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Resumo

A formação de feixes de actomiosina in vitro e a medição da geração de força do conjunto de miosina usando pinças ópticas são apresentadas e discutidas.

Resumo

As miosinas são proteínas motoras que hidrolisam o ATP para percorrer as trilhas do filamento de actina (FA) e são essenciais em processos celulares, como motilidade e contração muscular. Para entender seus mecanismos geradores de força, a miosina II tem sido investigada tanto no nível de molécula única (SM) quanto como equipes de motores in vitro usando métodos biofísicos, como armadilhas ópticas.

Esses estudos mostraram que o comportamento gerador de força da miosina pode diferir muito quando se move do nível de molécula única em um arranjo de três esferas para grupos de motores trabalhando juntos em um grânulo rígido ou superfície de deslizamento de cobertura em um arranjo de deslizamento. No entanto, essas construções de ensaio não permitem avaliar a dinâmica de grupo da miosina dentro da hierarquia estrutural viscoelástica como fariam dentro de uma célula. Desenvolvemos um método utilizando pinças ópticas para investigar a mecânica de geração de força por conjuntos de miosina interagindo com múltiplos filamentos de actina.

Esses feixes de actomiosina facilitam a investigação em um ambiente hierárquico e complacente que captura a comunicação motora e a saída de força do conjunto. A natureza personalizável do ensaio permite alterar as condições experimentais para entender como as modificações no conjunto de miosina, no feixe de filamentos de actina ou no ambiente circundante resultam em diferentes saídas de força.

Introdução

As proteínas motoras são essenciais à vida, convertendo energia química em trabalho mecânico 1,2,3. Os motores de miosina interagem com os filamentos de actina dando passos ao longo dos filamentos semelhantes a uma trilha, e a dinâmica das redes de actina-miosina realiza a contração muscular, a motilidade celular, o anel contrátil durante a citocinese e o movimento de carga dentro da célula, entre outras tarefas essenciais 3,4,5,6,7,8 . Como as miosinas têm tantos papéis essenciais, a falha na funcionalidade da rede miosina-actina pode levar ao desenvolvimento de doenças, como mutações na cadeia pesada da miosina que causam hipercontratilidade cardíaca na cardiomiopatia hipertrófica (CMH)9,10,11,12,13,14 . Na contração muscular, os motores individuais de miosina cooperam entre si, trabalhando como um conjunto para fornecer a energia mecânica necessária que realiza o deslizamento relativo das FAs 4,15,16,17,18. Os motores de miosina formam pontes transversais entre as FAs e utilizam alterações conformacionais devido ao seu ciclo mecanoquímico para se moverem coletivamente em direção à extremidade farpada dos filamentos alinhados 17,18,19,20,21.

O desenvolvimento de ensaios quantitativos de motilidade in vitro no nível do SM usando técnicas como o aprisionamento óptico facilitou a coleta de detalhes sem precedentes de como os motores individuais de miosina funcionam, incluindo a medição da geração de força SM e os tamanhos dos passos 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. desenvolveram o ensaio de aprisionamento óptico "três contas" ou "halteres" para investigar a mecânica de geração de força de motores de miosina II simples23,31. Como a miosina II muscular trabalha em equipes para contrair FAs, mas não é processiva no nível do SM, a orientação do ensaio de aprisionamento óptico teve que ser rearranjada a partir da abordagem clássica do grânulo ligado ao motor32. Para formar o ensaio de halteres, duas armadilhas ópticas foram utilizadas para segurar uma FA sobre um motor de miosina ligado a um cordão preso por deslizamento de cobertura, e a saída de força pelo motor único foi medida através de movimentos da FA dentro da armadilha23.

No entanto, as forças SM e o uso de uma única orientação motor/ensaio de filamento único não fornecem uma imagem completa sobre a geração de força no nível do sistema, uma vez que muitas proteínas motoras, incluindo a miosina II, não funcionam isoladamente e muitas vezes não funcionam como uma soma de suas partes 15,16,17,32,33,34,35,36 . Estruturas mais complexas que incluam mais de um motor interagindo com mais de um filamento são necessárias para melhor compreender a sinergia das redes de filamentos de miosina e actina15,32. A orientação do ensaio de halteres tem sido explorada para investigar a geração de força de pequenos conjuntos por ter múltiplas miosinas ligadas a um grânulo ou usando um filamento de miosina espessa ligado a uma superfície e permitindo que os motores interajam com a FA suspensa 4,23,34,37,38,39,40.

Outros pequenos ensaios de conjunto incluem um ensaio de deslizamento de filamento in vitro em que os motores de miosina são revestidos em uma superfície de deslizamento de cobertura, e um talão ligado a um FA é usado para sondar a força gerada pela equipe de motores 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . Em ambos os casos, as miosinas estão ligadas a uma superfície rígida – grânulos ou deslizamento de cobertura – e utilizam um AF. Nesses casos, os motores não são capazes de se mover livremente ou se comunicar uns com os outros, nem ter miosinas rigidamente ligadas reflete o ambiente hierárquico e compatível em que os motores trabalhariam juntos no sarcômero32. Estudos anteriores sugeriram que a miosina II pode sentir seu ambiente e adaptar-se de acordo com as mudanças nas condições de concentração viscoelástica ou motora, alterando características como geração de força e razão de serviço41,44,45. Assim, há uma necessidade de desenvolver um ensaio de armadilhagem óptica que promova e capture a comunicação motora e a conformidade com o sistema para pintar uma imagem mais realista dos fundamentos mecanicistas da geração de força do conjunto de miosina II.

Aqui, desenvolvemos um método para acoplar estrutura hierárquica in vitro com aprisionamento óptico, formando feixes de actomiosina ou sanduíches consistindo de múltiplos motores de miosina interagindo entre dois filamentos de actina. Esta geometria de ensaio modular tem a capacidade de investigar diretamente como os fatores moleculares e ambientais influenciam a geração de força de miosina do conjunto. Além disso, investigar os mecanismos de geração de força por meio desses conjuntos de actina-miosina tem o potencial de auxiliar na modelagem e compreensão de como tarefas celulares em larga escala, como a contração muscular, se propagam a partir do nível molecular 9,10,13.

Protocolo

1. Folhas de cobertura de gravação

  1. Dissolver 100 g de KOH em 300 mL de etanol a 100% em um copo de 1.000 mL. Mexa com uma barra de agitação até que a maioria do KOH tenha se dissolvido.
    CUIDADO: A solução concentrada de KOH pode causar queimaduras e danos à roupa. Use luvas, proteção para os olhos e um jaleco.
  2. Coloque as tampas individualmente em racks de limpeza de tampas.
    NOTA: Os racks são projetados com fendas que mantêm as tampas simples espaçadas para permitir a gravação e o enxágue em cada face da tampa, os orifícios de drenagem no fundo e feitos de material que pode suportar as condições adversas de gravação. Eles podem ser feitos sob medida ou comprados comercialmente.
  3. Preparar e rotular três copos de 1.000 mL: um com 300 mL de etanol e dois copos com 300 mL de água de osmose reversa (RO).
    NOTA: Aqui, a água RO foi obtida de um purificador de água de laboratório, mas também pode ser comprada comercialmente se um purificador local não estiver disponível.
  4. Coloque cada um dos quatro copos em um sonicator de banho para desgaseificar por 5 min.
  5. Submerja um rack de folhas de cobertura no copo de KOH e etanol e sonicate por 5 min.
  6. Transfira o rack de tampas do copo KOH/etanol para o copo somente etanol. Mergulhe o acumular para cima e para baixo no copo até que não haja miçangas.
    NOTA: Tome cuidado para não perturbar as tampas ou soltar com força o rack no béquer. Isso fará com que as tampas saiam do rack ou causem respingos químicos.
  7. Transfira cuidadosamente o rack de tampas do copo de etanol para um copo de água, mergulhando para cima e para baixo até que não haja miçangas.
  8. Submerja o rack de tampas no copo de água que ainda não foi usado e sonicate novamente por 5 min.
  9. Use uma garrafa para pulverizar o rack de folhas de cobertura com água até que ele escorra para fora das tampas suavemente. Repita com o etanol.
  10. Colocar as estantes a secar no forno a 90 °C durante 20 min. Armazene as prateleiras de coberturas gravadas à temperatura ambiente em recipientes fechados para evitar a contaminação antes do uso.

2. Polimerização do filamento de actina

  1. Fazer a solução T
    1. Em um tubo cônico de 50 mL, adicione 3,94 g de Tris-HCl e 0,147 g de CaCl2. Adicione a água RO para fazer um volume total de 50 mL e misture bem.
      NOTA: As concentrações finais da Solução T são 500 mM Tris-HCl e 20 mM CaCl2, respectivamente.
    2. Rotular o tubo Solução T e guardá-lo a 4 °C.
  2. Criar buffer de TC
    1. Misture 40 mL de água RO e 1,5 mL de Solução T em um tubo cônico de 50 mL. Altere o pH para 8,0 adicionando pequenas quantidades de KOH concentrado. Adicione água para produzir 50 mL da solução e verifique o pH. Ajuste o pH, se necessário.
      NOTA: O tampão TC final contém 5 mM Tris-HCl e 0,2 mM CaCl2 a pH 8.
    2. Rotular o tubo TC e guardá-lo a 4 °C.
  3. Criar buffer FC
    1. Adicione 85 mL de água de RO, 10 mL de Solução T, 3,73 g de KCl e 0,041 g de MgCl2 a um frasco tampão de 100 mL. Modifique o pH para 7,5 adicionando pequenos volumes de KOH concentrado. Adicione água para fazer um volume final de 100 mL e verifique o pH.
      NOTA: O tampão FC final contém 500 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 2 mM MgCl 2 e 2 mM CaCl2 a pH 7,5.
    2. Rotular o tubo FC e guardá-lo a 4 °C.
  4. Preparar o buffer geral de actina (GAB).
    1. Misture 485 μL de tampão TC, 10 μL de ATP de 10 mM e 5 μL de TDT de 50 mM em um tubo de microcentrífuga.
      NOTA: As condições finais do buffer são Tris-HCl de 5 mM, CaCl 2 de0,2 mM, TDT de 0,5 mM e ATP de 0,2 mM.
    2. Rotulá-lo como GAB e armazená-lo a 4 °C.
  5. Preparar tampão de polimerização de actina (APB).
    1. Misture 455 μL de tampão FC, 25 μL de ATP de 100 mM e 20 μL de TDT de 50 mM em um tubo de microcentrífuga.
      NOTA: As condições finais do buffer são 50 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 22 mM DTT e 5 mM ATP.
    2. Rotular o tubo como APB e guardá-lo a 4 °C.
  6. Reconstituir actina
    1. Reconstituir a actina do músculo esquelético do coelho adicionando 100 μL de água deionizada a um frasco de 1 mg de actina liofilizada. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo. Aliquotar em amostras de 5 μL, congelar rapidamente e armazenar as alíquotas de actina de 10 mg/mL a -80 °C.
    2. Reconstituir actina do músculo esquelético de coelho biotinilado adicionando 20 μL de água RO. Aliquotar em amostras de 5 μL, congelar rapidamente e armazenar as alíquotas de actina biotinilada de 1 mg/mL a -80 °C.
  7. Polimerização de actina não marcada com estabilização de faloidina rodamina
    1. Descongele um frasco para injetáveis de 10 mg/ml de actina e mantenha-o no gelo.
    2. Prepare o tampão GAB fresco, adicione 100 μL de GAB à alíquota da actina e misture suavemente pipetando para cima e para baixo. Incubar a solução no gelo por 1 h.
    3. Prepare APB fresco durante a incubação. Após incubação, polimerizar a actina em filamentos, adicionando 11 μL de APB à solução de actina. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo. Coloque no gelo por 20 min.
    4. Adicionar 5 μL de faloidina marcada com rodamina à solução de filamento de actina recém-polimerizada. Deixe no gelo no escuro por 1 h.
    5. Conservar o frasco para injetáveis de actina de rodamina envolto em folha de alumínio no escuro a 4 °C.
      NOTA: Sugere-se a utilização destes filamentos por um período máximo de 1 semana. A qualidade da FA pode ser confirmada todos os dias através de uma imagem rápida de uma célula de fluxo contendo apenas FAs e visualizando filamentos consistentes no dia a dia.
  8. Polimerização de actina biotinilada com estabilização de faloidina Alexa Fluor 488
    1. Descongele um frasco para injetáveis de 10 mg/ml de actina e 1 frasco para injetáveis de 1 mg/ml de actina biotinilada e mantenha-os no gelo.
    2. Faça um novo buffer GAB.
    3. Combinar os dois frascos para injetáveis (passo 2.8.1) numa relação actina:actina biotinilada de 10:1. Adicione 100 μL de GAB à mistura de actina e misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo. Incubar no gelo por 1 h.
    4. Faça APB fresco durante a incubação.
    5. Após a etapa de incubação, polimerizar a actina adicionando 11 μL de APB à solução de actina. Misture bem pipetando para cima e para baixo suavemente. Incubar no gelo por 20 min.
    6. Adicione 5 μL de faloidina marcada com Alexa Fluor 488 e incube no gelo no escuro por 1 h.
    7. Conservar o frasco para injetáveis de actina biotinilado envolto em folha de alumínio no escuro a 4 °C.
      NOTA: Estes filamentos podem ser utilizados por um período máximo de 1 semana.

3. Preparação de miosina e grânulos

  1. Reconstituir a Miosina II
    1. Gire brevemente para baixo (~ 5 s) miosina esquelética liofilizada II para coletá-la no fundo do tubo usando uma minicentrífuga padrão.
    2. Reconstituir a miosina para 10 mg/mL adicionando 100 μL de TDT 1 mM preparado em água RO.
    3. Diluir a solução de miosina de estoque 10x adicionando 10 μL de 10 mg/mL de miosina a 90 μL de TDT de 1 mM em água RO. Faça alíquotas de pequeno volume (1-5 μL), congele rapidamente e armazene a -80 °C.
      NOTA: A atividade da miosina pode ser confirmada através da realização de um ensaio de filamento deslizante padrão, conforme publicado anteriormente46,47. Consulte a discussão para uma breve descrição.
  2. Limpeza de grânulos revestidos com estreptavidina
    1. Diluir 20 μL de 1 μm de esferas de estreptavidina em 80 μL de água RO. Lavar quatro vezes girando a 9.600 × g e reconstituindo em 100 μL de água RO.
    2. Sonicate durante 2 min a 40% de amplitude e conservar os grânulos lavados num rotador a 4 °C.

4. Preparação da célula de fluxo

  1. Prepare uma solução de poli-l-lisina (PLL) adicionando 30 mL de etanol a 100% a um tubo de 50 mL e adicionando 200 μL de poli-l-lisina a 0,1% p/v em água e misture bem.
  2. Adicione uma tampa gravada à solução PLL e deixe-a de molho por 15 minutos. Remova a tampa com uma pinça, tomando o cuidado de tocar apenas na borda da tampa quando ela for puxada para cima do tubo (ver Figura 1A-C). Agarre as tampas pelas bordas com uma mão enluvada.
  3. Seque a tampa com uma companhia aérea filtrada até que não haja etanol e nenhum resíduo na tampa.
  4. Aplique dois pedaços de fita adesiva de dupla face no meio de uma lâmina de microscópio, com 3-4 mm de distância um do outro. Rasgue ou corte o excesso de fita que fica pendurado na borda do slide.
  5. Adicione a tampa revestida de PLL em cima da fita perpendicular ao longo eixo da lâmina do microscópio (formando um T) para formar um canal.
  6. Use um tubo pequeno para comprimir a tampa na fita e o microscópio deslize completamente até que a fita fique transparente (Figura 1A). Certifique-se de que não há bolhas na fita, pois isso pode causar vazamento do canal de fluxo.
    NOTA: A célula de fluxo pode conter um volume de 10-15 μL.

5. Preparação do feixe de actomiosina

  1. Em tubos separados, diluir cada tipo de filamento de actina (marcado com rodamina e biotinilado 488) 600x misturando 0,5 μL da respectiva actina marcada com 300 μL de APB. Adicione mais 5 μL da faloidina correspondentemente rotulada a cada tubo e incube no gelo no escuro por 15 min.
  2. À solução de actina biotinilada, adicionar um sistema de eliminação de oxigênio de 1 μL de beta-D-glicose a 500 mg/mL, 1 μL de glicose oxidase a 25 mg/mL e 1 μL de catalase a 500 unidades/mL. Adicionar 1 μL de 100 mM de ATP e 1 μL de grânulos de estreptavidina 100x diluídos e limpos. Mexa suavemente com uma ponta de pipeta. Coloque a suspensão num rotador a 4 °C enquanto o resto do feixe de actomiosina está a ser montado.
  3. Adicionar 15 μL da actina de rodamina diluída à célula de fluxo PLL (Figura 1D). Wick o excesso de solução através da célula de fluxo, mas não permita que o canal de fluxo fique seco. Incubar por 10 min em uma câmara de umidade.
    NOTA: As câmaras de umidade podem ser feitas de caixas de ponta de pipeta vazias com água adicionada ao fundo e a tampa coberta de folha de alumínio para bloquear a luz.
  4. Preparar uma solução de caseína de 1 mg/ml em APB.
  5. Adicionar 15 μL de 1 mg/mL de caseína para evitar a ligação inespecífica dos componentes subsequentes (Figura 1E). Incubar por 5 min em uma câmara de umidade.
  6. Adicionar a concentração desejada de miosina à suspensão de actina e grânulos biotinilados a partir da fase 5.2. Mexa suavemente com a ponta da pipeta e, em seguida, adicione imediatamente 15 μL da suspensão do passo 5.2 + a concentração de miosina desejada à célula de fluxo (Figura 1F,G). Incubar por 20 min. Sele as extremidades abertas da célula de fluxo com esmalte para evitar a evaporação durante os experimentos de imagem e aprisionamento óptico.
    NOTA: Uma concentração de solução de miosina de 1 μM produz um empacotamento robusto e pode ser usada como ponto de partida para a personalização desejada do ensaio (ver Figura 2).

6. Medições de força usando armadilha óptica (NT2 Nanotracker2)

NOTA: Embora o protocolo abaixo seja especificamente para o sistema NT2, este ensaio pode ser usado com outros sistemas de interceptação óptica, incluindo aqueles que são personalizados, que também têm recursos de fluorescência. O fluxo de trabalho geral permanece o mesmo de colocar a superfície do slide em foco, realizar calibrações de contas e adquirir dados encontrando feixes de actina fluorescentes. Para o sistema NT2, a Figura Suplementar S1, a Figura Suplementar S2, a Figura Suplementar S3, a Figura Suplementar S4, a Figura Suplementar S5, a Figura Suplementar S6 e a Figura Suplementar S7 fornecem detalhes do sistema de armadilhagem óptica e da interface do software.

  1. Ligue a caixa de controle e o laser (Figura suplementar S1).
  2. Inicie o software de computador de armadilha óptica clicando no ícone JPK Nanotracker na área de trabalho.
  3. Acorde o controle remoto clicando no botão Logitech no centro (Figura Suplementar S2).
  4. Ligue o módulo de fluorescência alternando o interruptor liga/desliga (Figura S3 Suplementar).
  5. Gire a torre do cubo de filtro para obter imagens de campo brilhante (Figura suplementar S4).
  6. Quando o sistema estiver pronto, ligue o laser usando o botão Laser Power no canto inferior esquerdo da tela a 50 mW e deixe-o estabilizar por 30 min (Figura suplementar S5).
  7. Clique sequencialmente nos botões Iluminação, Câmera, Objetivo e Movimento do Palco dentro do software para abrir essas janelas para visualização e manipulação durante o experimento. Ligue a iluminação do microscópio clicando no botão Ligar/Desligar e definindo-a para a potência máxima clicando e arrastando a barra até a direita (Figura Suplementar S5).
  8. Abra a área da amostra e remova o suporte da amostra do estágio do microscópio. Adicione a célula de fluxo, prenda-a com os suportes de amostra de metal e certifique-se de que a lâmina com a tampa esteja na parte inferior.
  9. Adicione 30 μL de água RO ao centro da objetiva inferior. Não deixe a ponta da pipeta tocar na lente. Reinsira o estágio de amostra.
    NOTA: Como o sistema NT2 usa uma objetiva de imersão em água como objetivo de aprisionamento, a mídia de imersão pode ser diferente dependendo da objetiva de aprisionamento na configuração do usuário.
  10. Levante a objetiva inferior usando as setas de controle na tela ou L2 no controle remoto até que o talão de água toque a tampa (Figura Suplementar S5).
  11. Abaixe a objetiva superior até que cerca de metade da distância até a célula de fluxo seja alcançada usando as setas na tela ou R2 no controle remoto. Adicione 170 μL de água RO ao topo da célula de fluxo diretamente abaixo da objetiva superior. Abaixe a objetiva superior até que ela quebre a tensão superficial da água e forme um menisco.
  12. Mova o estágio do microscópio usando a almofada de seta no controle remoto até que a borda da fita adjacente ao canal de fluxo seja alcançada. Feche a porta da amostra.
    NOTA: Um "clique" ao fechar a porta da amostra indica que o obturador a laser está agora aberto. Este é um recurso de segurança que só permite que o obturador abra se a porta estiver fechada.
  13. Usando a janela Objetivo na tela, coloque a borda da fita em foco trazendo a objetiva inferior chamada Objetivo a Laser para cima clicando na seta superior usando os controles na tela. Faça o mesmo para o objetivo superior clicando na seta inferior (Figura Suplementar S5).
    NOTA: As setas duplas movem o objetivo ou o estágio mais rapidamente. A borda da fita é usada para focar porque é um objeto grande e fácil de encontrar que está perto da superfície da tampa. Bolhas de ar dentro da fita são outra opção. No entanto, isso não é necessário se o usuário tiver uma rotina automatizada para encontrar o foco da superfície ou um método interno preferido.
  14. Quando a fita estiver em foco, feche parcialmente a íris na parte superior do purgador óptico. Traga a objetiva superior para baixo até que a forma de polígono da íris seja visível. Coloque essas bordas em foco, reabra a íris e acople os objetivos usando clicando no ícone de cadeado (Figura Suplementar S5).
  15. Encontre um grânulo flutuante e prenda-o clicando no botão Trap Shutter , que abrirá o obturador e permitirá que o laser de armadilha atinja a amostra. Clique no cursor Trap na tela e arraste-o para mover a localização do laser de trapping . Uma vez presa, calibre o talão para correlacionar as medições de tensão à força e ao deslocamento.
  16. Clique no botão Calibração . Ajuste a rotina de calibração com base na análise de espectros de potência e ajuste a frequência de canto dentro do software para as direções X, Y e Z (Figura S6 Suplementar).
  17. Clique em Configurações. Digite o diâmetro do talão (1.000 nm) e digite a temperatura do estágio encontrada no canto inferior esquerdo da janela do software. (ver Figura suplementar S6).
  18. Clique em Armadilha 1. Clique em X Signal. Clique em Executar para executar o ajuste de frequência de canto. Clique e arraste dentro da janela para otimizar o ajuste da função. Clique em Usá-lo para valores de sensibilidade e rigidez. Clique em Aceitar Valores. Repita para os sinais Y e Z. Feche a janela. (ver Figura suplementar S6).
    NOTA: Rotinas de calibração de talões em outros sistemas de aprisionamento óptico ou sistemas personalizados que foram testados de forma robusta pelo usuário, como o método de equipartição ou o método de força de arrasto, também são aceitáveis57,58.
  19. Encontre um feixe de actomiosina procurando por contas ligadas a FAs na superfície da tampa.
  20. Quando uma conta não lotada por outras contas flutuantes for detectada, observe os FAs ao seu redor por imagem de fluorescência para verificar a presença de um feixe.
  21. Verifique se um feixe está presente procurando por ambos os FAs fluorescentes colocalizados. Ligue a fonte de luz branca e use o cubo de filtro apropriado para obter a imagem de cada filamento de actina girando a torre (cubos de filtro de excitação de 488 nm e 532 nm para Alexa Fluor 488 e excitação de rodamina, respectivamente). Consulte a Figura suplementar S4.
    NOTA: Um experimento de controle para verificar a intensidade de fluorescência de AFs únicos pode ser útil na identificação de feixes que são compostos de um único filamento marcado com rodamina única e 488, ou aplicável a qualquer conjunto de fluoróforos que o usuário escolha usar.
  22. Uma vez verificado, prenda o talão preso ao filamento superior do feixe clicando no botão Trap Shutter .
  23. Use os controles na tela para registrar os dados clicando no botão Osciloscópio (Figura Suplementar S7). Para visualizar as medições sem registrar os dados, clique em Iniciar. Para salvar todos os dados, clique em Salvar automaticamente. Para registrar as medições, clique em Iniciar registro. Escolha quais dados devem ser visualizados em tempo real (posição, força, direção x, direção y) escolhendo no menu suspenso sinal X ou sinal Y. Lembre-se de que a direção x é da esquerda para a direita e a direção y é para cima e para baixo na tela. Consulte a Figura suplementar S7.
    NOTA: Os dados serão salvos como arquivos .out e incluem tempo, tensão, deslocamento e força para cada direção. Esses arquivos podem ser exportados para outros softwares para visualização e análise.

Resultados

As células de fluxo que contêm os sistemas de feixe de actomiosina são de um projeto padrão, consistindo de uma lâmina de microscópio e uma lâmina de cobertura gravada separada por um canal feito de fita adesiva de dupla face (Figura 1). O ensaio é então construído a partir do deslizamento de cobertura usando introduções em estágios, conforme descrito no protocolo. O ensaio final consiste em filamentos de actina marcados com rodamina; a concentração de miosina desejada (1 μM ...

Discussão

Um estudo in vitro utilizando pinças ópticas combinadas com imagens de fluorescência foi realizado para investigar a dinâmica de conjuntos de miosina interagindo com filamentos de actina. Os feixes de actina-miosina-actina foram montados usando miosina muscular II, actina de rodamina na parte inferior do feixe e na superfície da lâmina de cobertura e filamentos de actina biotinilados marcados com 488 no topo do feixe. A proteína actina do músculo coelho foi polimerizada e estabilizada usando tampões ger...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado em parte pela University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), pela University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), pelo Mississippi Space Grant Consortium sob o número de concessão NNX15AH78H (JCW, DNR) e pela American Heart Association sob o número de concessão 848586 (DNR).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Actin protein (biotin): skeletal muscleCytoskeletonAB07-ABiotinylated actin protein
Actin protein, rabbit skeletal muscleCytoskeletonAKL99-AActin protein
Alexa Fluor 488 PhalloidinInvitrogenA12379Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain
ATPFisher scientificBP413-25Required for actin assembly and myosin motility
Beta-D-glucoseFisher scientificMP218069110Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Blotting Grade Blocker (casein)Biorad1706404Used to block surface from non-specific binding
CaCl2Fisher scientificC79500Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network
CatalaseFisher scientificICN10040280Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
CoverslipsFisher scientific12544CUsed to make flow cells
DTTFisher scientificAC327190010Used for buffer preparation
EthanolFisher scientificA4094Regent used for cleaning coverslips
Glucose oxidaseFisher scientific34-538-610KUPart of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
KClFisher scientificP217-500Used for buffer preparation
KOHFisher scientificP250-1Used to etch coverslips and adjust buffer pH
MgCl2Fisher scientificM33-500Used for buffer preparation
Microscope slidesFisher scientific12-544-2Used to make flow cells
Myosin II protein: rabbit skeletal muscleCytoskeletonMY02Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle
Nanotracker2Bruker/JPKNT2Optical trapping instrument
Poly-l-lysineSigma-AldrichP8920Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip
Rhodamine PhalloidinCytoskeletonPHDR1Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain
Streptavidin beads, 1 μmSpherotechSVP-10-5Optical trapping handle
Tris-HClFisher scientificPR H5121Used for buffer preparation

Referências

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