Оценка окисления жирных кислот в культивируемых костных клетках

Резюме

В настоящем протоколе описан анализ для оценки способности к окислению жирных кислот в культурах первичных костных клеток или соответствующих клеточных линий.

Аннотация

Ожидается, что формирование костной ткани путем дифференцировки остеобластов потребует значительных энергетических затрат, поскольку эти специализированные клетки должны синтезировать большие белки внеклеточного матрикса, составляющие костную ткань, а затем концентрировать ионы, необходимые для ее минерализации. Данные о метаболических потребностях в формировании костей появляются быстро. Хотя многое еще предстоит узнать, ожидается, что нарушения в промежуточном метаболизме способствуют заболеванию скелета. Здесь изложен протокол для оценки способности остеобластических клеток окислять ¹⁴С-меченых жирных кислот до ¹⁴_СО2 и кислоторастворимых метаболитов. Жирные кислоты представляют собой богатый энергетический резерв, который может быть взят из кровообращения после кормления или после их высвобождения из запасов жировой ткани. Анализ, проводимый в колбах с культурами тканей Т-25, полезен для изучения прироста или потери функции генов на утилизацию жирных кислот и влияние анаболических сигналов в виде факторов роста или морфогенов, необходимых для поддержания костной массы. Также приводится подробная информация о возможности адаптации протокола для оценки окисления глюкозы или аминокислот, таких как глютамин.

Введение

Остеобласт, полученный из клеток-предшественников, присутствующих в костном мозге и надкостнице, отвечает за синтез и секрецию минерализованного, богатого коллагеном матрикса, из которого состоит костная ткань. Чтобы выполнить эту энергетически дорогостоящую задачу и внести свой вклад в пожизненное поддержание целостности скелета, эти специализированные клетки поддерживают обильный шероховатый эндоплазматический ретикулум, необходимый для синтеза белков внеклеточного матрикса ^1,2 и многочисленные митохондрии с высоким мембранным потенциалом для сбора необходимой химической энергии из топливных субстратов ^3,4. Важность этой последней функции иллюстрируется прекращением роста костей и развитием остеопении5,6, связанной с дефицитом энергии, как при ограничении калорий. Идентификация предпочтительного источника топлива для остеобласта и данные о метаболических потребностях остеобласта во время дифференцировки или в ответ на анаболическую сигнализацию появляются ^7,8.

Длинноцепочечные жирные кислоты представляют собой богатый запас химической энергии, присутствующей в сыворотке крови и высвобождаемой из жировой ткани в ответ на снижение потребления калорий или повышенный расход энергии. После прохождения через клеточную мембрану и лигирования к коэнзиму А для повышения растворимости, жирные ацил-КоА транспортируются в митохондриальный матрикс двойными ферментами карнитинпальмитоилтрансферазы на внешней и внутренней мембранах митохондрий и карнитин-ацилкарнитиновой транслоказой⁷. В митохондриальном матриксе цепочка механизмов окисления β укорачивает ацил-КоА в 4-ступенчатом процессе, который генерирует ацетил-КоА, который входит в цикл ТСА (цикл трикарбоновых кислот) и восстанавливает эквиваленты. Катаболизм пальмитата (C₁₆), наиболее распространенных жирных кислот у животных, через этот путь дает ~131 АТФ, что значительно больше, чем ~38 АТФ, образующихся при^{окислении} глюкозы.

Исследования с использованием радиоактивно меченых липидов показали, что кость занимает значительную часть циркулирующих липидов ^9,10, в то время как генетическая абляция ферментов, критически важных для катаболизма липидов, приводит к снижению активности остеобластов и потере костной массы ^9,11. Представленный здесь протокол использует меченую ¹⁴С-меченную жирную кислоту для оценки способности культивируемых остеобластов полностью метаболизировать жирные кислоты до CO₂ или кислоторастворимых метаболитов, которые представляют собой промежуточные этапы в процессе окисления. Несмотря на то, что использование радиоактивности является обязательным, метод прост, требует ограниченных инвестиций и может быть адаптирован для использования с другими метаболитами и типами клеток, мечеными радиоактивными метками.

протокол

В этом протоколе используется преобразование [^1-14C]-олеиновой кислоты в ¹⁴_CO2 в качестве индикатора окислительной способности жирных кислот. Местное управление по радиационной безопасности утвердило протокол использования радиоактивных материалов до начала экспериментов. Все процедуры облучения проводились за плексигласовым экраном с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты. Местный комитет по уходу за животными и их использованию одобрил протокол перед использованием первичных клеток.

1. Окисление жирных кислот в культивируемых остеобластах

1. Субкультивируют первичные кальвариальные остеобласты¹² или остеобластическую клеточную линию, такую как Mc3t3-E1, и помещают в колбы Т-25 (5 x 10⁵ клеток/колбу) в α-MEM, содержащем 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 0,1 мкг/мл стрептомицина.
   1. Засейте 3-4 колбы для каждой группы лечения (т.е. контрольной и генной нокаутной или носительной и фармакологической терапии) для использования в эксперименте. Засейте дополнительно 1-2 колбы для каждой группы лечения для нормализации количества клеток или концентрации белков. Инкубируйте колбы с культурами в увлажнённом инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C с 5%_CO2.
2. Культивируйте клетки в течение 2-3 дней, пока колбы не сливаются. Индуцируйте конфлюентные культуры к дифференцировке, добавив 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 10 мМ β-глицеринфосфата (см. Таблицу материалов) в питательную среду и продолжайте культивирование до 14 дополнительных дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сывороточное голодание (добавление 0,5%-1% FBS) в течение ночи необходимо, если планируется лечение фактором роста. Снижение процента FBS ограничивает количество немеченых липидов в культуре и позволяет максимально эффективно использовать экзогенные факторы роста. Если необходимо проверить действие гормонов, используется FBS, лишенный древесного угля.
3. За день до эксперимента подготовьте фильтровальную бумагу, пробки из резиновой втулки размером 15 мм x 30 мм и центральные лунки из полипропилена (см. Таблицу материалов).
   1. Сложите полоску фильтровальной бумаги размером 1 см х 10 см в форме веера и поместите ее в ведро полипропиленового центра лунки. Продавите рычаг полипропиленового центра через центр резиновой втулки и опустите полипропиленовый центр в колбу Т-25. Затем запечатайте колбу с помощью пробки от втулки (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться отрегулировать расположение полипропиленового центра, чтобы гарантировать, что он не соприкасается с питательной средой. Во время эксперимента полипропиленовый центр хорошо предотвращает соприкосновение фильтровальной бумаги с маркировочной средой и позволяет собирать ¹⁴_СО2.
4. В день эксперимента конъюгировали [^1-14С]-олеиновую кислоту с бычьим сывороточным альбумином (БСА) путем смешивания 20% бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере (5 мкл на колбу) с 0,1 мкКи/мл [^1-14С]-олеиновой кислоты (0,6 мкл/колба) в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.
   1. Затем поместите пробирку в коническую пробирку объемом 50 мл и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 30 минут, осторожно встряхивая. Подготовьте 1-2 дополнительных колбы для конъюгатов олеиновой кислоты-БСА, чтобы учесть ошибку пипетирования.
5. Извлеките питательную среду из колбы для культуры тканей и замените ее 1,5 мл свежей среды для голодания сыворотки (шаг 1.2).
6. Для каждой колбы смешайте 5,6 мкл раствора олеиновой кислоты-БСА (шаг 1.4) с 2 мкл 100 мМ раствора карнитина и 1 мл питательной среды для получения раствора для маркировки. Добавьте этикетировочный раствор в колбы для культур. Сохраните лишний раствор, чтобы прочитать общее количество активности, добавленной в анализ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для мечения не добавляют в дополнительные колбы, предназначенные для количественного определения количества клеток или концентрации белка.
7. Опустите полипропиленовые центральные лунки, содержащие фильтровальную бумагу, в колбу, а затем закройте ее резиновой пробкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы полипропиленовый центр не контактировал с питательной средой. Это приведет к перекрестному загрязнению фильтровальной бумаги радиоактивной меткой жирной кислотой вместо CO₂.
8. Инкубировать клеточные культуры в течение 3 ч при 37 °C с 5%_CO2.
9. Для сбора ¹⁴_CO2 введите 150 мкл 1 N NaOH в лунку полипропиленового центра для смачивания фильтровальной бумаги и 200 мкл 1 М хлорной кислоты в питательную среду. Введите NaOH и хлорную кислоту, протолкнув иглу через резиновую пробку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Резиновую пробку не следует снимать с колбы. Это может привести к утечке ¹⁴CO₂ . Для облегчения инъекции держите колбу в вертикальном положении, а затем вернитесь в положение для культивирования после завершения инъекций.
10. Инкубируйте колбы при температуре 55 °C в течение 1 ч.
11. Откройте колбы после охлаждения их в колпаке для клеточных культур. Удалите фильтрующие бумаги из полипропиленовых центральных лунок пинцетом и поместите их в 3-4 мл сцинтилляционной жидкости (см. Таблицу материалов) в сцинтилляционный флакон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 100 мкл избыточного раствора для мечения добавляют к 3-4 мл сцинтилляционной жидкости для измерения общего количества активности. 100 мкл базальной питательной среды (без [^1-14С]-олеиновой кислоты) добавляют к 3-4 мл сцинтилляционной жидкости для измерения фоновой активности.
12. После инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч или в течение ночи измерьте радиоактивность в отсчетах в минуту (cpm) с помощью сцинтилляционного счетчика (см. Таблицу материалов).
13. Чтобы нормализовать результаты CPM, выделяйте белковые экстракты из немеченых колб T-25 для каждого условия культивирования. Промойте 5 мл фосфатно-солевого буфера, добавьте 1 мл буфера для лизиса клеток RIPA в каждую колбу и соскребите поверхность клеток скребком.
    1. Перенесите буфер RIPA в микроцентрифужную пробирку с помощью пипетки и центрифугируйте при давлении 19 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Перенесите надосадочную жидкость с помощью пипетки в свежую микроцентрифужную пробирку и определите концентрацию белка в соответствии с протоколом анализа ВСА (см. Таблицу материалов).
    2. Разделите исходные показания cpm со сцинтилляционного счетчика на концентрацию белка, чтобы получить нормализованное cpm ¹⁴_CO2 (Таблица 1).
14. Соблюдайте местные требования по утилизации сцинтилляционных флаконов, материалов для клеточных культур, среды, шприцев и т.д. Обеззараживание рабочих поверхностей и проведение испытаний на радиоактивные стеклоочистители в соответствии с местными требованиями.

2. Кислоторастворимый метаболитный сбор

Примечание: 3-часовой инкубационный период, используемый на шаге 1.8 выше, может быть недостаточным для окисления всей полностью олеиновой кислоты [^1-14С], поглощенной клетками, до_СО2. Поток в пути окисления жирных кислот также можно оценить путем измерения радиоактивности в кислоторастворимой фракции.

1. Соберите 1 мл подкисленной среды из каждой обработанной колбы Т-25 и переложите ее в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
2. Добавьте 60 мкл 20% BSA и 100 мкл 16 М хлорной кислоты.
3. Сделайте вихрь и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C.
4. Затем вортекс и центрифуга при 20 000 x g в течение 30 мин при 4 °C.
5. Добавьте 200 мкл надосадочной жидкости в сцинтилляционную жидкость и измерьте активность (шаг 1.12).
6. Нормализуйте показания в соответствии с концентрацией белка или измерениями ДНК (шаг 1.13.1).

3. Измерение окисления глюкозы или аминокислот

1. Замените ¹⁴С-меченых олеиновых кислот ^{на 14}С-меченых глюкоз или ¹⁴С-меченых аминокислот, чтобы измерить окисление этих молекул топлива.
2. Подготавливают культуры остеобластов в соответствии с шагами 1.1-1.2.
3. Чтобы начать эксперимент, извлеките питательную среду из колбы для культуры тканей и замените ее 1,5 мл свежей среды для голодания сыворотки.
4. Приготовьте мечающий раствор из 0,6 μКи ¹⁴С-меченых глюкозы или ¹⁴С-меченных аминокислот в 1 мл голодающих сред и добавьте в колбы.
5. Выполните шаги 1.6-1.13.

Результаты

Ферментативная активность карнитинпальмитоилтрансферазы-1 (Cpt1) и карнитина пальмитоилтрансферазы-2 (Cpt2) необходима для окисления длинноцепочечных жирных кислот в митохондриях. Cpt1 является ферментом, ограничивающим скорость в метаболическом пути, но три изоформы (Cpt-1...

Обсуждение

Описанная выше методика позволяет провести прямую оценку окисления жирных кислот, поскольку измеряемые выходные данные составляют ¹⁴_CO2, собранных на фильтровальной бумаге, пропитанной NaOH, и кислоторастворимых метаболитов, собранных после подкисления кул...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
[1-14C]-Oleic acid	Perkin Elmer	NEC317050UC
15 x 30 mm rubber sleeve stoppers	VWR	89097-542
1 mL syringe	BD precision	309628
25 G needle (25 G x 1 1/2 in)	BD precision	305127
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A4403
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225	Other kits are also suitable
Beckman Scintillation Counter, or equivalent	Beckman Coulter	LS6000SC
Beta-glycerol phosphate	Sigma Aldrich	G6626
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	126609
Carnitine	Sigma Aldrich	C0283
Cellular lysis buffer			The protocol is amenable to typical lysis buffers (i.e. RIPA)
Dissecting forceps			Available from multiple sources
DNA quantification Kit			Available from multiple sources
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Corning	20-030-CV
Fetal Bovine Serum			Available from multiple sources
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL			Available from multiple sources
Minimum Essensial Medium, Alpha modification	Corning	10-022-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Perchloric Acid	Sigma Aldrich	50439
Polypropylene center wells	VWR	72760-048
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S5881
T-25 canted neck tissue culture flask	Corning	430639
Tissue Culture Incubator
Trypsin (0.25%)-EDTA	Gibco	25200056
Ultima Gold (Scintillation solution)	PerkinElmer	6013329
Whatman Chromatography paper	Sigma Aldrich	WHA3030917