Évaluation de l’oxydation des acides gras dans des cellules osseuses en culture

Résumé

Le présent protocole décrit un essai permettant d’évaluer la capacité d’oxydation des acides gras dans des cultures de cellules osseuses primaires ou de lignées cellulaires pertinentes.

Résumé

La formation osseuse par différenciation des ostéoblastes devrait nécessiter un apport énergétique important, car ces cellules spécialisées doivent synthétiser de grandes protéines de la matrice extracellulaire qui composent le tissu osseux, puis concentrer les ions nécessaires à sa minéralisation. Les données sur les besoins métaboliques de la formation osseuse émergent rapidement. Bien qu’il reste encore beaucoup à apprendre, on s’attend à ce que des troubles dans le métabolisme intermédiaire contribuent aux maladies squelettiques. Ici, un protocole est décrit pour évaluer la capacité des cellules ostéoblastiques à oxyder ¹⁴acides gras marqués au carbone en ¹⁴CO₂ et en métabolites solubles dans l’acide. Les acides gras représentent une riche réserve d’énergie qui peut être prélevée dans la circulation après l’alimentation ou après leur libération des réserves de tissu adipeux. Le dosage, réalisé dans des flacons de culture tissulaire T-25, est utile pour l’étude du gain ou de la perte de fonction génique sur l’utilisation des acides gras et de l’effet des signaux anabolisants sous forme de facteurs de croissance ou de morphogènes nécessaires au maintien de la masse osseuse. Des détails sur la capacité d’adapter le protocole pour évaluer l’oxydation du glucose ou des acides aminés comme la glutamine sont également fournis.

Introduction

L’ostéoblaste, dérivé des cellules progénitrices présentes dans la moelle osseuse et le périoste, est responsable de la synthèse et de la sécrétion de la matrice minéralisée et riche en collagène qui compose le tissu osseux. Pour réaliser cette entreprise énergétiquement coûteuse et contribuer au maintien de l’intégrité squelettique tout au long de la vie, ces cellules spécialisées maintiennent un réticulum endoplasmique rugueux abondant essentiel à la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire ^1,2 et de nombreuses mitochondries à haut potentiel membranaire pour récolter l’énergie chimique requise à partir des substrats de carburant ^3,4. L’importance de cette dernière fonction est illustrée par l’arrêt de la croissance osseuse et le développement de l’ostéopénie ^5,6 associée à des déficits énergétiques comme dans la restriction calorique. L’identité de la source de carburant préférée de l’ostéoblaste et les données sur les besoins métaboliques de l’ostéoblaste lors de la différenciation ou en réponse à la signalisation anabolique sont en train d’émerger ^7,8.

Les acides gras à longue chaîne représentent une riche source d’énergie chimique présente dans le sérum et libérée par le tissu adipeux en réponse à une réduction de l’apport calorique ou à une dépense énergétique accrue. Après avoir traversé la membrane cellulaire et s’être ligaturée à la coenzyme A pour augmenter la solubilité, les acyl-CoA gras sont transportés dans la matrice mitochondriale par les enzymes doubles carnitine palmitoyltransférase sur les membranes mitochondriales externe et interne et la carnitine-acylcarnitine translocase⁷. Au sein de la matrice mitochondriale, la chaîne de machinerie de β-oxydation raccourcit l’acyl-CoA dans un processus en 4 étapes qui génère de l’acétyl-CoA qui entre dans le cycle TCA (cycle de l’acide tricarboxylique) et des équivalents réducteurs. Le catabolisme du palmitate (C₁₆), les acides gras les plus courants chez les animaux, par cette voie, donne ~131 ATP, nettement plus que les ~38 ATP générés par l’oxydation du glucose⁷.

Des études de traçage utilisant des lipides radiomarqués ont indiqué que l’os absorbe une fraction significative des lipides circulants ^9,10, tandis que l’ablation génétique des enzymes essentielles au catabolisme des lipides entraîne une réduction de l’activité des ostéoblastes et une perte osseuse ^9,11. Le protocole présenté ici utilise un acide gras marqué au ^{carbone 14}pour évaluer la capacité des ostéoblastes en culture à métaboliser complètement les acides gras en CO₂ ou en métabolites solubles dans l’acide, qui représentent des étapes intermédiaires dans le processus d’oxydation. Bien que l’utilisation de la radioactivité soit requise, la méthode est simple, nécessite un investissement limité et est adaptable au profit d’autres métabolites radiomarqués et de types de cellules.

Protocole

Ce protocole utilise la conversion de l’acide [^1-14C]-oléique en ¹⁴CO₂ comme indicateur de la capacité d’oxydation des acides gras. Le bureau local de radioprotection a approuvé le protocole d’utilisation des matières radioactives avant de commencer les expériences. Toutes les procédures de radiothérapie ont été effectuées derrière un écran en plexiglas à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié. Le comité local de protection et d’utilisation des animaux a approuvé le protocole avant d’utiliser les cellules primaires.

1. L’oxydation des acides gras dans les ostéoblastes en culture

1. Sous-culture des ostéoblastes calvaires primaires¹² ou d’une lignée cellulaire ostéoblastique comme Mc3t3-E1, et plaque dans des flacons T-25 (5 x 10⁵ cellules/flacon) dans un α-MEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 0,1 μg/mL de streptomycine.
   1. Semez 3 à 4 fioles pour chaque groupe de traitement (c.-à-d. témoin et knock-out génique ou traitement véhiculaire et pharmacologique) pour utilisation dans l’expérience. Ensemencez 1 à 2 flacons supplémentaires pour chaque groupe de traitement afin de normaliser le nombre de cellules ou les concentrations en protéines. Incuber les flacons de culture dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂.
2. Cultivez les cellules pendant 2-3 jours jusqu’à ce que les flacons deviennent confluents. Induire la différenciation des cultures confluentes en ajoutant 50 μg/mL d’acide ascorbique et 10 mM de phosphate de β-glycérol (voir le tableau des matières) dans le milieu de culture et poursuivre la culture jusqu’à 14 jours supplémentaires.
   REMARQUE : Une famine sérique (ajout de 0,5 % à 1 % FBS) pendant la nuit est nécessaire si des traitements par facteur de croissance sont prévus. La réduction du pourcentage de FBS limite la quantité de lipides non radiomarqués dans la culture et permet l’effet maximal des facteurs de croissance exogènes. Si les effets des hormones doivent être testés, on utilise du FBS décapé de charbon de bois.
3. Préparez le papier filtre, les bouchons de manchon en caoutchouc de 15 mm x 30 mm et les puits centraux en polypropylène (voir le tableau des matériaux) la veille de l’expérience.
   1. Pliez une bande de papier filtre de 1 cm x 10 cm en forme d’éventail et placez-la dans le seau du puits central en polypropylène. Appuyez bien sur le bras du centre en polypropylène à travers le centre du bouchon du manchon en caoutchouc et abaissez bien le centre en polypropylène dans la fiole T-25. Fermez ensuite le ballon à l’aide du bouchon du manchon (figure 1).
      REMARQUE : Il peut être nécessaire de bien ajuster le placement du centre en polypropylène pour s’assurer qu’il n’entre pas en contact avec le milieu de culture. Pendant l’expérience, le puits central en polypropylène empêche le papier filtre de toucher le support d’étiquetage et permet de collecter ¹⁴CO₂.
4. Le jour de l’expérience, conjuguer l’acide [^1-14C]-oléique à l’albumine sérique bovine (BSA) en mélangeant 20 % d’albumine sérique bovine dans une solution saline tamponnée au phosphate (5 μL par flacon) avec 0,1 μCi/mL d’acide [^1-14C]-oléique (0,6 μL/flacon) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
   1. Placez ensuite le tube dans un tube conique de 50 ml et incubez à 37 °C pendant 30 minutes en secouant doucement. Préparez 1 à 2 flacons supplémentaires pour les conjugués Acide oléique-BSA afin de tenir compte des erreurs de pipetage.
5. Retirer le milieu de culture de la fiole de culture tissulaire et le remplacer par 1,5 mL de milieu de sérumologie frais (étape 1.2).
6. Pour chaque fiole, combiner 5,6 μL de solution d’acide oléique-BSA (étape 1.4) avec 2 μL de solution de carnitine 100 mM et 1 mL de milieu de culture pour produire une solution d’étiquetage. Ajouter la solution d’étiquetage dans les flacons de culture. Conservez l’excès de solution pour lire le nombre total d’activités ajoutées au dosage.
   REMARQUE : La solution d’étiquetage n’est pas ajoutée aux fioles supplémentaires destinées à quantifier le nombre cellulaire ou la concentration en protéines.
7. Abaissez les puits centraux en polypropylène contenant le papier filtre dans le ballon, puis couvrez-le avec le bouchon en caoutchouc.
   REMARQUE : Il est essentiel que le puits du centre en polypropylène ne soit pas en contact avec le milieu de culture. Cela entraînera une contamination croisée du papier filtre avec des acides gras radiomarqués au lieu de CO₂.
8. Incuber les cultures cellulaires pendant 3 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
9. Pour recueillir ¹⁴CO₂, injecter 150 μL de 1 N NaOH dans le puits central en polypropylène pour mouiller le papier filtre et 200 μL d’acide perchlorique 1 M dans le milieu de culture. Injectez le NaOH et l’acide perchlorique en enfonçant une aiguille dans le bouchon en caoutchouc.
   REMARQUE : Le bouchon en caoutchouc ne doit pas être retiré de la fiole. Cela peut provoquer une fuite de ¹⁴CO₂ . Pour faciliter l’injection, maintenir le ballon en position verticale, puis revenir en position de culture une fois les injections terminées.
10. Incuber les flacons à 55 °C pendant 1 h.
11. Ouvrez les flacons après les avoir refroidis dans le capot de culture cellulaire. Retirez les papiers-filtres des puits centraux en polypropylène à l’aide d’une pince à épiler et placez-les dans 3 à 4 mL de liquide à scintillation (voir le tableau des matériaux) dans un flacon à scintillation.
    REMARQUE : On ajoute 100 μL d’excès de solution d’étiquetage à 3 ou 4 mL de liquide de scintillation pour mesurer le nombre total d’activités. 100 μL de milieu de culture de base (sans acide oléique [^1-14C]) sont ajoutés à 3-4 mL de liquide à scintillation pour mesurer l’activité de fond.
12. Après une incubation à température ambiante pendant 1 h ou toute la nuit, mesurer la radioactivité en comptages par minute (cpm) à l’aide d’un compteur à scintillation (voir le tableau des matières).
13. Pour normaliser les résultats de la cpm, isolez les extraits de protéines des flacons T-25 non marqués pour chaque condition de culture. Laver avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate, ajouter 1 ml de tampon de lyse cellulaire RIPA dans chaque flacon et gratter la surface cellulaire avec un grattoir cellulaire.
    1. Transférez le tampon RIPA dans un tube de microcentrifugation à l’aide d’une pipette et centrifugez à 19 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Transférez le surnageant à l’aide d’une pipette dans un nouveau tube de microcentrifugation et déterminez la concentration en protéines selon le protocole de dosage de la BCA (voir le tableau des matériaux).
    2. Divisez les lectures de cpm brutes du compteur à scintillation par la concentration en protéines pour obtenir la cpm normalisée de ¹⁴CO₂ produite (tableau 1).
14. Respectez les exigences locales pour éliminer les flacons à scintillation, le matériel de culture cellulaire, le milieu, les seringues, etc. Décontaminer les surfaces de travail et effectuer des tests de radioactivité par essuyage selon les exigences locales.

2. Collecte des métabolites solubles dans l’acide

REMARQUE : La période d’incubation de 3 h utilisée à l’étape 1.8 ci-dessus peut ne pas être suffisante pour oxyder tout l’acide entièrement oléique [^1-14°C] absorbé par les cellules en CO₂. Le flux dans la voie d’oxydation des acides gras peut également être évalué en mesurant la radioactivité dans la fraction soluble dans l’acide.

1. Prélever 1 mL de milieu acidifié dans chaque fiole T-25 traitée et le transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
2. Ajouter 60 μL de BSA à 20 % et 100 μL d’acide perchlorique 16 M.
3. Vortex et incuber toute la nuit à 4 °C.
4. Ensuite, vortex et centrifugeuse à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
5. Ajouter 200 μL de surnageant au liquide à scintillation et mesurer l’activité (étape 1.12).
6. Normalisez les lectures en fonction de la concentration en protéines ou des mesures de l’ADN (étape 1.13.1).

3. Mesure de l’oxydation du glucose ou de l’oxydation des acides aminés

1. Remplacez l’acide oléique ¹⁴marqué au carbone par du glucose marqué au carbone ¹⁴ou des acides aminés marqués au carbone ¹⁴pour mesurer l’oxydation de ces molécules de carburant.
2. Préparez les cultures d’ostéoblastes selon les étapes 1.1-1.2.
3. Pour amorcer l’expérience, retirer le milieu de culture de la fiole de culture tissulaire et le remplacer par 1,5 mL de milieu de privation de sérum frais.
4. Préparez une solution de marquage de 0,6 μCi de glucose marqué au carbone ¹⁴ou d’acides aminés marqués au carbone ¹⁴dans 1 mL de milieu de famine et ajoutez-la dans des flacons.
5. Effectuez les étapes 1.6 à 1.13.

Résultats

L’activité enzymatique de la carnitine palmitoyltransférase-1 (Cpt1) et de la carnitine palmitoyltransférase-2 (Cpt2) est nécessaire à l’oxydation des acides gras mitochondriaux à longue chaîne. Cpt1 est l’enzyme limitant le taux dans la voie métabolique, mais trois isoformes (Cpt-1a, Cpt-1b et Cpt-1c) sont codées dans les génomes de mammifères, et la perturbation génétique d’une isoforme peut conduire à une compensation de régulation à la hausse d’une autre iso...

Discussion

La procédure décrite ci-dessus permet d’évaluer directement l’oxydation des acides gras, car les sorties mesurées sont de ¹⁴CO₂ collectés sur du papier filtre imbibé de NaOH et de métabolites solubles dans l’acide collectés après l’acidification de la culture avec de l’acide perchlorique. Les kits de dosage disponibles dans le commerce qui utilisent des molécules lipidiques marquées par fluorescence ou des analogues lipidiques peuvent mesurer l?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
[1-14C]-Oleic acid	Perkin Elmer	NEC317050UC
15 x 30 mm rubber sleeve stoppers	VWR	89097-542
1 mL syringe	BD precision	309628
25 G needle (25 G x 1 1/2 in)	BD precision	305127
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A4403
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225	Other kits are also suitable
Beckman Scintillation Counter, or equivalent	Beckman Coulter	LS6000SC
Beta-glycerol phosphate	Sigma Aldrich	G6626
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	126609
Carnitine	Sigma Aldrich	C0283
Cellular lysis buffer			The protocol is amenable to typical lysis buffers (i.e. RIPA)
Dissecting forceps			Available from multiple sources
DNA quantification Kit			Available from multiple sources
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Corning	20-030-CV
Fetal Bovine Serum			Available from multiple sources
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL			Available from multiple sources
Minimum Essensial Medium, Alpha modification	Corning	10-022-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Perchloric Acid	Sigma Aldrich	50439
Polypropylene center wells	VWR	72760-048
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S5881
T-25 canted neck tissue culture flask	Corning	430639
Tissue Culture Incubator
Trypsin (0.25%)-EDTA	Gibco	25200056
Ultima Gold (Scintillation solution)	PerkinElmer	6013329
Whatman Chromatography paper	Sigma Aldrich	WHA3030917