JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم عرض ومناقشة تشكيل حزم أكتوميوزين في المختبر وقياس توليد قوة مجموعة الميوسين باستخدام ملاقط بصرية.

Abstract

الميوسينات هي بروتينات حركية تحلل ATP لتخطو على طول مسارات خيوط الأكتين (AF) وهي ضرورية في العمليات الخلوية مثل الحركة وتقلص العضلات. لفهم آليات توليد القوة الخاصة بهم ، تم التحقيق في الميوسين II على مستوى الجزيء الواحد (SM) وكفرق من المحركات في المختبر باستخدام الطرق الفيزيائية الحيوية مثل الاصطياد البصري.

أظهرت هذه الدراسات أن سلوك توليد قوة الميوسين يمكن أن يختلف اختلافا كبيرا عند الانتقال من مستوى الجزيء الواحد في ترتيب ثلاثي الخرز إلى مجموعات من المحركات التي تعمل معا على خرزة صلبة أو سطح غطاء في ترتيب انزلاقي. ومع ذلك ، فإن إنشاءات الفحص هذه لا تسمح بتقييم ديناميكيات مجموعة الميوسين داخل التسلسل الهرمي الهيكلي اللزج المرن كما تفعل داخل الخلية. لقد طورنا طريقة باستخدام ملاقط بصرية للتحقيق في ميكانيكا توليد القوة بواسطة مجموعات الميوسين التي تتفاعل مع خيوط الأكتين المتعددة.

تسهل حزم الأكتوميوس هذه التحقيق في بيئة هرمية ومتوافقة تلتقط الاتصالات الحركية وإخراج قوة المجموعة. تسمح الطبيعة القابلة للتخصيص للفحص بتغيير الظروف التجريبية لفهم كيف تؤدي التعديلات على مجموعة الميوسين أو حزمة خيوط الأكتين أو البيئة المحيطة إلى مخرجات قوة مختلفة.

Introduction

البروتينات الحركية ضرورية للحياة ، وتحويل الطاقة الكيميائية إلى عمل ميكانيكي1،2،3. تتفاعل محركات الميوسين مع خيوط الأكتين عن طريق اتخاذ خطوات على طول الخيوط المشابهة للمسار ، وتقوم ديناميكيات شبكات الأكتين الميوسين بتنفيذ تقلص العضلات ، وحركية الخلية ، وحلقة الانقباض أثناء الحركية الخلوية ، وحركة البضائع داخل الخلية ، من بين المهام الأساسية الأخرى3،4،5،6،7،8 . نظرا لأن الميوسين له العديد من الأدوار الأساسية ، فإن الفشل في وظائف شبكة الميوسين أكتين يمكن أن يؤدي إلى تطور المرض ، مثل الطفرات في سلسلة الميوسين الثقيلة التي تسبب فرط انقباض القلب في اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM) 9,10,11,12,13,14 . في تقلص العضلات ، تتعاون محركات الميوسين الفردية مع بعضها البعض من خلال العمل كمجموعة لتوفير الطاقة الميكانيكية المطلوبة التي تنفذ الانزلاق النسبي للتركيز البؤري التلقائي4،15،16،17،18. تشكل محركات الميوسين جسورا متقاطعة بين الرجفان الأذيني وتستخدم تغيرات متطابقة بسبب دورتها الميكانيكية الكيميائية للتحرك بشكل جماعي نحو الطرف الشائك للخيوط المحاذاة17،18،19،20،21.

وقد سهل تطوير مقايسات الحركة الكمية في المختبر على مستوى SM باستخدام تقنيات مثل الاصطياد البصري جمع تفاصيل غير مسبوقة عن كيفية عمل محركات الميوسين الفردية ، بما في ذلك قياس توليد قوة SM وأحجام الخطوات 22،23،24،25،26،27،28،29،30 . طور Finer et al. اختبار الاصطياد البصري "ثلاثي الخرز" أو "الدمبل" للتحقيق في ميكانيكا توليد القوة لمحركات myosin II المفردة23,31. نظرا لأن myosin II العضلي يعمل في فرق للتعاقد مع AFs ولكنه غير عملي على مستوى SM ، كان لا بد من إعادة ترتيب اتجاه فحص الاصطياد البصري من نهج الخرزة الكلاسيكية المرتبطة بالمحرك32. لتشكيل فحص الدمبل ، تم استخدام فخاخين بصريتين لتثبيت التركيز البؤري التلقائي فوق محرك الميوسين المرتبط بحبة متصلة بغطاء ، وتم قياس خرج القوة بواسطة المحرك الفردي من خلال حركات التركيز البؤري التلقائي داخل المصيدة23.

ومع ذلك ، فإن قوى SM واستخدام اتجاه فحص محرك واحد / خيط واحد لا يعطي صورة كاملة عن توليد القوة على مستوى النظام لأن العديد من البروتينات الحركية ، بما في ذلك الميوسين الثاني ، لا تعمل بمعزل عن بعضها البعض وغالبا ما لا تعمل كمجموع لأجزائها 15,16,17,32,33,34,35,36 . الهياكل الأكثر تعقيدا التي تشمل أكثر من محرك واحد يتفاعل مع أكثر من خيوط واحدة ضرورية لفهم أفضل للتآزر بين شبكات خيوط الميوسين والأكتين15,32. تم استغلال اتجاه فحص الدمبل للتحقيق في توليد قوة المجموعة الصغيرة من خلال وجود ميوسينات متعددة متصلة بحرزة أو باستخدام خيوط سميكة من الميوسين متصلة بسطح والسماح للمحركات بالتفاعل مع التركيز البؤري التلقائي المعلق 4,23,34,37,38,39,40.

تشمل اختبارات المجموعة الصغيرة الأخرى مقايسة انزلاقية في المختبر حيث يتم طلاء محركات الميوسين على سطح الغطاء ، ويتم استخدام حبة مرتبطة بالتركيز البؤري التلقائي للتحقيق في القوة الناتجة عن فريق المحركات 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . في كلتا الحالتين ، ترتبط الميوسينات بسطح صلب - حبة أو غطاء - وتستخدم AF واحدا. في هذه الحالات ، لا تكون المحركات قادرة على التحرك بحرية أو التواصل مع بعضها البعض ، ولا يعكس وجود myosins مقيد بشكل صارم البيئة الهرمية المتوافقة التي ستعمل فيها المحركات معا في ساركومير32. وقد اقترحت دراسات سابقة أن الميوسين II يمكن أن يستشعر بيئته ويتكيف وفقا لذلك مع تغير ظروف التركيز اللزج المرن أو الحركي عن طريق تغيير الخصائص مثل توليد القوة ونسبة الواجب41،44،45. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تطوير اختبار الاصطياد البصري الذي يعزز ويلتقط اتصالات المحرك وتوافق النظام لرسم صورة أكثر واقعية للأسس الميكانيكية لتوليد قوة مجموعة الميوسين II.

هنا ، طورنا طريقة لإقران الهيكل الهرمي في المختبر مع الاصطياد البصري عن طريق تشكيل حزم أو سندويشات أكتوميوزين تتكون من محركات ميوسين متعددة تتفاعل بين اثنين من خيوط الأكتين. تتمتع هندسة المقايسة المعيارية هذه بالقدرة على التحقيق المباشر في كيفية تأثير العوامل الجزيئية والبيئية على توليد قوة الميوسين الجماعية. علاوة على ذلك ، فإن التحقيق في آليات توليد القوة من خلال مجموعات الأكتين الميوسين هذه لديه القدرة على المساعدة في نمذجة وفهم كيفية انتشار المهام الخلوية واسعة النطاق ، مثل تقلص العضلات ، من المستوى الجزيئي9،10،13.

Protocol

1. نقش أغطية

  1. قم بإذابة 100 غرام من KOH في 300 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ في كوب 1000 مل. يحرك المزيج بقضيب التحريك حتى تذوب غالبية KOH.
    تنبيه: يمكن أن يسبب محلول KOH المركز حروقا وأضرارا للملابس. ارتداء القفازات وحماية العين ومعطف المختبر.
  2. ضع الأغطية بشكل فردي في رفوف تنظيف الغطاء.
    ملاحظة: تم تصميم الرفوف بشقوق تحمل أغطية مفردة متباعدة للسماح بالنقش والشطف على كل وجه من جوانب الغطاء ، وفتحات التصريف في القاع ، ومصنوعة من مواد يمكنها تحمل ظروف الحفر القاسية. يمكن أن تكون مصنوعة حسب الطلب أو شراؤها تجاريا.
  3. قم بإعداد وتسمية ثلاثة أكواب سعة 1000 مل: واحدة مع 300 مل من الإيثانول واثنين من الأكواب مع 300 مل من ماء التناضح العكسي (RO).
    ملاحظة: هنا ، تم الحصول على مياه RO من جهاز تنقية المياه في المختبر ، ولكن يمكن أيضا شراؤها تجاريا إذا لم يكن جهاز تنقية محلي متاحا.
  4. ضع كل كوب من الأكواب الأربعة في سونيكتور الحمام لتفريغ الغاز لمدة 5 دقائق.
  5. اغمر رفا من الأغطية في كوب KOH والإيثانول والسونيكات لمدة 5 دقائق.
  6. انقل رف الأغطية من كوب KOH / الإيثانول إلى الكأس الذي يحتوي على الإيثانول فقط. اغمس الرف لأعلى ولأسفل في الكأس حتى لا يكون هناك خرزة.
    ملاحظة: احرص على عدم إزعاج الأغطية أو إسقاط الرف بقوة في الدورق. سيؤدي ذلك إلى خروج الأغطية من الرف أو التسبب في رش كيميائي.
  7. انقل بعناية رف الأغطية من كوب الإيثانول إلى كوب من الماء ، واغمس لأعلى ولأسفل حتى لا يكون هناك خرزة.
  8. اغمر رف الأغطية في كوب الماء الذي لم يتم استخدامه بعد وقم بسونيك مرة أخرى لمدة 5 دقائق.
  9. استخدم زجاجة لرش رف الأغطية بالماء حتى ينفد الغطاء بسلاسة. كرر مع الإيثانول.
  10. ضع الرفوف لتجف في فرن على حرارة 90 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بتخزين رفوف الأغطية المحفورة في درجة حرارة الغرفة في حاويات مغلقة لمنع التلوث قبل الاستخدام.

2. بلمرة خيوط الأكتين

  1. جعل الحل T
    1. في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، أضف 3.94 جم من Tris-HCl و 0.147 جم من CaCl2. أضف ماء RO لجعل الحجم الإجمالي 50 مل واخلطه جيدا.
      ملاحظة: التركيزات النهائية للمحلول T هي 500 mM Tris-HCl و 20 mM CaCl2 ، على التوالي.
    2. قم بتسمية الأنبوب Solution T وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  2. جعل TC المخزن المؤقت
    1. امزج 40 مل من ماء RO و 1.5 مل من المحلول T في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. تغيير الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 عن طريق إضافة كميات صغيرة من KOH المركزة. أضف الماء لصنع 50 مل من المحلول ، وتحقق من درجة الحموضة. اضبط الرقم الهيدروجيني إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت TC النهائي على 5 mM Tris-HCl و 0.2 mM CaCl2 عند درجة الحموضة 8.
    2. قم بتسمية الأنبوب TC وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  3. اصنع المخزن المؤقت ل FC
    1. أضف 85 مل من ماء RO و 10 مل من Solution T و 3.73 جم من KCl و 0.041 جم من MgCl2 إلى زجاجة عازلة سعة 100 مل. قم بتعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 عن طريق إضافة كميات صغيرة من KOH المركزة. أضف الماء لجعل الحجم النهائي 100 مل وتحقق من الرقم الهيدروجيني.
      ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت النهائي ل FC على 500 mM Tris-HCl و 500 mM KCl و 2 mM MgCl 2 و 2 mM CaCl2 عند درجة الحموضة 7.5.
    2. قم بتسمية الأنبوب FC وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  4. إعداد المخزن المؤقت العام للأكتين (GAB).
    1. امزج 485 ميكرولتر من المخزن المؤقت TC ، و 10 ميكرولتر من 10 mM ATP ، و 5 ميكرولتر من 50 mM DTT في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق.
      ملاحظة: شروط التخزين المؤقت النهائية هي 5 mM Tris-HCl و 0.2 mM CaCl 2 و 0.5 mM DTT و0.2 mM ATP.
    2. قم بتسميته على أنه GAB وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  5. تحضير المخزن المؤقت لبلمرة الأكتين (APB).
    1. امزج 455 ميكرولتر من المخزن المؤقت FC ، و 25 ميكرولتر من 100 mM ATP ، و 20 ميكرولتر من 50 mM DTT في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق.
      ملاحظة: شروط التخزين المؤقت النهائية هي 50 mM Tris-HCl و 500 mM KCl و 2 mM MgCl 2 و 2 mM CaCl 22 mM DTT و 5 mM ATP.
    2. قم بتسمية الأنبوب على أنه APB وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  6. إعادة تشكيل الأكتين
    1. إعادة تشكيل الأكتين العضلي الهيكلي للأرانب عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى قارورة 1 ملغ من الأكتين المجمد بالتجميد. اخلطي جيدا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل. Aliquot في عينات 5 ميكرولتر ، وتجميد المفاجئة ، وتخزين 10 ملغ / مل أكتين أليكوتس في -80 درجة مئوية.
    2. إعادة تشكيل الأكتين العضلي الهيكلي للأرنب الحيوي عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من ماء التناضح العكسي. Aliquot في عينات 5 ميكرولتر ، وتجميد المفاجئة ، وتخزين 1 ملغ / مل من الأكتين البيوتينيل أليكوتس عند -80 درجة مئوية.
  7. بلمرة الأكتين غير المصنفة مع تثبيت الفولويدين الرودامين
    1. قم بإذابة قارورة واحدة من 10 ملغم / مل من الأكتين واحتفظ بها على الجليد.
    2. قم بإعداد مخزن GAB الطازج ، وأضف 100 ميكرولتر من GAB إلى الأكتين أليكوت ، واخلطه عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل. احتضان الحل على الجليد لمدة 1 ساعة.
    3. إعداد APB الطازجة أثناء الحضانة. بعد الحضانة ، قم ببلمرة الأكتين إلى خيوط عن طريق إضافة 11 ميكرولتر من APB إلى محلول الأكتين. اخلطي جيدا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل. يوضع على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    4. أضف 5 ميكرولتر من الفلويدين المسمى بالرودامين إلى محلول خيوط الأكتين المبلمر الطازج. اتركيه على الجليد في الظلام لمدة 1 ساعة.
    5. قم بتخزين قارورة الأكتين الرودامين الملفوفة بورق الألومنيوم في الظلام عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يقترح استخدام هذه الخيوط لمدة أقصاها 1 أسبوع. يمكن تأكيد جودة التركيز البؤري التلقائي كل يوم من خلال تصوير سريع لخلية تدفق تحتوي على التركيز البؤري التلقائي فقط وعرض خيوط متسقة يوما بعد يوم.
  8. بلمرة الأكتين البيوتينيل مع تثبيت اليكسا فلور 488 الفيلويدين
    1. قم بإذابة قارورة واحدة من 10 ملغم / مل من الأكتين وقارورة واحدة من 1 ملغ / مل من الأكتين الحيوي والاحتفاظ بها على الجليد.
    2. اصنع مخزن مؤقت GAB جديدا.
    3. اجمع بين القارورتين (الخطوة 2.8.1) في نسبة أكتين 10: 1: البيوتينيلات. أضف 100 ميكرولتر من GAB إلى خليط الأكتين واخلطه جيدا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل. احتضان على الجليد لمدة 1 ساعة.
    4. جعل APB جديدة أثناء الحضانة.
    5. بعد خطوة الحضانة ، قم ببلمرة الأكتين بإضافة 11 ميكرولتر من APB إلى محلول الأكتين. تخلط جيدا عن طريق سحب لأعلى ولأسفل بلطف. احتضان على الثلج لمدة 20 دقيقة.
    6. أضف 5 ميكرولتر من الفاليودين المسمى Alexa Fluor 488 واحتضنه على الثلج في الظلام لمدة 1 ساعة.
    7. قم بتخزين قارورة الأكتين البيوتينيل الملفوفة بورق الألومنيوم في الظلام عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن استخدام هذه الخيوط لمدة أقصاها 1 أسبوع.

3. إعداد الميوسين والخرز

  1. إعادة تشكيل ميوسين الثاني
    1. قم بتدوير لفترة وجيزة لأسفل (~ 5 ثانية) الميوسين الهيكلي المجفف بالتجميد II لجمعه في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام جهاز طرد مركزي صغير قياسي.
    2. أعد تشكيل الميوسين إلى 10 ملغم / مل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 1 mM DTT المحضر في ماء RO.
    3. قم بتخفيف محلول الميوسين 10x عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 10 مجم / مل ميوسين إلى 90 ميكرولتر من 1 mM DTT في ماء RO. اصنع أليكوتات صغيرة الحجم (1-5 ميكرولتر) ، وقم بتجميدها ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تأكيد نشاط الميوسين عن طريق إجراء فحص خيوط الانزلاق القياسي كما هو منشور سابقا46,47. انظر المناقشة للحصول على وصف موجز.
  2. تنظيف الخرز المطلي بالستربتافيدين
    1. تمييع 20 ميكرولتر من 1 ميكرومتر من حبات الستربتافيدين إلى 80 ميكرولتر من ماء التناضح العكسي. يغسل أربع مرات عن طريق الدوران لأسفل عند 9,600 × جم وإعادة تكوينه في 100 ميكرولتر من ماء التناضح العكسي.
    2. سونيك لمدة 2 دقيقة بسعة 40٪ وتخزين الخرز المغسول على دوار عند 4 درجات مئوية.

4. إعداد خلية التدفق

  1. تحضير محلول بولي ل ليسين (PLL) عن طريق إضافة 30 مل من الإيثانول 100٪ إلى أنبوب 50 مل وإضافة 200 ميكرولتر من 0.1٪ ث / v بولي ل ليسين في الماء وتخلط جيدا.
  2. أضف غطاء محفورا إلى محلول PLL واتركه ينقع لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة الغطاء باستخدام ملاقط ، مع الحرص على لمس حافة الغطاء فقط أثناء سحبه من الأنبوب (انظر الشكل 1A-C). أمسك بأغطية الغطاء من حوافها بيد قفازات.
  3. جفف الغطاء مع شركة طيران مفلترة حتى لا يكون هناك إيثانول متبق ولا بقايا على الغطاء.
  4. ضع قطعتين من الشريط اللاصق على الوجهين في منتصف شريحة المجهر ، على بعد 3-4 مم من بعضها البعض. قم بتمزيق أو قطع الشريط الزائد الذي يتدلى من حافة الشريحة.
  5. أضف الغطاء المطلي ب PLL أعلى الشريط عموديا على المحور الطويل لشريحة المجهر (التي تشكل T) لتشكيل قناة.
  6. استخدم أنبوبا صغيرا لضغط الغطاء على الشريط وشريحة المجهر جيدا حتى يصبح الشريط شفافا (الشكل 1A). تأكد من عدم وجود فقاعات في الشريط لأن هذا يمكن أن يسبب تسربا من قناة التدفق.
    ملاحظة: يمكن لخلية التدفق الاحتفاظ بحجم 10-15 ميكرولتر.

5. إعداد حزمة أكتوميوسين

  1. في أنابيب منفصلة ، قم بتخفيف كل نوع من خيوط الأكتين (الرودامين والبيوتينيل 488 الموسومة) 600x عن طريق خلط 0.5 ميكرولتر من الأكتين المحترم المسمى مع 300 ميكرولتر من APB. أضف 5 ميكرولتر إضافية من الفيلويدين المسمى بالمقابل إلى كل أنبوب واحتضنه على الثلج في الظلام لمدة 15 دقيقة.
  2. إلى محلول الأكتين البيوتينيل ، أضف نظام كسح الأكسجين من 1 ميكرولتر من بيتا دي الجلوكوز عند 500 ملغ / مل ، و 1 ميكرولتر من أوكسيديز الجلوكوز عند 25 ملغ / مل ، و 1 ميكرولتر من الكاتالاز عند 500 وحدة / مل. أضف 1 ميكرولتر من 100 mM ATP و 1 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين المخففة والنظيفة 100x. يحرك بلطف بطرف ماصة. ضع التعليق على دوار عند 4 درجات مئوية بينما يتم تجميع بقية حزمة actomyosin.
  3. أضف 15 ميكرولتر من أكتين الرودامين المخفف إلى خلية تدفق PLL (الشكل 1D). قم بفتيل المحلول الزائد من خلال خلية التدفق ولكن لا تسمح لقناة التدفق بأن تصبح جافة. احتضان لمدة 10 دقائق في غرفة الرطوبة.
    ملاحظة: يمكن صنع غرف الرطوبة من صناديق أطراف ماصة فارغة مع إضافة الماء إلى الأسفل والغطاء المغطى بورق الألومنيوم لمنع الضوء.
  4. تحضير محلول الكازين 1 ملغ / مل في APB.
  5. يضاف 15 ميكرولتر من الكازين 1 ملغم/مل لمنع الربط غير المحدد للمكونات اللاحقة (الشكل 1 هاء). احتضان لمدة 5 دقائق في غرفة الرطوبة.
  6. أضف التركيز المطلوب من الميوسين إلى الأكتين الحيوي وتعليق الخرز من الخطوة 5.2. حرك بلطف بطرف الماصة ، ثم أضف على الفور 15 ميكرولتر من تعليق الخطوة 5.2 + تركيز الميوسين المطلوب إلى خلية التدفق (الشكل 1F ، G). احتضان لمدة 20 دقيقة. أغلق الأطراف المفتوحة لخلية التدفق باستخدام طلاء الأظافر لمنع التبخر أثناء التصوير وتجارب الاصطياد البصري.
    ملاحظة: ينتج عن تركيز محلول الميوسين البالغ 1 ميكرومتر تجميعا قويا ويمكن استخدامه كنقطة انطلاق للتخصيص المطلوب للفحص (انظر الشكل 2).

6. قياسات القوة باستخدام المصيدة البصرية (NT2 Nanotracker2)

ملاحظة: على الرغم من أن البروتوكول أدناه مخصص لنظام NT2 ، إلا أنه يمكن استخدام هذا الفحص مع أنظمة الملائمة البصرية الأخرى ، بما في ذلك تلك المصممة خصيصا ، والتي لديها أيضا قدرات التألق. يظل سير العمل العام كما هو في التركيز البؤري على سطح الشريحة ، وإجراء معايرات الخرز ، والحصول على البيانات من خلال العثور على حزم الأكتين الفلورية. وبالنسبة لنظام NT2، يقدم الشكل التكميلي S1، والشكل التكميلي S2، والشكل التكميلي S3، والشكل التكميلي S4، والشكل التكميلي S5، والشكل التكميلي S6، والشكل التكميلي S7 تفاصيل عن نظام الاصطياد البصري وواجهة البرامجيات.

  1. قم بتشغيل مربع التحكم والليزر (الشكل التكميلي S1).
  2. ابدأ تشغيل برنامج كمبيوتر الملائمة البصرية بالنقر فوق رمز JPK Nanotracker على سطح المكتب.
  3. قم بإيقاظ وحدة التحكم عن بعد بالنقر فوق الزر Logitech في الوسط (الشكل التكميلي S2).
  4. قم بتشغيل وحدة التألق عن طريق تبديل مفتاح التشغيل/الإيقاف (الشكل التكميلي S3).
  5. أدر برج مكعب المرشح للتصوير الساطع (الشكل التكميلي S4).
  6. بمجرد أن يصبح النظام جاهزا ، قم بتشغيل الليزر باستخدام زر طاقة الليزر في الزاوية السفلية اليسرى من الشاشة إلى 50 ميجاوات واتركه يستقر لمدة 30 دقيقة (الشكل التكميلي S5).
  7. انقر بالتتابع على أزرار الإضاءة والكاميرا والهدف وحركة المسرح داخل البرنامج لإظهار تلك النوافذ للعرض والتلاعب أثناء التجربة. قم بتشغيل إضاءة المجهر من خلال النقر فوق الزر تشغيل / إيقاف تشغيله وضبطه على أقصى طاقة عن طريق النقر فوق الشريط وسحبه على طول الطريق إلى اليمين (الشكل التكميلي S5).
  8. افتح منطقة العينة وأزل حامل العينة من مرحلة المجهر. أضف خلية التدفق ، وقم بتأمينها باستخدام حاملات العينات المعدنية ، وتأكد من أن الشريحة مع الغطاء في الأسفل.
  9. أضف 30 ميكرولتر من ماء RO إلى وسط الهدف السفلي. لا تدع طرف الماصة يلمس العدسة. أعد إدراج مرحلة العينة.
    ملاحظة: نظرا لأن نظام NT2 يستخدم هدف غمر الماء كهدف ملائمة، فقد تختلف وسائط الغمر وفقا لهدف الملائمة في إعداد المستخدم.
  10. ارفع الهدف السفلي باستخدام أسهم التحكم على الشاشة أو L2 على وحدة التحكم عن بعد حتى تلامس حبة الماء الغطاء (الشكل التكميلي S5).
  11. اخفض الهدف العلوي حتى يتم الوصول إلى حوالي نصف المسافة إلى خلية التدفق باستخدام الأسهم التي تظهر على الشاشة أو R2 على وحدة التحكم عن بعد. أضف 170 ميكرولتر من ماء RO إلى أعلى خلية التدفق مباشرة تحت الهدف العلوي. اخفض الهدف العلوي حتى يكسر التوتر السطحي للماء ويشكل غضروفا مفصليا.
  12. حرك مرحلة المجهر باستخدام لوحة الأسهم الموجودة على وحدة التحكم عن بعد حتى يتم الوصول إلى حافة الشريط المجاور لقناة التدفق. أغلق باب العينة.
    ملاحظة: تشير "النقرة" عند إغلاق باب العينة إلى أن غالق الليزر مفتوح الآن. هذه ميزة أمان تسمح فقط بفتح الغالق إذا كان الباب مغلقا.
  13. باستخدام نافذة الهدف في الشاشة، ضع حافة الشريط في بؤرة التركيز البؤري عن طريق رفع الهدف السفلي المسمى هدف الليزر لأعلى من خلال النقر على السهم العلوي باستخدام عناصر التحكم التي تظهر على الشاشة. افعل الشيء نفسه بالنسبة للهدف العلوي بالنقر فوق السهم السفلي (الشكل التكميلي S5).
    ملاحظة: تحرك الأسهم المزدوجة الهدف أو المرحلة بشكل أسرع. يتم استخدام حافة الشريط للتركيز البؤري لأنه كائن كبير يسهل العثور عليه وقريب من سطح الغطاء. فقاعات الهواء داخل الشريط هي خيار آخر. ومع ذلك ، هذا غير مطلوب إذا كان لدى المستخدم روتين تلقائي للعثور على التركيز السطحي أو طريقة داخلية مفضلة.
  14. بمجرد أن يصبح الشريط في بؤرة التركيز، أغلق القزحية جزئيا في الجزء العلوي من المصيدة البصرية. اخفض الهدف العلوي حتى يظهر شكل مضلع القزحية. ضع هذه الحواف في بؤرة التركيز ، وأعد فتح القزحية ، ثم قم بإقران الأهداف باستخدام النقر فوق رمز القفل (الشكل التكميلي S5).
  15. ابحث عن حبة عائمة وقم باحتجازها بالنقر فوق زر Trap Shutter ، والذي سيفتح الغالق ويسمح لليزر الاصطياد بضرب العينة. انقر على مؤشر ملائمة على الشاشة واسحبه لنقل موقع ليزر الملائمة. بمجرد محاصرتها ، قم بمعايرة الخرزة لربط قياسات الجهد بالقوة والإزاحة.
  16. انقر على زر المعايرة . اضبط روتين المعايرة استنادا إلى تحليل أطياف الطاقة وقم بملاءمة تردد الزاوية داخل البرنامج لاتجاهات X و Y و Z (الشكل التكميلي S6).
  17. انقر على الإعدادات. اكتب قطر الخرزة (1000 نانومتر) ، واكتب درجة حرارة المرحلة الموجودة في أسفل يسار نافذة البرنامج. (انظر الشكل التكميلي S6).
  18. انقر على فخ 1. انقر على X Signal. انقر فوق تشغيل لأداء تناسب تردد الزاوية. انقر واسحب داخل النافذة لتحسين ملاءمة الوظيفة. انقر فوق استخدامه للحصول على قيم الحساسية والصلابة. انقر على قبول القيم. كرر ذلك لإشارات Y و Z. أغلق النافذة. (انظر الشكل التكميلي S6).
    ملاحظة: إجراءات معايرة الخرز على أنظمة الملائمة البصرية الأخرى أو الأنظمة المصممة خصيصا والتي تم اختبارها بقوة من قبل المستخدم ، مثل طريقة التقسيم المتساوي أو طريقة قوة السحب ، مقبولة أيضا57,58.
  19. ابحث عن حزمة أكتوميوزين من خلال البحث عن الخرز المرتبط بالتركيز البؤري التلقائي على سطح الغطاء.
  20. عندما يتم الكشف عن خرزة غير مزدحمة بالخرز العائم الآخر ، راقب التركيزات البؤرية التلقائية المحيطة بها عن طريق التصوير الفلوري للتحقق من وجود حزمة.
  21. تحقق من وجود حزمة من خلال البحث عن كل من AFs الفلورسنت المترجمة معا. قم بتشغيل مصدر الضوء الأبيض واستخدم مكعب المرشح المناسب لتصوير كل خيوط الأكتين عن طريق تدوير البرج (مكعبات مرشح الإثارة 488 نانومتر و 532 نانومتر لإثارة Alexa Fluor 488 و rhodamine ، على التوالي). انظر الشكل التكميلي S4.
    ملاحظة: يمكن أن تكون تجربة التحكم للتحقق من شدة التألق للتركيز البؤري التلقائي الفردي مفيدة في تحديد الحزم التي تتكون من خيوط واحدة تحمل علامة 488 و 8 من الرودامين ، أو تنطبق على أي مجموعة من الفلوروفورات التي يختار المستخدم استخدامها.
  22. بمجرد التحقق ، قم بحبس الخرزة المرفقة بالخيوط العلوية للحزمة بالنقر فوق الزر Trap Shutter .
  23. استخدم عناصر التحكم التي تظهر على الشاشة لتسجيل البيانات بالنقر فوق زر الذبذبات (الشكل التكميلي S7). لتصور القياسات دون تسجيل البيانات ، انقر فوق ابدأ. لحفظ جميع البيانات ، انقر فوق الحفظ التلقائي. لتسجيل القياسات، انقر فوق بدء السجل. اختر البيانات التي سيتم تصورها في الوقت الفعلي (الموضع ، القوة ، اتجاه x ، اتجاه y) عن طريق الاختيار من القائمة المنسدلة X إشارة أو إشارة Y. تذكر أن xdirection من اليسار إلى اليمين، والاتجاه y لأعلى ولأسفل على الشاشة. انظر الشكل التكميلي S7.
    ملاحظة: سيتم حفظ البيانات كملفات .out وتتضمن الوقت والجهد والإزاحة والقوة لكل اتجاه. يمكن تصدير هذه الملفات إلى برامج أخرى للتصور والتحليل.

النتائج

تتميز خلايا التدفق التي تحتوي على أنظمة حزم الأكتوميوزين بتصميم قياسي ، وتتكون من شريحة مجهرية وغطاء محفور مفصول بقناة مصنوعة من شريط لاصق على الوجهين (الشكل 1). ثم يتم بناء الفحص من الغطاء إلى الأعلى باستخدام مقدمات مرحلية كما هو موضح في البروتوكول. يتكون الفحص النهائي من ?...

Discussion

تم إجراء دراسة في المختبر باستخدام ملاقط بصرية جنبا إلى جنب مع التصوير الفلوري للتحقيق في ديناميكيات مجموعات الميوسين التي تتفاعل مع خيوط الأكتين. تم تجميع حزم الأكتين-الميوسين-الأكتين باستخدام الميوسين العضلي الثاني، والأكتين الرودامين في الجزء السفلي من الحزمة وعلى سطح الغطاء، و...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل جزئيا من قبل زمالة أبحاث مجلس طلاب الدراسات العليا بجامعة ميسيسيبي (OA) ، وجامعة ميسيسيبي سالي ماكدونيل باركسديل مع مرتبة الشرف (JCW ، JER) ، واتحاد منح الفضاء في ميسيسيبي تحت رقم المنحة NNX15AH78H (JCW ، DNR) ، وجمعية القلب الأمريكية تحت رقم المنحة 848586 (DNR).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Actin protein (biotin): skeletal muscleCytoskeletonAB07-ABiotinylated actin protein
Actin protein, rabbit skeletal muscleCytoskeletonAKL99-AActin protein
Alexa Fluor 488 PhalloidinInvitrogenA12379Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain
ATPFisher scientificBP413-25Required for actin assembly and myosin motility
Beta-D-glucoseFisher scientificMP218069110Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Blotting Grade Blocker (casein)Biorad1706404Used to block surface from non-specific binding
CaCl2Fisher scientificC79500Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network
CatalaseFisher scientificICN10040280Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
CoverslipsFisher scientific12544CUsed to make flow cells
DTTFisher scientificAC327190010Used for buffer preparation
EthanolFisher scientificA4094Regent used for cleaning coverslips
Glucose oxidaseFisher scientific34-538-610KUPart of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
KClFisher scientificP217-500Used for buffer preparation
KOHFisher scientificP250-1Used to etch coverslips and adjust buffer pH
MgCl2Fisher scientificM33-500Used for buffer preparation
Microscope slidesFisher scientific12-544-2Used to make flow cells
Myosin II protein: rabbit skeletal muscleCytoskeletonMY02Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle
Nanotracker2Bruker/JPKNT2Optical trapping instrument
Poly-l-lysineSigma-AldrichP8920Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip
Rhodamine PhalloidinCytoskeletonPHDR1Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain
Streptavidin beads, 1 μmSpherotechSVP-10-5Optical trapping handle
Tris-HClFisher scientificPR H5121Used for buffer preparation

References

  1. Goldstein, L. S. Kinesin molecular motors: transport pathways, receptors, and human disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 6999-7003 (2001).
  2. Lee Sweeney, H., Holzbaur, E. L. F. Motor proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (5), 021931 (2018).
  3. O'Connell, C. B., Tyska, M. J., Mooseker, M. S. Myosin at work: Motor adaptations for a variety of cellular functions. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1773 (5), 615-630 (2007).
  4. Kaya, M., Tani, Y., Washio, T., Hisada, T., Higuchi, H. Coordinated force generation of skeletal myosins in myofilaments through motor coupling. Nature Communications. 8, 1-13 (2017).
  5. Akhshi, T. K., Wernike, D., Piekny, A. Microtubules and actin crosstalk in cell migration and division. Cytoskeleton. 71 (1), 1-23 (2014).
  6. Brawley, C. M., Rock, R. S. Unconventional myosin traffic in cells reveals a selective actin cytoskeleton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9685-9690 (2009).
  7. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (7), 1627-1632 (2012).
  8. Spudich, J. A., et al. Myosin structure and function. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 60, 783-791 (1995).
  9. Sommese, R. F., et al. Molecular consequences of the R453C hypertrophic cardiomyopathy mutation on human β-cardiac myosin motor function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12607-12612 (2013).
  10. Nag, S., et al. The myosin mesa and the basis of hypercontractility caused by hypertrophic cardiomyopathy mutations. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (6), 525-533 (2017).
  11. Kawana, M., Sarkar, S. S., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Biophysical properties of human b-cardiac myosin with converter mutations that cause hypertrophic cardiomyopathy. Science Advances. 3 (2), 1-11 (2017).
  12. Girolami, F., et al. Novel α-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: A massively parallel sequencing study. Circulation: Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
  13. Debold, E. P., et al. Hypertrophic and dilated cardiomyopathy mutations differentially affect the molecular force generation of mouse α-cardiac myosin in the laser trap assay. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 293 (1), 284-291 (2007).
  14. Barron, J. T. Hypertrophic cardiomyopathy. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 1 (3), 277-282 (1999).
  15. Duke, T. A. J. Molecular model of muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (6), 2770-2775 (1999).
  16. Vilfan, A., Duke, T. Instabilities in the transient response of muscle. Biophysical Journal. 85 (2), 818-827 (2003).
  17. Huxley, A. F. Muscle structure and theories of contraction. Progress in Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).
  18. Huxley, H. E. Fifty years of muscle and the sliding filament hypothesis. European Journal of Biochemistry. 271 (8), 1403-1415 (2004).
  19. Kad, N. M., Kim, S., Warshaw, D. M., VanBuren, P., Baker, J. E. Single-myosin crossbridge interactions with actin filaments regulated by troponin-tropomyosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (47), 16990-16995 (2005).
  20. Veigel, C., Molloy, J. E., Schmitz, S., Kendrick-Jones, J. Load-dependent kinetics of force production by smooth muscle myosin measured with optical tweezers. Nature Cell Biology. 5 (11), 980-986 (2003).
  21. Spudich, J. A. The myosin swinging cross-bridge model. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 2, 387-392 (2001).
  22. Simmons, R. M., Finer, J. T., Chu, S., Spudich, J. A. Quantitative measurements of force and displacement using an optical trap. Biophysical Journal. 70 (4), 1813-1822 (1996).
  23. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  24. Kron, S. J., Uyeda, T. Q. P., Warrick, H. M., Spudich, J. A. An approach to reconstituting motility of single myosin molecules. Journal of Cell Science. 98, 129-133 (1991).
  25. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, B., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  26. Ruegg, C., et al. Molecular motors: Force and movement generated by single Myosin II molecules. Physiology. 17 (5), 213-218 (2002).
  27. Nayak, A., et al. Single-molecule analysis reveals that regulatory light chains fine-tune skeletal myosin II function. Journal of Biological Chemistry. 295 (20), 7046-7059 (2020).
  28. Dupuis, D. E., Guilford, W. H., Wu, J., Warshaw, D. M. Actin filament mechanics in the laser trap. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 18 (1), 17-30 (1997).
  29. Tyska, M. J., et al. Two heads of myosin are better than one for generating force and motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4402-4407 (1999).
  30. Tyska, M. J., Warshaw, D. M. The myosin power stroke. Cell Motility and the Cytoskeleton. 51 (1), 1-15 (2002).
  31. Finer, J. T., et al. Characterization of single actin-myosin interactions. Biophysical Journal. 68, 291-296 (1995).
  32. Al Azzam, O., Trussell, C. L., Reinemann, D. N. Measuring force generation within reconstituted microtubule bundle assemblies using optical tweezers. Cytoskeleton. 78 (3), 111-125 (2021).
  33. Wagoner, J. A., Dill, K. A. Evolution of mechanical cooperativity among myosin II motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (20), 2101871118 (2021).
  34. Walcott, S., Warshaw, D. M., Debold, E. P. Mechanical coupling between myosin molecules causes differences between ensemble and single-molecule measurements. Biophysical Journal. 103 (3), 501-510 (2012).
  35. Stewart, T. J., Murthy, V., Dugan, S. P., Baker, J. E. Velocity of myosin-based actin sliding depends on attachment and detachment kinetics and reaches a maximum when myosin-binding sites on actin saturate. Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101178 (2021).
  36. Hilbert, L., Cumarasamy, S., Zitouni, N. B., Mackey, M. C., Lauzon, A. M. The kinetics of mechanically coupled myosins exhibit group size-dependent regimes. Biophysical Journal. 105 (6), 1466-1474 (2013).
  37. Debold, E. P., Walcott, S., Woodward, M., Turner, M. A. Direct observation of phosphate inhibiting the Force-generating capacity of a miniensemble of myosin molecules. Biophysical Journal. 105 (10), 2374-2384 (2013).
  38. Kaya, M., Higuchi, H. Nonlinear elasticity and an 8-nm working stroke of single myosin molecules in myofilaments. Science. 329 (5992), 686-689 (2010).
  39. Pertici, I., et al. A myosin II nanomachine mimicking the striated muscle. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  40. Cheng, Y. S., De Souza Leite, F., Rassier, D. E. The load dependence and the force-velocity relation in intact myosin filaments from skeletal and smooth muscles. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 318 (1), 103-110 (2020).
  41. Stam, S., Alberts, J., Gardel, M. L., Munro, E. Isoforms confer characteristic force generation and mechanosensation by myosin II filaments. Biophysical Journal. 108 (8), 1997-2006 (2015).
  42. Rastogi, K., Puliyakodan, M. S., Pandey, V., Nath, S., Elangovan, R. Maximum limit to the number of myosin II motors participating in processive sliding of actin. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Debold, E. P., Patlak, J. B., Warshaw, D. M. Slip sliding away: Load-dependence of velocity generated by skeletal muscle myosin molecules in the laser trap. Biophysical Journal. 89 (5), 34-36 (2005).
  44. Albert, P. J., Erdmann, T., Schwarz, U. S. Stochastic dynamics and mechanosensitivity of myosin II minifilaments. New Journal of Physics. 16, (2014).
  45. Erdmann, T., Schwarz, U. S. Stochastic force generation by small ensembles of myosin II motors. Physical Review Letters. 108 (18), 1-5 (2012).
  46. Guo, B., Guilford, W. H. The tail of myosin reduces actin filament velocity in the in vitro motility assay. Cell Motility and the Cytoskeleton. 59 (4), 264-272 (2004).
  47. Miller-Jaster, K. N., Petrie Aronin, C. E., Guilford, W. H. A quantitative comparison of blocking agents in the in vitro motility assay. Cellular and Molecular Bioengineering. 5 (1), 44-51 (2012).
  48. Mansoon, A., Balaz, M., Albet-Torres, N., Rosengren, K. J. In vitro assays of molecular motors -- impact of motor-surface interactions. Frontiers in Bioscience. 13, 5732-5754 (2008).
  49. Persson, M., et al. Heavy meromyosin molecules extending more than 50 nm above adsorbing electronegative surfaces. Langmuir. 26 (12), 9927-9936 (2010).
  50. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  51. Yanagida, T., Nakase, M., Nishiyama, K., Oosawa, F. Direct observation of motion of single F-actin filaments in the presence of myosin. Nature. 307 (5946), 58-60 (1984).
  52. Tsuda, Y., Yasutake, H., Ishijima, A., Yanagida, T. Torsional rigidity of single actin filaments and actin-actin bond breaking force under torsion measured directly by in vitro micromanipulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (23), 12937-12942 (1996).
  53. Stewart, T. J., et al. Actin sliding velocities are influenced by the driving forces of actin-myosin binding. Cellular and Molecular Bioengineering. 6 (1), 26-37 (2013).
  54. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
  55. Fordyce, P. M., Valentine, M. T., Block, S. M. Advances in surface-based assays for single molecules. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , 431-460 (2008).
  56. Ozeki, T., et al. Surface-bound casein modulates the adsorption and activity of kinesin on SiO2 surfaces. Biophysical Journal. 96 (8), 3305-3318 (2009).
  57. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  58. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75 (9), 2787-2809 (2004).
  59. Thoresen, T., Lenz, M., Gardel, M. L. Thick filament length and isoform composition determine self-organized contractile units in actomyosin bundles. Biophysical Journal. 104 (3), 655-665 (2013).
  60. Matusovsky, O. S., et al. Millisecond conformational dynamics of skeletal Myosin II power stroke studied by high-speed atomic force microscopy. ACS Nano. 15 (2), 2229-2239 (2021).
  61. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  62. Cordova, J. C., et al. Bioconjugated core-shell microparticles for high-force optical trapping. Particle and Particle Systems Characterization. 35 (3), 1-8 (2018).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive Kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  65. Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Analyzing the micromechanics of the cell division apparatus. Methods in Cell Biology. 145, 173-190 (2018).
  66. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  67. Thoresen, T., Lenz, M., Gardel, M. L. Reconstitution of contractile actomyosin bundles. Biophysical Journal. 100 (11), 2698-2705 (2011).
  68. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Reconstitution of contractile actomyosin arrays. Methods in Enzymology. 540 (11), 265-282 (2014).
  69. Weirich, K. L., Stam, S., Munro, E., Gardel, M. L. Actin bundle architecture and mechanics regulate myosin II force generation. Biophysical Journal. 120 (10), 1957-1970 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved