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Method Article
Il presente protocollo descrive un test per valutare la capacità di ossidazione degli acidi grassi in colture di cellule ossee primarie o di linee cellulari rilevanti.
Si prevede che la formazione ossea da parte degli osteoblasti differenzianti richieda un significativo input energetico poiché queste cellule specializzate devono sintetizzare grandi proteine della matrice extracellulare che compongono il tessuto osseo e quindi concentrare gli ioni necessari per la sua mineralizzazione. I dati sulle esigenze metaboliche della formazione ossea stanno emergendo rapidamente. Anche se c'è ancora molto da imparare, si prevede che gli squilibri nel metabolismo intermedio contribuiscano alla malattia scheletrica. Qui, viene delineato un protocollo per valutare la capacità delle cellule osteoblastiche di ossidare 14acidi grassi marcati con C a 14CO2 e metaboliti solubili in acido. Gli acidi grassi rappresentano una riserva ricca di energia che può essere prelevata dalla circolazione dopo l'alimentazione o dopo la loro liberazione dalle riserve di tessuto adiposo. Il test, eseguito in fiasche di coltura tissutale T-25, è utile per lo studio dell'aumento o della perdita di funzione genica sull'utilizzo degli acidi grassi e dell'effetto dei segnali anabolizzanti sotto forma di fattori di crescita o morfogeni necessari per il mantenimento della massa ossea. Vengono inoltre forniti dettagli sulla capacità di adattare il protocollo per valutare l'ossidazione del glucosio o di aminoacidi come la glutammina.
L'osteoblasto, derivato dalle cellule progenitrici presenti nel midollo osseo e nel periostio, è responsabile della sintesi e della secrezione della matrice mineralizzata ricca di collagene che compone il tessuto osseo. Per realizzare questo sforzo energicamente costoso e contribuire al mantenimento per tutta la vita dell'integrità scheletrica, queste cellule specializzate mantengono un abbondante reticolo endoplasmatico ruvido essenziale per sintetizzare le proteine della matrice extracellulare 1,2 e numerosi mitocondri ad alto potenziale di membrana per raccogliere l'energia chimica necessaria dai substrati di combustibile 3,4. L'importanza di quest'ultima funzione è esemplificata dalla cessazione della crescita ossea e dallo sviluppo dell'osteopenia 5,6 associata a deficit energetici come nella restrizione calorica. Stanno emergendo l'identità della fonte di combustibile preferita dall'osteoblasto e i dati sulle esigenze metaboliche dell'osteoblasto durante la differenziazione o in risposta alla segnalazione anabolica 7,8.
Gli acidi grassi a catena lunga rappresentano un ricco apporto di energia chimica presente nel siero e rilasciata dal tessuto adiposo in risposta a un ridotto apporto calorico o a un aumento del dispendio energetico. Dopo aver attraversato la membrana cellulare e aver legato al coenzima A per aumentare la solubilità, gli acil-CoA grassi vengono trasportati nella matrice mitocondriale dai doppi enzimi carnitina palmitoiltransferasi sulle membrane mitocondriali esterne ed interne e dalla carnitina-acilcarnitina translocasi7. All'interno della matrice mitocondriale, la catena del macchinario di β-ossidazione accorcia l'acil-CoA in un processo a 4 fasi che genera acetil-CoA che entra nel ciclo TCA (ciclo dell'acido tricarbossilico) e negli equivalenti riducenti. Il catabolismo del palmitato (C16), l'acido grasso più comune negli animali, attraverso questa via produce ~131 ATP, sostanzialmente più del ~38 ATP generato dall'ossidazione del glucosio7.
Studi di tracciamento con lipidi radiomarcati hanno indicato che l'osso assorbe una frazione significativa dei lipidi circolanti 9,10, mentre l'ablazione genetica di enzimi critici per il catabolismo lipidico porta a una riduzione dell'attività degli osteoblasti e alla perdita ossea 9,11. Il protocollo qui presentato utilizza un acido grasso marcato con 14C per valutare la capacità degli osteoblasti in coltura di metabolizzare completamente gli acidi grassi in CO2 o metaboliti solubili in acido, che rappresentano passaggi intermedi nel processo di ossidazione. Sebbene sia richiesto l'uso della radioattività, il metodo è semplice, richiede un investimento limitato ed è adattabile a beneficio di altri metaboliti radiomarcati e tipi di cellule.
Questo protocollo utilizza la conversione dell'acido [1-14C]-oleico in 14CO2 come indicatore della capacità di ossidazione degli acidi grassi. L'ufficio locale per la sicurezza dalle radiazioni ha approvato il protocollo per l'utilizzo di materiali radioattivi prima di iniziare gli esperimenti. Tutte le procedure di radiazione sono state eseguite dietro uno schermo di plexiglass utilizzando adeguati dispositivi di protezione individuale. Il Comitato locale per la cura e l'uso degli animali ha approvato il protocollo prima di utilizzare le cellule primarie.
1. Ossidazione degli acidi grassi in osteoblasti in coltura
2. Raccolta di metaboliti solubili in acido
NOTA: Il periodo di incubazione di 3 ore utilizzato al punto 1.8 potrebbe non essere sufficiente per ossidare tutto l'acido completamente oleico [1-14C] assorbito dalle cellule in CO2. Il flusso nella via di ossidazione degli acidi grassi può essere valutato anche misurando la radioattività nella frazione acido-solubile.
3. Misurazione dell'ossidazione del glucosio o dell'ossidazione degli amminoacidi
L'attività enzimatica sia della carnitina palmitoiltransferasi-1 (Cpt1) che della carnitina palmitoiltransferasi-2 (Cpt2) è necessaria per l'ossidazione mitocondriale degli acidi grassi a catena lunga. Cpt1 è l'enzima limitante la velocità nella via metabolica, ma tre isoforme (Cpt-1a, Cpt-1b e Cpt-1c) sono codificate nei genomi dei mammiferi e la distruzione genetica di un'isoforma può portare alla sovraregolazione della compensazione di un'altra isoforma13....
La procedura sopra descritta consente la valutazione diretta dell'ossidazione degli acidi grassi, poiché i risultati misurati sono 14CO2 raccolti sulla carta da filtro imbevuta di NaOH e metaboliti solubili in acido raccolti dopo l'acidificazione della coltura con acido perclorico. I kit di saggi disponibili in commercio che utilizzano molecole lipidiche marcate in fluorescenza o analoghi lipidici possono misurare l'assorbimento dei lipidi, ma non determinano il ca...
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Questo lavoro è stato supportato da un Merit Review Award dal Biomedical Laboratory Research and Development Service del Veterans Affairs Office of Research and Development (BX003724) e da una sovvenzione del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (DK099134).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
[1-14C]-Oleic acid | Perkin Elmer | NEC317050UC | |
15 x 30 mm rubber sleeve stoppers | VWR | 89097-542 | |
1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
25 G needle (25 G x 1 1/2 in) | BD precision | 305127 | |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | Other kits are also suitable |
Beckman Scintillation Counter, or equivalent | Beckman Coulter | LS6000SC | |
Beta-glycerol phosphate | Sigma Aldrich | G6626 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 126609 | |
Carnitine | Sigma Aldrich | C0283 | |
Cellular lysis buffer | The protocol is amenable to typical lysis buffers (i.e. RIPA) | ||
Dissecting forceps | Available from multiple sources | ||
DNA quantification Kit | Available from multiple sources | ||
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Corning | 20-030-CV | |
Fetal Bovine Serum | Available from multiple sources | ||
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Available from multiple sources | ||
Minimum Essensial Medium, Alpha modification | Corning | 10-022-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Perchloric Acid | Sigma Aldrich | 50439 | |
Polypropylene center wells | VWR | 72760-048 | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
T-25 canted neck tissue culture flask | Corning | 430639 | |
Tissue Culture Incubator | |||
Trypsin (0.25%)-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
Whatman Chromatography paper | Sigma Aldrich | WHA3030917 |
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