Valutazione dell'ossidazione degli acidi grassi in cellule ossee in coltura

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un test per valutare la capacità di ossidazione degli acidi grassi in colture di cellule ossee primarie o di linee cellulari rilevanti.

Abstract

Si prevede che la formazione ossea da parte degli osteoblasti differenzianti richieda un significativo input energetico poiché queste cellule specializzate devono sintetizzare grandi proteine della matrice extracellulare che compongono il tessuto osseo e quindi concentrare gli ioni necessari per la sua mineralizzazione. I dati sulle esigenze metaboliche della formazione ossea stanno emergendo rapidamente. Anche se c'è ancora molto da imparare, si prevede che gli squilibri nel metabolismo intermedio contribuiscano alla malattia scheletrica. Qui, viene delineato un protocollo per valutare la capacità delle cellule osteoblastiche di ossidare ¹⁴acidi grassi marcati con C a ¹⁴CO₂ e metaboliti solubili in acido. Gli acidi grassi rappresentano una riserva ricca di energia che può essere prelevata dalla circolazione dopo l'alimentazione o dopo la loro liberazione dalle riserve di tessuto adiposo. Il test, eseguito in fiasche di coltura tissutale T-25, è utile per lo studio dell'aumento o della perdita di funzione genica sull'utilizzo degli acidi grassi e dell'effetto dei segnali anabolizzanti sotto forma di fattori di crescita o morfogeni necessari per il mantenimento della massa ossea. Vengono inoltre forniti dettagli sulla capacità di adattare il protocollo per valutare l'ossidazione del glucosio o di aminoacidi come la glutammina.

Introduzione

L'osteoblasto, derivato dalle cellule progenitrici presenti nel midollo osseo e nel periostio, è responsabile della sintesi e della secrezione della matrice mineralizzata ricca di collagene che compone il tessuto osseo. Per realizzare questo sforzo energicamente costoso e contribuire al mantenimento per tutta la vita dell'integrità scheletrica, queste cellule specializzate mantengono un abbondante reticolo endoplasmatico ruvido essenziale per sintetizzare le proteine della matrice extracellulare ^1,2 e numerosi mitocondri ad alto potenziale di membrana per raccogliere l'energia chimica necessaria dai substrati di combustibile ^3,4. L'importanza di quest'ultima funzione è esemplificata dalla cessazione della crescita ossea e dallo sviluppo dell'osteopenia ^5,6 associata a deficit energetici come nella restrizione calorica. Stanno emergendo l'identità della fonte di combustibile preferita dall'osteoblasto e i dati sulle esigenze metaboliche dell'osteoblasto durante la differenziazione o in risposta alla segnalazione anabolica ^7,8.

Gli acidi grassi a catena lunga rappresentano un ricco apporto di energia chimica presente nel siero e rilasciata dal tessuto adiposo in risposta a un ridotto apporto calorico o a un aumento del dispendio energetico. Dopo aver attraversato la membrana cellulare e aver legato al coenzima A per aumentare la solubilità, gli acil-CoA grassi vengono trasportati nella matrice mitocondriale dai doppi enzimi carnitina palmitoiltransferasi sulle membrane mitocondriali esterne ed interne e dalla carnitina-acilcarnitina translocasi⁷. All'interno della matrice mitocondriale, la catena del macchinario di β-ossidazione accorcia l'acil-CoA in un processo a 4 fasi che genera acetil-CoA che entra nel ciclo TCA (ciclo dell'acido tricarbossilico) e negli equivalenti riducenti. Il catabolismo del palmitato (C₁₆), l'acido grasso più comune negli animali, attraverso questa via produce ~131 ATP, sostanzialmente più del ~38 ATP generato dall'ossidazione del glucosio⁷.

Studi di tracciamento con lipidi radiomarcati hanno indicato che l'osso assorbe una frazione significativa dei lipidi circolanti ^9,10, mentre l'ablazione genetica di enzimi critici per il catabolismo lipidico porta a una riduzione dell'attività degli osteoblasti e alla perdita ossea ^9,11. Il protocollo qui presentato utilizza un acido grasso marcato ^{con 14}C per valutare la capacità degli osteoblasti in coltura di metabolizzare completamente gli acidi grassi in CO₂ o metaboliti solubili in acido, che rappresentano passaggi intermedi nel processo di ossidazione. Sebbene sia richiesto l'uso della radioattività, il metodo è semplice, richiede un investimento limitato ed è adattabile a beneficio di altri metaboliti radiomarcati e tipi di cellule.

Protocollo

Questo protocollo utilizza la conversione dell'acido [^1-14C]-oleico in ¹⁴CO₂ come indicatore della capacità di ossidazione degli acidi grassi. L'ufficio locale per la sicurezza dalle radiazioni ha approvato il protocollo per l'utilizzo di materiali radioattivi prima di iniziare gli esperimenti. Tutte le procedure di radiazione sono state eseguite dietro uno schermo di plexiglass utilizzando adeguati dispositivi di protezione individuale. Il Comitato locale per la cura e l'uso degli animali ha approvato il protocollo prima di utilizzare le cellule primarie.

1. Ossidazione degli acidi grassi in osteoblasti in coltura

1. Sottocoltura degli osteoblasti calvari primari¹² o di una linea cellulare osteoblastica come Mc3t3-E1 e piastra in fiasche T-25 (5 x 10⁵ cellule/fiaschetta) in α-MEM contenente il 10% di siero fetale bovino, 100 U/mL di penicillina e 0,1 μg/mL di streptomicina.
   1. Seme 3-4 fiasche per ogni gruppo di trattamento (ad esempio, controllo e knockout genico o veicolo e trattamento farmacologico) da utilizzare nell'esperimento. Seminare 1-2 fiasche aggiuntive per ciascun gruppo di trattamento per normalizzare il numero di cellule o le concentrazioni proteiche. Incubare i palloni di coltura in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 °C con CO₂ al 5%.
2. Coltivare le cellule per 2-3 giorni fino a quando i palloni diventano confluenti. Indurre le colture confluenti a differenziarsi aggiungendo 50 μg/mL di acido ascorbico e 10 mM di β-glicerolo fosfato (vedere la Tabella dei materiali) ai terreni di coltura e continuare la coltura per un massimo di 14 giorni aggiuntivi.
   NOTA: La fame sierica (con l'aggiunta dello 0,5%-1% di FBS) durante la notte è necessaria se sono pianificati trattamenti con fattori di crescita. L'abbassamento della percentuale di FBS limita la quantità di lipidi non radiomarcati nella coltura e consente l'effetto massimo dei fattori di crescita esogeni. Se gli effetti degli ormoni devono essere testati, viene utilizzato l'FBS spogliato del carbone.
3. Preparare la carta da filtro, i tappi del manicotto di gomma da 15 mm x 30 mm e i pozzetti centrali in polipropilene (vedi Tabella dei materiali) il giorno prima dell'esperimento.
   1. Piega una striscia di carta da filtro di 1 cm x 10 cm a forma di ventaglio e posizionala nel secchio del pozzetto centrale in polipropilene. Premere bene il braccio del centro in polipropilene attraverso il centro del tappo del manicotto in gomma e abbassare bene il centro in polipropilene nel pallone T-25. Quindi sigillare il pallone con il tappo a manicotto (Figura 1).
      NOTA: Potrebbe essere necessario regolare bene il posizionamento del centro in polipropilene per assicurarsi che non entri in contatto con il terreno di coltura. Durante l'esperimento, il pozzetto centrale in polipropilene impedisce alla carta da filtro di toccare il mezzo di etichettatura e consente la raccolta di ¹⁴CO₂.
4. Il giorno dell'esperimento, coniugare l'acido [^1-14C]-oleico con l'albumina sierica bovina (BSA) mescolando il 20% di albumina sierica bovina in soluzione salina tamponata con fosfato (5 μL per pallone) con 0,1 μCi/mL di acido [^1-14C]-oleico (0,6 μL/pallone) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
   1. Quindi posizionare la provetta in una provetta conica da 50 mL e incubare a 37 °C per 30 minuti agitando delicatamente. Preparare 1-2 flaconi extra per i coniugati acido oleico-BSA per tenere conto dell'errore di pipettaggio.
5. Rimuovere il terreno di coltura dal pallone di coltura tissutale e sostituirlo con 1,5 mL di terreno di prova per la carenza di siero fresco (fase 1.2).
6. Per ogni pallone, combinare 5,6 μL di soluzione di acido oleico-BSA (fase 1.4) con 2 μL di soluzione di carnitina 100 mM e 1 mL di terreno di coltura per produrre una soluzione di marcatura. Aggiungere la soluzione di etichettatura ai matracci di coltura. Conservare la soluzione in eccesso per leggere i conteggi totali dell'attività aggiunti al saggio.
   NOTA: La soluzione di marcatura non viene aggiunta ai flaconi supplementari destinati a quantificare il numero cellulare o la concentrazione di proteine.
7. Abbassare i pozzetti centrali in polipropilene contenenti la carta da filtro nel pallone e poi tapparlo con il tappo di gomma.
   NOTA: È fondamentale che il pozzetto centrale in polipropilene non entri in contatto con il terreno di coltura. Ciò porterà alla contaminazione incrociata della carta da filtro con acido grasso radiomarcato anziché con CO₂.
8. Incubare le colture cellulari per 3 ore a 37 °C con CO₂ al 5%.
9. Per raccogliere ¹⁴CO₂, iniettare 150 μl di NaOH 1 N nel pozzetto centrale del polipropilene per bagnare la carta da filtro e 200 μl di acido perclorico 1 M nel terreno di coltura. Iniettare il NaOH e l'acido perclorico spingendo un ago attraverso il tappo di gomma.
   NOTA: Il tappo di gomma non deve essere rimosso dal pallone. Ciò potrebbe causare la fuoriuscita di ¹⁴CO₂ . Per facilitare l'iniezione, tenere il matraccio in posizione verticale e poi tornare in posizione di coltura al termine delle iniezioni.
10. Incubare i matracci a 55 °C per 1 ora.
11. Aprire i palloni dopo averli raffreddati nella cappa di coltura cellulare. Rimuovere la carta da filtro dai pozzetti centrali in polipropilene con una pinzetta e metterla in 3-4 ml di liquido di scintillazione (vedi Tabella dei materiali) in una fiala di scintillazione.
    NOTA: 100 μL di soluzione di marcatura in eccesso vengono aggiunti a 3-4 mL del liquido di scintillazione per misurare la conta totale dell'attività. 100 μL di terreno di coltura basale (senza acido [^1-14C]-oleico) vengono aggiunti a 3-4 mL di liquido di scintillazione per misurare l'attività di fondo.
12. Dopo l'incubazione a temperatura ambiente per 1 ora o durante la notte, misurare la radioattività in conteggi al minuto (cpm) utilizzando un contatore a scintillazione (vedi Tabella dei materiali).
13. Per normalizzare i risultati del cpm, isolare gli estratti proteici dai flaconi T-25 non marcati per ogni condizione di coltura. Lavare con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato, aggiungere 1 mL di tampone di lisi cellulare RIPA a ciascun pallone e raschiare la superficie cellulare con un raschietto cellulare.
    1. Trasferire il tampone RIPA in una provetta da microcentrifuga con una pipetta e centrifugare a 19.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante con una pipetta in una nuova provetta da microcentrifuga e determinare la concentrazione proteica secondo il protocollo del dosaggio BCA (vedere la Tabella dei materiali).
    2. Dividere il cpm grezzo letto dal contatore a scintillazione per la concentrazione proteica per ottenere il cpm normalizzato di ¹⁴CO₂ prodotto (Tabella 1).
14. Seguire i requisiti locali per smaltire le fiale di scintillazione, i materiali per colture cellulari, il terreno, le siringhe, ecc. Decontaminare le superfici di lavoro ed eseguire test di pulizia radioattiva secondo i requisiti locali.

2. Raccolta di metaboliti solubili in acido

NOTA: Il periodo di incubazione di 3 ore utilizzato al punto 1.8 potrebbe non essere sufficiente per ossidare tutto l'acido completamente oleico [^1-14C] assorbito dalle cellule in CO₂. Il flusso nella via di ossidazione degli acidi grassi può essere valutato anche misurando la radioattività nella frazione acido-solubile.

1. Raccogliere 1 mL di terreno acidificato da ciascun pallone T-25 trattato e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
2. Aggiungere 60 μl di BSA al 20% e 100 μl di acido perclorico 16 M.
3. Agitare e incubare per una notte a 4 °C.
4. Successivamente, agitare e centrifugare a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C.
5. Aggiungere 200 μl di surnatante al liquido di scintillazione e misurare l'attività (passaggio 1.12).
6. Normalizza le letture della concentrazione proteica o delle misurazioni del DNA (passaggio 1.13.1).

3. Misurazione dell'ossidazione del glucosio o dell'ossidazione degli amminoacidi

1. Sostituire l'acido oleico ¹⁴marcato con C con ^{glucosio 14}marcato C o ¹⁴amminoacidi marcati con C per misurare l'ossidazione di queste molecole di carburante.
2. Preparare le colture di osteoblasti secondo i passaggi 1.1-1.2.
3. Per avviare l'esperimento, rimuovere il terreno di coltura dal pallone di coltura tissutale e sostituirlo con 1,5 ml di terreno di prova di siero fresco.
4. Preparare una soluzione di marcatura di 0,6 μCi di ¹⁴glucosio marcato con C o ¹⁴amminoacidi marcati con C in 1 mL di terreno di digiuno e aggiungere ai flaconi.
5. Eseguire i passaggi 1.6-1.13.

Risultati

L'attività enzimatica sia della carnitina palmitoiltransferasi-1 (Cpt1) che della carnitina palmitoiltransferasi-2 (Cpt2) è necessaria per l'ossidazione mitocondriale degli acidi grassi a catena lunga. Cpt1 è l'enzima limitante la velocità nella via metabolica, ma tre isoforme (Cpt-1a, Cpt-1b e Cpt-1c) sono codificate nei genomi dei mammiferi e la distruzione genetica di un'isoforma può portare alla sovraregolazione della compensazione di un'altra isoforma¹³....

Discussione

La procedura sopra descritta consente la valutazione diretta dell'ossidazione degli acidi grassi, poiché i risultati misurati sono ¹⁴CO₂ raccolti sulla carta da filtro imbevuta di NaOH e metaboliti solubili in acido raccolti dopo l'acidificazione della coltura con acido perclorico. I kit di saggi disponibili in commercio che utilizzano molecole lipidiche marcate in fluorescenza o analoghi lipidici possono misurare l'assorbimento dei lipidi, ma non determinano il ca...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
[1-14C]-Oleic acid	Perkin Elmer	NEC317050UC
15 x 30 mm rubber sleeve stoppers	VWR	89097-542
1 mL syringe	BD precision	309628
25 G needle (25 G x 1 1/2 in)	BD precision	305127
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A4403
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225	Other kits are also suitable
Beckman Scintillation Counter, or equivalent	Beckman Coulter	LS6000SC
Beta-glycerol phosphate	Sigma Aldrich	G6626
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	126609
Carnitine	Sigma Aldrich	C0283
Cellular lysis buffer			The protocol is amenable to typical lysis buffers (i.e. RIPA)
Dissecting forceps			Available from multiple sources
DNA quantification Kit			Available from multiple sources
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Corning	20-030-CV
Fetal Bovine Serum			Available from multiple sources
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL			Available from multiple sources
Minimum Essensial Medium, Alpha modification	Corning	10-022-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Perchloric Acid	Sigma Aldrich	50439
Polypropylene center wells	VWR	72760-048
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S5881
T-25 canted neck tissue culture flask	Corning	430639
Tissue Culture Incubator
Trypsin (0.25%)-EDTA	Gibco	25200056
Ultima Gold (Scintillation solution)	PerkinElmer	6013329
Whatman Chromatography paper	Sigma Aldrich	WHA3030917