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Method Article
본 프로토콜은 일차 뼈 세포 또는 관련 세포주의 배양에서 지방산 산화 능력을 평가하기 위한 분석을 설명합니다.
조골세포를 분화하여 뼈를 형성하려면 이러한 특수 세포가 뼈 조직을 구성하는 큰 세포외 기질 단백질을 합성한 다음 광물화에 필요한 이온을 농축해야 하기 때문에 상당한 에너지 입력이 필요할 것으로 예상됩니다. 뼈 형성에 필요한 대사 요건에 대한 데이터가 빠르게 등장하고 있습니다. 아직 밝혀야 할 점이 많지만, 중간 신진대사의 혼란이 골격계 질환의 원인이 될 것으로 예상됩니다. 여기에서는 14개의 C 표지 지방산을 14개의CO2 및 산용해성 대사 산물로 산화하는 조골세포 세포의 능력을 평가하기 위한 프로토콜이 요약되어 있습니다. 지방산은 섭식 후 또는 지방 조직 저장에서 해방된 후 순환계에서 흡수될 수 있는 풍부한 에너지 비축량을 나타냅니다. T-25 조직 배양 플라스크에서 수행된 이 분석은 지방산 이용에 대한 유전자 이득 또는 기능 상실 및 골량 유지에 필요한 성장 인자 또는 모르포겐 형태의 동화 신호의 영향에 대한 연구에 도움이 됩니다. 글루타민과 같은 아미노산 또는 포도당의 산화를 평가하기 위해 프로토콜을 조정하는 능력에 대한 세부 정보도 제공됩니다.
골수와 골막에 존재하는 전구 세포에서 유래한 조골세포(osteoblast)는 뼈 조직을 구성하는 미네랄화된 콜라겐이 풍부한 기질의 합성과 분비를 담당합니다. 이러한 에너지 비용이 많이 드는 노력을 완수하고 골격 무결성의 평생 유지에 기여하기 위해 이러한 특수 세포는 세포 외 기질 단백질 1,2 및 연료 기질에서 필요한 화학 에너지를 수확하기 위해 수많은 높은 막 전위 미토콘드리아를 합성하는 데 필수적인 풍부한 거친 소포체를 유지합니다 3,4. 이 후자의 기능의 중요성은 뼈 성장의 중단과 칼로리 제한과 같은 에너지 결핍과 관련된 골감소증 5,6의 발달에 의해 예시됩니다. 조골세포가 선호하는 연료원의 정체와 분화 중 또는 동화 신호에 대한 반응으로 조골세포의 대사 요구 사항에 대한 데이터가 부상하고 있습니다 7,8.
장쇄 지방산은 혈청에 존재하며 칼로리 섭취 감소 또는 에너지 소비 증가에 대한 반응으로 지방 조직에서 방출되는 화학 에너지의 풍부한 공급을 나타냅니다. 용해도를 높이기 위해 세포막을 통과하고 코엔자임 A와 결찰한 후, 지방 아실-CoA는 외부 및 내부 미토콘드리아 막의 이중 카르니틴 팔미토일전이효소와 카르니틴-아실카르니틴 트랜스전로카제7에 의해 미토콘드리아 기질로 왕복됩니다. 미토콘드리아 매트릭스 내에서 β 산화 기계 사슬은 TCA 회로(트리카르복실산 회로)에 진입하고 등가물을 환원시키는 아세틸-CoA를 생성하는 4단계 공정에서 아실-CoA를 단축합니다. 동물에서 가장 흔한 지방산인 팔미테이트(C16)의 이화작용은 이 경로를 통해 ~131 ATP를 산출하며, 이는 포도당 산화에 의해 생성된 ~38 ATP보다 훨씬 더 많습니다7.
방사선 표지된 지질을 사용한 추적 연구는 뼈가 순환 지질의 상당한 부분을 차지하는 것으로 나타났습니다 9,10 지질 이화작용에 중요한 효소의 유전적 절제는 조골세포 활성과 뼈 손실의 감소로 이어집니다 9,11. 여기에 제시된 프로토콜은 14개의 C-표지 지방산을 사용하여 배양된 조골세포가 지방산을 산화 과정의 중간 단계를 나타내는 CO2 또는 산 용해성 대사 산물로 완전히 대사하는 능력을 평가합니다. 방사능의 사용이 필요하지만, 이 방법은 간단하고 투자가 제한적이며, 다른 방사성 표지 대사 산물 및 세포 유형의 이점에 적용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 [1-14C]-올레산을 14CO2 로 변환하는 것을 지방산 산화 용량의 지표로 사용합니다. 지역 방사선 안전 사무소는 실험을 시작하기 전에 방사성 물질 사용에 대한 프로토콜을 승인했습니다. 모든 방사선 절차는 플렉시글라스 차폐 뒤에서 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행되었습니다. 지역 동물 관리 및 사용 위원회(Local Animal Care and Use Committee)는 일차 세포를 사용하기 전에 프로토콜을 승인했습니다.
1. 배양된 조골세포의 지방산 산화
2. 산 녹는 대사 산물 수집
알림: 위의 1.8단계에서 사용된 3시간의 배양 기간은 세포가 흡수한 모든 [1-14C] 완전 올레산을 CO2로 산화시키기에 충분한 시간이 아닐 수 있습니다. 지방산 산화 경로의 플럭스는 산 용해성 분획의 방사능을 측정하여 평가할 수도 있습니다.
3. 포도당 산화 또는 아미노산 산화의 측정
카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-1(Cpt1)과 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-2(Cpt2)의 효소 활성은 미토콘드리아 장쇄 지방산 산화에 필요합니다. Cpt1은 대사 경로의 속도 제한 효소이지만 포유류 게놈에는 세 가지 동형(Cpt-1a, Cpt-1b 및 Cpt-1c)이 암호화되어 있으며 한 동형의 유전적 파괴는 다른 동형의 보상 상향 조절로 이어질 수 있습니다13. 대조적으로, Cpt2...
위에서 설명한 절차는 측정 된 출력이 NaOH에 담근 여과지에 수집 된 14CO2 및 과염소산으로 배양액의 산성화 후 수집 된 산 용해성 대사 산물이므로 지방산 산화를 직접 평가할 수 있습니다. 형광 표지된 지질 분자 또는 지질 유사체를 사용하는 시판되는 분석 키트는 지질 흡수를 측정할 수 있지만 에너지 생성을 위한 이화작용은 측정하지 않습니다. 13
저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.
이 연구는 재향 군인 사무국 연구 개발국(BX003724)의 생물의학 실험실 연구 개발 서비스(Biomedical Laboratory Research and Development Service)의 Merit Review Award와 미국 국립 당뇨병, 소화기 및 신장 질환 연구소(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, DK099134)의 보조금으로 지원되었습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
[1-14C]-Oleic acid | Perkin Elmer | NEC317050UC | |
15 x 30 mm rubber sleeve stoppers | VWR | 89097-542 | |
1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
25 G needle (25 G x 1 1/2 in) | BD precision | 305127 | |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | Other kits are also suitable |
Beckman Scintillation Counter, or equivalent | Beckman Coulter | LS6000SC | |
Beta-glycerol phosphate | Sigma Aldrich | G6626 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 126609 | |
Carnitine | Sigma Aldrich | C0283 | |
Cellular lysis buffer | The protocol is amenable to typical lysis buffers (i.e. RIPA) | ||
Dissecting forceps | Available from multiple sources | ||
DNA quantification Kit | Available from multiple sources | ||
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Corning | 20-030-CV | |
Fetal Bovine Serum | Available from multiple sources | ||
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Available from multiple sources | ||
Minimum Essensial Medium, Alpha modification | Corning | 10-022-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Perchloric Acid | Sigma Aldrich | 50439 | |
Polypropylene center wells | VWR | 72760-048 | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
T-25 canted neck tissue culture flask | Corning | 430639 | |
Tissue Culture Incubator | |||
Trypsin (0.25%)-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
Whatman Chromatography paper | Sigma Aldrich | WHA3030917 |
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