Sondando a mecânica do conjunto de miosina em feixes de filamentos de actina usando pinças ópticas

Resumo

A formação de feixes de actomiosina in vitro e a medição da geração de força do conjunto de miosina usando pinças ópticas são apresentadas e discutidas.

Resumo

As miosinas são proteínas motoras que hidrolisam o ATP para percorrer as trilhas do filamento de actina (FA) e são essenciais em processos celulares, como motilidade e contração muscular. Para entender seus mecanismos geradores de força, a miosina II tem sido investigada tanto no nível de molécula única (SM) quanto como equipes de motores in vitro usando métodos biofísicos, como armadilhas ópticas.

Esses estudos mostraram que o comportamento gerador de força da miosina pode diferir muito quando se move do nível de molécula única em um arranjo de três esferas para grupos de motores trabalhando juntos em um grânulo rígido ou superfície de deslizamento de cobertura em um arranjo de deslizamento. No entanto, essas construções de ensaio não permitem avaliar a dinâmica de grupo da miosina dentro da hierarquia estrutural viscoelástica como fariam dentro de uma célula. Desenvolvemos um método utilizando pinças ópticas para investigar a mecânica de geração de força por conjuntos de miosina interagindo com múltiplos filamentos de actina.

Esses feixes de actomiosina facilitam a investigação em um ambiente hierárquico e complacente que captura a comunicação motora e a saída de força do conjunto. A natureza personalizável do ensaio permite alterar as condições experimentais para entender como as modificações no conjunto de miosina, no feixe de filamentos de actina ou no ambiente circundante resultam em diferentes saídas de força.

Introdução

As proteínas motoras são essenciais à vida, convertendo energia química em trabalho mecânico ^1,2,3. Os motores de miosina interagem com os filamentos de actina dando passos ao longo dos filamentos semelhantes a uma trilha, e a dinâmica das redes de actina-miosina realiza a contração muscular, a motilidade celular, o anel contrátil durante a citocinese e o movimento de carga dentro da célula, entre outras tarefas essenciais 3,4,5,6,7,8

Protocolo

1. Folhas de cobertura de gravação

1. Dissolver 100 g de KOH em 300 mL de etanol a 100% em um copo de 1.000 mL. Mexa com uma barra de agitação até que a maioria do KOH tenha se dissolvido.
   CUIDADO: A solução concentrada de KOH pode causar queimaduras e danos à roupa. Use luvas, proteção para os olhos e um jaleco.
2. Coloque as tampas individualmente em racks de limpeza de tampas.
   NOTA: Os racks são projetados com fendas que mantêm as tampas simples espaçadas para permitir a gravação e o enxágue em cada face da tampa, os orifícios de drenagem no fundo e feitos de material que pode suportar as condições adversas de gravação. Eles pod....

Resultados

As células de fluxo que contêm os sistemas de feixe de actomiosina são de um projeto padrão, consistindo de uma lâmina de microscópio e uma lâmina de cobertura gravada separada por um canal feito de fita adesiva de dupla face (Figura 1). O ensaio é então construído a partir do deslizamento de cobertura usando introduções em estágios, conforme descrito no protocolo. O ensaio final consiste em filamentos de actina marcados com rodamina; a concentração de miosina desejada (1 μM .......

Discussão

Um estudo in vitro utilizando pinças ópticas combinadas com imagens de fluorescência foi realizado para investigar a dinâmica de conjuntos de miosina interagindo com filamentos de actina. Os feixes de actina-miosina-actina foram montados usando miosina muscular II, actina de rodamina na parte inferior do feixe e na superfície da lâmina de cobertura e filamentos de actina biotinilados marcados com 488 no topo do feixe. A proteína actina do músculo coelho foi polimerizada e estabilizada usando tampões ger.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actin protein (biotin): skeletal muscle	Cytoskeleton	AB07-A	Biotinylated actin protein
Actin protein, rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99-A	Actin protein
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain
ATP	Fisher scientific	BP413-25	Required for actin assembly and myosin motility
Beta-D-glucose	Fisher scientific	MP218069110	Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Blotting Grade Blocker (casein)	Biorad	1706404	Used to block surface from non-specific binding
CaCl2	Fisher scientific	C79500	Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network
Catalase	Fisher scientific	ICN10040280	Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Coverslips	Fisher scientific	12544C	Used to make flow cells
DTT	Fisher scientific	AC327190010	Used for buffer preparation
Ethanol	Fisher scientific	A4094	Regent used for cleaning coverslips
Glucose oxidase	Fisher scientific	34-538-610KU	Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
KCl	Fisher scientific	P217-500	Used for buffer preparation
KOH	Fisher scientific	P250-1	Used to etch coverslips and adjust buffer pH
MgCl2	Fisher scientific	M33-500	Used for buffer preparation
Microscope slides	Fisher scientific	12-544-2	Used to make flow cells
Myosin II protein: rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	MY02	Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle
Nanotracker2	Bruker/JPK	NT2	Optical trapping instrument
Poly-l-lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip
Rhodamine Phalloidin	Cytoskeleton	PHDR1	Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain
Streptavidin beads, 1 μm	Spherotech	SVP-10-5	Optical trapping handle
Tris-HCl	Fisher scientific	PR H5121	Used for buffer preparation