA	Gibco	25200056
Ultima Gold (Scintillation solution)	PerkinElmer	6013329
Whatman Chromatography paper	Sigma Aldrich	WHA3030917