Avaliação da oxidação de ácidos graxos em células ósseas cultivadas

Resumo

O presente protocolo descreve um ensaio para avaliar a capacidade de oxidação de ácidos graxos em culturas de células ósseas primárias ou linhagens celulares relevantes.

Resumo

Espera-se que a formação óssea por osteoblastos diferenciadores exija uma entrada energética significativa, pois essas células especializadas devem sintetizar grandes proteínas da matriz extracelular que compõem o tecido ósseo e, em seguida, concentrar os íons necessários para sua mineralização. Dados sobre os requisitos metabólicos da formação óssea estão surgindo rapidamente. Embora ainda haja muito a ser aprendido, espera-se que os distúrbios no metabolismo intermediário contribuam para a doença esquelética. Aqui, um protocolo é delineado para avaliar a capacidade das células osteoblásticas de oxidar ¹⁴ácidos graxos marcados com C em ¹⁴CO₂ e metabólitos solúveis em ácido. Os ácidos graxos representam uma reserva rica em energia que pode ser retirada da circulação após a alimentação ou após sua liberação dos estoques de tecido adiposo. O ensaio, realizado em frascos de cultura de tecidos T-25, é útil para o estudo do ganho ou perda de função do gene na utilização de ácidos graxos e o efeito de sinais anabólicos na forma de fatores de crescimento ou morfogênios necessários para a manutenção da massa óssea. Detalhes sobre a capacidade de adaptar o protocolo para avaliar a oxidação de glicose ou aminoácidos como a glutamina também são fornecidos.

Introdução

O osteoblasto, derivado de células progenitoras presentes na medula óssea e no periósteo, é responsável pela síntese e secreção da matriz mineralizada e rica em colágeno que compõe o tecido ósseo. Para cumprir esse esforço energeticamente caro e contribuir para a manutenção vitalícia da integridade esquelética, essas células especializadas mantêm um retículo endoplasmático rugoso abundante essencial para sintetizar proteínas da matriz extracelular ^1,2 e numerosas mitocôndrias de alto potencial de membrana para colher a energia química necessária de substratos de combustível ^3,4. A importância desta última função é exemplificada pela cessação do crescimento ósseo e pelo desenvolvimento de osteopenia ^5,6 associada a déficits energéticos como na restrição calórica. A identidade da fonte de combustível preferida do osteoblasto e os dados sobre as necessidades metabólicas do osteoblasto durante a diferenciação ou em resposta à sinalização anabólica estão surgindo ^7,8.

Os ácidos graxos de cadeia longa representam um rico suprimento de energia química presente no soro e liberada do tecido adiposo em resposta à redução da ingestão calórica ou ao aumento do gasto energético. Depois de atravessar a membrana celular e ligar-se à coenzima A para aumentar a solubilidade, a acil-CoAs gordurosa é transportada para a matriz mitocondrial pelas enzimas carnitina palmitoiltransferase dupla nas membranas mitocondriais externa e interna e na translocase de carnitina-acilcarnitina⁷. Dentro da matriz mitocondrial, a cadeia de máquinas de β-oxidação encurta o acil-CoA em um processo de 4 etapas que gera acetil-CoA que entra no ciclo do TCA (ciclo do ácido tricarboxílico) e reduzindo equivalentes. O catabolismo do palmitato (C₁₆), os ácidos graxos mais comuns em animais, por meio dessa via, produz ~ 131 ATP, substancialmente mais do que o ~ 38 ATP gerado pela oxidação da glicose⁷.

Estudos de rastreamento usando lipídios radiomarcados indicaram que o osso ocupa uma fração significativa dos lipídios circulantes ^9,10, enquanto a ablação genética de enzimas críticas para o catabolismo lipídico leva a uma redução na atividade osteoblástica e perda óssea ^9,11. O protocolo aqui apresentado utiliza um ácido graxo marcado com ¹⁴C para avaliar a capacidade dos osteoblastos cultivados de metabolizar totalmente os ácidos graxos em CO₂ ou metabólitos solúveis em ácido, que representam etapas intermediárias no processo de oxidação. Embora o uso de radioatividade seja necessário, o método é direto, requer investimento limitado e é adaptável para o benefício de outros metabólitos e tipos de células radiomarcados.

Protocolo

Este protocolo usa a conversão de ácido [^1-14C]-oleico em ¹⁴CO₂ como um indicador da capacidade de oxidação de ácidos graxos. O escritório local de Segurança de Radiação aprovou o protocolo para o uso de materiais radioativos antes de iniciar os experimentos. Todos os procedimentos de radiação foram realizados atrás de um escudo de plexiglass usando equipamento de proteção individual apropriado. O Comitê Local de Cuidados e Uso de Animais aprovou o protocolo antes do uso de células primárias.

1. Oxidação de ácidos graxos em osteoblastos cultivados

1. Subcultive os osteoblastos primários da calvária¹² ou uma linhagem de células osteoblásticas como Mc3t3-E1 e a placa em frascos T-25 (5 x 10⁵ células/frasco) em α-MEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 0,1 μg/mL de estreptomicina.
   1. Semear 3-4 frascos para cada grupo de tratamento (ou seja, controlo e nocaute genético ou veículo e tratamento farmacológico) para utilização na experiência. Semeie 1-2 frascos adicionais para cada grupo de tratamento para normalizar o número de células ou concentrações de proteínas. Incubar os frascos de cultura numa incubadora de cultura de células humidificada a 37 °C com 5% de CO₂.
2. Cultive as células por 2-3 dias até que os frascos se tornem confluentes. Induza as culturas confluentes a se diferenciarem adicionando 50 μg/mL de ácido ascórbico e 10 mM de fosfato de β-glicerol (ver Tabela de Materiais) aos meios de cultura e continue a cultura por até 14 dias adicionais.
   NOTA: A falta de soro (adicionando 0,5% -1% de FBS) durante a noite é necessária se os tratamentos com fator de crescimento forem planejados. A redução da porcentagem de FBS limita a quantidade de lipídios não radiomarcados na cultura e permite o efeito máximo de fatores de crescimento exógenos. Se os efeitos dos hormônios forem testados, o FBS despojado de carvão é usado.
3. Prepare o papel de filtro, as rolhas de manga de borracha de 15 mm x 30 mm e os poços centrais de polipropileno (ver Tabela de Materiais) no dia anterior ao experimento.
   1. Dobre uma tira de papel de filtro de 1 cm x 10 cm em forma de leque e coloque-a no balde do poço central de polipropileno. Pressione bem o braço do centro de polipropileno através do centro da rolha de manga de borracha e abaixe bem o centro de polipropileno no balão T-25. Em seguida, fechar o balão com a rolha da manga (figura 1).
      NOTA: Pode ser necessário ajustar bem o posicionamento do centro de polipropileno para garantir que ele não entre em contato com o meio de cultura. Durante o experimento, o centro de polipropileno evita que o papel de filtro toque no meio de rotulagem e permite a coleta de ¹⁴CO₂.
4. No dia do experimento, conjugar ácido [^1-14C]-oleico à albumina de soro bovino (BSA) misturando albumina de soro bovino a 20% em solução salina tamponada com fosfato (5 μL por frasco) com 0,1 μCi/mL de ácido [^1-14C]-oleico (0,6 μL/frasco) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   1. Em seguida, coloque o tubo em um tubo cônico de 50 mL e incube a 37 ° C por 30 min com agitação suave. Prepare 1-2 frascos extras para conjugados de ácido oleico-BSA para levar em conta o erro de pipetagem.
5. Remova o meio de cultura do frasco de cultura de tecidos e substitua-o por 1,5 mL de meio de soro fresco (etapa 1.2).
6. Para cada frasco, combinar 5,6 μL de solução de ácido oleico-BSA (etapa 1.4) com 2 μL de solução de carnitina a 100 mM e 1 mL de meio de cultura para produzir uma solução de marcação. Adicione a solução de rotulagem aos frascos de cultura. Mantenha a solução em excesso para ler as contagens totais de atividade adicionadas ao ensaio.
   NOTA: A solução de marcação não é adicionada aos frascos extras destinados a quantificar o número celular ou a concentração de proteínas.
7. Baixar os poços centrais de polipropileno que contêm o papel de filtro no balão e tampá-lo com a rolha de borracha.
   NOTA: É fundamental que o centro de polipropileno não entre em contato com o meio de cultura. Isso levará à contaminação cruzada do papel de filtro com ácido graxo radiomarcado em vez de CO₂.
8. Incubar as culturas celulares durante 3 h a 37 °C com 5% de CO₂.
9. Para coletar ¹⁴CO₂, injete 150 μL de NaOH 1 N no poço central de polipropileno para umedecer o papel de filtro e 200 μL de ácido perclórico 1 M no meio de cultura. Injete o NaOH e o ácido perclórico empurrando uma agulha através da rolha de borracha.
   NOTA: A rolha de borracha não deve ser removida do frasco. Isso pode fazer com que ¹⁴CO₂ escapem. Para facilitar a injeção, mantenha o frasco na posição vertical e retorne à posição de cultura após a conclusão das injeções.
10. Incubar os frascos a 55 °C durante 1 h.
11. Abrir os frascos depois de os arrefecer na coifa de cultura de células. Remova os papéis de filtro dos poços centrais de polipropileno com uma pinça e coloque-os em 3-4 mL de líquido de cintilação (consulte a Tabela de Materiais) em um frasco de cintilação.
    NOTA: 100 μL de excesso de solução de marcação são adicionados a 3-4 mL do líquido de cintilação para medir a contagem total de atividade. 100 μL de meio de cultura basal (sem ácido [^1-14C]-oleico) são adicionados a 3-4 mL de líquido de cintilação para medir a atividade de fundo.
12. Após incubação à temperatura ambiente por 1 h ou durante a noite, medir a radioatividade em contagens por minuto (cpm) usando um contador de cintilação (ver Tabela de Materiais).
13. Para normalizar os resultados do cpm, isole os extratos de proteína dos frascos T-25 não marcados para cada condição de cultura. Lave com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato, adicione 1 mL de tampão de lise celular RIPA a cada frasco e raspe a superfície celular com um raspador de células.
    1. Transfira o tampão RIPA para um tubo de microcentrífuga com uma pipeta e centrifugue a 19.000 x g por 20 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante com uma pipeta para um tubo de microcentrífuga fresco e determine a concentração de proteína de acordo com o protocolo de ensaio BCA (ver Tabela de Materiais).
    2. Divida as leituras brutas de cpm do contador de cintilação pela concentração de proteína para obter o cpm normalizado de ¹⁴CO₂ produzido (Tabela 1).
14. Siga os requisitos locais para descartar os frascos de cintilação, materiais de cultura de células, meio, seringas, etc. Descontamine as superfícies de trabalho e realize testes de limpeza de radioatividade de acordo com os requisitos locais.

2. Coleta de metabólitos solúveis em ácido

NOTA: O período de incubação de 3 h usado na etapa 1.8 acima pode não ser tempo suficiente para oxidar todo o ácido [^1-14C] totalmente oleico absorvido pelas células em CO₂. O fluxo na via de oxidação dos ácidos graxos também pode ser avaliado medindo a radioatividade na fração solúvel em ácido.

1. Recolha 1 ml do meio acidificado de cada balão T-25 tratado e transfira-o para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Adicione 60 μL de BSA a 20% e 100 μL de ácido perclórico 16 M.
3. Vórtice e incubar durante a noite a 4 °C.
4. Em seguida, vórtice e centrifugue a 20.000 x g por 30 min a 4 ° C.
5. Adicionar 200 μL do sobrenadante ao líquido de cintilação e medir a actividade (passo 1.12).
6. Normalize as leituras para a concentração de proteínas ou medições de DNA (etapa 1.13.1).

3. Medição da oxidação da glicose ou oxidação de aminoácidos

1. Substitua o ácido oleico marcado com ¹⁴C por glicose marcada com ¹⁴C ou ^{aminoácidos marcados com 14}C para medir a oxidação dessas moléculas de combustível.
2. Prepare as culturas de osteoblastos de acordo com as etapas 1.1-1.2.
3. Para iniciar o experimento, remova o meio de cultura do frasco de cultura de tecidos e substitua-o por 1,5 mL de meio de soro fresco de fome.
4. Prepare uma solução de marcação de 0,6 μCi de glicose marcada com ¹⁴C ou aminoácidos marcados com ¹⁴C em 1 mL de meio de inanição e adicione aos frascos.
5. Execute as etapas 1.6 a 1.13.

Resultados

A atividade enzimática da carnitina palmitoiltransferase-1 (Cpt1) e da carnitina palmitoiltransferase-2 (Cpt2) é necessária para a oxidação mitocondrial de ácidos graxos de cadeia longa. Cpt1 é a enzima limitante da taxa na via metabólica, mas três isoformas (Cpt-1a, Cpt-1b e Cpt-1c) são codificadas em genomas de mamíferos, e a interrupção genética de uma isoforma pode levar à regulação positiva de compensação de outra isoforma¹³. Em contraste, ...

Discussão

O procedimento acima descrito permite a avaliação directa da oxidação dos ácidos gordos, uma vez que as saídas medidas são ¹⁴CO₂ recolhido no papel de filtro embebido em NaOH e metabolitos solúveis em ácido recolhidos após a acidificação da cultura com ácido perclórico. Kits de ensaio disponíveis comercialmente que usam moléculas lipídicas marcadas com fluorescência ou análogos lipídicos podem medir a absorção de lipídios, mas não determinam ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
[1-14C]-Oleic acid	Perkin Elmer	NEC317050UC
15 x 30 mm rubber sleeve stoppers	VWR	89097-542
1 mL syringe	BD precision	309628
25 G needle (25 G x 1 1/2 in)	BD precision	305127
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A4403
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225	Other kits are also suitable
Beckman Scintillation Counter, or equivalent	Beckman Coulter	LS6000SC
Beta-glycerol phosphate	Sigma Aldrich	G6626
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	126609
Carnitine	Sigma Aldrich	C0283
Cellular lysis buffer			The protocol is amenable to typical lysis buffers (i.e. RIPA)
Dissecting forceps			Available from multiple sources
DNA quantification Kit			Available from multiple sources
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Corning	20-030-CV
Fetal Bovine Serum			Available from multiple sources
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL			Available from multiple sources
Minimum Essensial Medium, Alpha modification	Corning	10-022-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Perchloric Acid	Sigma Aldrich	50439
Polypropylene center wells	VWR	72760-048
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S5881
T-25 canted neck tissue culture flask	Corning	430639
Tissue Culture Incubator
Trypsin (0.25%)-EDTA	Gibco	25200056
Ultima Gold (Scintillation solution)	PerkinElmer	6013329
Whatman Chromatography paper	Sigma Aldrich	WHA3030917