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摘要

介绍并讨论了 体外 肌动球蛋白束的形成和使用光学镊子测量肌球蛋白集合力的产生。

摘要

肌球蛋白是水解ATP以沿着肌动蛋白丝（AF）轨道行走的运动蛋白，在运动和肌肉收缩等细胞过程中至关重要。为了了解它们的力产生机制，肌球蛋白II已经在单分子（SM）水平和使用生物物理方法（如光学捕获）在 体外作为 电机团队进行了研究。

这些研究表明，当从三珠排列中的单分子水平移动到滑动排列中的刚性珠或盖玻片表面上一起工作的电机组时，肌球蛋白力的产生行为可能会有很大差异。然而，这些测定结构不允许像在细胞内那样评估粘弹性结构层次结构中肌球蛋白的组动力学。我们开发了一种使用光学镊子的方法，以研究肌球蛋白系综与多个肌动蛋白丝相互作用的力产生机制。

这些肌动肌肽束有助于在分层和顺应的环境中进行研究，从而捕获运动通信和集合力输出。该测定的可定制性质允许改变实验条件，以了解对肌球蛋白集合、肌动蛋白丝束或周围环境的修饰如何导致不同的力输出。

引言

运动蛋白对生命至关重要，将化学能转化为机械功1，2，3。肌球蛋白马达通过沿着类似于轨道的细丝采取步骤与肌动蛋白丝相互作用，肌动蛋白-肌球蛋白网络的动力学执行肌肉收缩、细胞运动、细胞分裂过程中的收缩环以及细胞内货物的运动，以及其他基本任务3，4，5，6，7，8.由于肌球蛋白具有如此多的重要作用，肌球蛋白-肌动蛋白网络功能衰竭可导致疾病发展，例如肌球蛋白重链突变导致肥厚型心肌病（HCM）的心脏过度收缩9，10，11，12，13，14.在肌肉收缩中，单个肌球蛋白马达通过作为一个整体相互合作，以提供所需的机械能，执行AFs4，15，16，17，18的相对滑动。肌球蛋白马达在AF之间形成交叉桥，并利用由于其机械化学循环引起的构象变化共同向对齐的细丝17，18，19，20，21的倒刺端移动。

使用光学捕获等技术在SM水平上开发定量体外运动测定有助于收集有关单个肌球蛋白马达如何工作的前所未有的细节，包括测量SM力的产生和步长 22，23，24，25，26，27，28，29，30.Finer等人开发了"三珠"或"哑铃"光学捕获测定法，以探测单个肌球蛋白II电机的力产生机制23，31。由于肌肉肌球蛋白II在团队中工作以收缩AF，但在SM水平上是非过程性的，因此必须从经典的电机结合珠方法32重新排列光学捕获测定方向。为了形成哑铃测定，使用两个光学陷阱将AF固定在与盖玻片连接的珠子上的肌球蛋白马达上，并通过陷阱23内的AF运动测量单个电机输出的力。

然而，SM力和使用单电机/单丝测定方向并不能给出系统级力产生的完整图像，因为许多运动蛋白（包括肌球蛋白II）不能单独工作，并且通常不能作为其各部分的总和起作用15，16，17，32，33，34，35，36.更复杂的结构，包括一个以上的电机与不止一根细丝相互作用，对于更好地了解肌球蛋白和肌动蛋白丝网络的协同作用是必要的15，32。哑铃测定方向已被利用来研究小集合力的产生，方法是将多个肌球蛋白附着在珠子上或使用肌球蛋白厚的细丝连接到表面并允许电机与悬浮的AF4，23，34，37，38，39，40相互作用。

其他小型集合测定包括体外细丝滑动测定，其中肌球蛋白马达被涂覆在盖玻片表面上，并且使用与AF结合的珠子来探测电机组产生的力4，35，36，38，39，40，41，42，43.在这两种情况下，肌球蛋白都与刚性表面（珠子或盖玻片）结合并利用一个AF。在这些情况下，电机不能自由移动或相互通信，肌球蛋白刚性结合也不能反映电机在肌节中一起工作的顺从的分层环境32。先前的研究表明，肌球蛋白II可以通过改变力产生和占空比41，44，45等特性来感知其环境并相应地适应不断变化的粘弹性或运动浓度条件。因此，需要开发一种光学捕获测定法，以促进和捕获运动通信和系统顺应性，以更真实地描绘肌球蛋白II集合力生成的机制基础。

在这里，我们开发了一种通过形成由两个肌动蛋白丝之间相互作用的多个肌球蛋白马达组成的肌球蛋白束或三明治来将体外分层结构与光学捕获偶联的方法。这种模块化检测几何形状能够直接探测分子和环境因素如何影响集合肌球蛋白力的产生。此外，通过这些肌动蛋白 - 肌球蛋白集合研究力产生机制有可能帮助建模和理解大规模细胞任务（如肌肉收缩）如何从分子水平9，10，13向上传播。

研究方案

1. 蚀刻盖玻片

  1. 将 100 g KOH 溶解在 1，000 mL 烧杯中的 300 mL 100% 乙醇中。用搅拌棒搅拌，直到大部分 KOH 溶解。
    注意:浓缩的KOH溶液会导致灼伤和衣服损坏。戴上手套、护目镜和实验室外套。
  2. 将盖玻片单独放入盖玻片清洁架中。
    注意:机架设计有狭缝，可将单个盖玻片隔开，以便在盖玻片的每个面、底部的排水孔上进行蚀刻和冲洗，并由可以承受恶劣蚀刻条件的材料制成。它们可以定制或商业购买。
  3. 准备并标记三个 1，000 mL 烧杯:一个装有 300 mL 乙醇，两个装有 300 mL 反渗透 （RO） 水的烧杯。
    注意:在这里，RO水来自实验室净水器，但如果当地没有净化器，也可以商业购买。
  4. 将四个烧杯中的每一个放入浴超声仪中脱气5分钟。
  5. 将一排盖玻片浸入KOH和乙醇的烧杯中，超声处理5分钟。
  6. 将盖玻片架从KOH/乙醇烧杯转移到仅乙醇烧杯中。在烧杯中上下浸入架子，直到没有串珠。
    注意:注意不要打扰盖玻片或用力将架子放入烧杯中。这将导致盖玻片从机架中脱落或引起化学品飞溅。
  7. 小心地将盖玻片架从乙醇烧杯转移到水杯中，上下浸入直到没有珠子。
  8. 将盖玻片的架子浸入尚未使用的烧杯中，然后再次超声处理5分钟。
  9. 用瓶子用水喷洒盖玻片架，直到它顺利地从盖玻片上流下来。用乙醇重复。
  10. 将架子放入90°C的烤箱中干燥20分钟。将蚀刻盖玻片的架子在室温下存放在密闭容器中，以防止在使用前受到污染。

2. 肌动蛋白丝聚合

  1. 制作解决方案 T
    1. 在 50 mL 锥形管中，加入 3.94 g Tris-HCl 和 0.147 g CaCl2。加入RO水，使总体积为50 mL并充分混合。
      注意:溶液T的最终浓度分别为500mM Tris-HCl和20mM CaCl2 。
    2. 标记管溶液T并将其储存在4°C。
  2. 制作 TC 缓冲区
    1. 在 50 mL 锥形管中混合 40 mL RO 水和 1.5 mL 溶液 T。通过添加少量浓缩KOH将pH值更改为8.0。加水制成 50 mL 溶液，并验证 pH 值。如果需要，调整pH值。
      注意:最终的TC缓冲液含有pH 8时的5 mM Tris-HCl和0.2 mM CaCl2 。
    2. 标记管TC并将其储存在4°C。
  3. 制作 FC 缓冲区
    1. 将 85 mL RO 水、10 mL 溶液 T、3.73 g KCl 和 0.041 g MgCl2 加入 100 mL 缓冲瓶中。通过添加少量浓缩KOH将pH值修改至7.5。加水使最终体积为 100 mL 并验证 pH 值。
      注意:最终的FC缓冲液含有pH 7.5的500 mM Tris-HCl，500 mM KCl，2 mM MgCl2和2 mM CaCl2 。
    2. 标记管FC并将其储存在4°C。
  4. 准备一般肌动蛋白缓冲液（GAB）。
    1. 在微量离心管中混合 485 μL TC 缓冲液、10 μL 10 mM ATP 和 5 μL 50 mM DTT。
      注意:最终缓冲条件为 5 mM Tris-HCl、0.2 mM CaCl 2、0.5 mM DTT 和0.2 mM ATP。
    2. 将其标记为GAB并将其储存在4°C。
  5. 制备肌动蛋白聚合缓冲液（APB）。
    1. 在微量离心管中混合 455 μL FC 缓冲液、25 μL 100 mM ATP 和 20 μL 50 mM DTT。
      注意:最终缓冲条件为 50 mM Tris-HCl、500 mM KCl、2 mM MgCl 2、2 mM CaCl 22 mM DTT 和 5 mM ATP。
    2. 将管标记为APB并将其储存在4°C。
  6. 重组肌动蛋白
    1. 通过将 100 μL 去离子水添加到 1 mg 冻干肌动蛋白小瓶中来重建兔骨骼肌肌动蛋白。通过轻轻上下移液充分混合。分装到 5 μL 样品中，快速冷冻，并将 10 mg/mL 肌动蛋白等分试样储存在 -80 °C。
    2. 通过加入 20 μL RO 水重建生物素化的兔骨骼肌肌动蛋白。分装到 5 μL 样品中，快速冷冻，并将 1 mg/mL 生物素化的肌动蛋白等分试样储存在 -80 °C。
  7. 非标记肌动蛋白聚合与罗丹明鬼笔环肽稳定
    1. 解冻一瓶10mg / mL肌动蛋白并将其放在冰上。
    2. 准备新鲜的 GAB 缓冲液，向肌动蛋白等分试样中加入 100 μL GAB，然后轻轻上下移液混合。将溶液在冰上孵育1小时。
    3. 在孵育期间准备新鲜的APB。孵育后，通过将 11 μL APB 添加到肌动蛋白溶液中将肌动蛋白聚合成细丝。通过轻轻上下移液充分混合。放在冰上20分钟。
    4. 将 5 μL 罗丹明标记的鬼笔环肽添加到新鲜聚合的肌动蛋白丝溶液中。在黑暗中在冰上放置1小时。
    5. 将包裹在铝箔中的罗丹明肌动蛋白小瓶在4°C的黑暗中储存。
      注意:建议使用这些灯丝最多 1 周。通过对仅包含自动对焦的流通池进行快速成像并每天查看一致的细丝，可以每天确认自动对焦质量。
  8. 生物素化肌动蛋白聚合与Alexa Fluor 488鬼笔环肽稳定
    1. 解冻一瓶 10 mg/mL 肌动蛋白和 1 瓶 1 mg/mL 生物素化肌动蛋白，并将它们放在冰上。
    2. 制作新鲜的GAB缓冲液。
    3. 将两个小瓶（步骤2.8.1）以10:1的肌动蛋白:生物素化肌动蛋白比例合并。向肌动蛋白混合物中加入 100 μL GAB，并通过轻轻上下移液充分混合。在冰上孵育1小时。
    4. 在孵育过程中制作新鲜的APB。
    5. 孵育步骤后，通过将 11 μL APB 添加到肌动蛋白溶液中来聚合肌动蛋白。轻轻上下移液，充分混合。在冰上孵育20分钟。
    6. 加入 5 μL Alexa Fluor 488 标记的鬼笔环肽，并在冰上避光孵育 1 小时。
    7. 将包裹在铝箔中的生物素化肌动蛋白小瓶在4°C的黑暗中储存。
      注意:这些灯丝最多可以使用 1 周。

3. 肌球蛋白和珠子制备

  1. 重建肌球蛋白 II
    1. 使用标准微型离心机短暂旋转（~5秒）冻干骨骼肌球蛋白II，将其收集在管底部。
    2. 通过加入 100 μL 在 RO 水中制备的 1 mM DTT，将肌球蛋白复溶至 10 mg/mL。
    3. 通过将 10 μL 10 mg/mL 肌球蛋白添加到 90 μL 1 mM DTT 的 RO 水中，将原样肌球蛋白溶液稀释 10 倍。制作小体积（1-5μL）等分试样，快速冷冻，并储存在-80°C。
      注意:肌球蛋白活性可以通过执行之前发表的标准滑动丝测定来确认46，47。有关简要说明，请参阅讨论。
  2. 清洁链霉亲和素包被的磁珠
    1. 将 20 μL 1 μm 链霉亲和素珠稀释到 80 μL RO 水中。以 9，600 × g 离心并重新配入 100 μL RO 水中洗涤四次。
    2. 以40%振幅超声处理2分钟，并将洗涤的珠子储存在4°C的旋转器上。

4. 流通池制备

  1. 通过将 30 mL 100% 乙醇加入 50 mL 管中，并在水中加入 200 μL 0.1% w/v 聚 l-赖氨酸并充分混合来制备聚 l-赖氨酸溶液 （PLL）。
  2. 将蚀刻的盖玻片添加到PLL溶液中，使其浸泡15分钟。用镊子取下盖玻片，注意只接触盖玻片的边缘，因为它从管中拉起（见图1A-C）。用戴手套的手抓住盖玻片的边缘。
  3. 用过滤的空气器擦干盖玻片，直到盖玻片上没有乙醇残留物。
  4. 将两片双面胶带贴在显微镜载玻片的中间，彼此相距3-4毫米。撕下或切断悬挂在载玻片边缘的多余胶带。
  5. 将PLL涂层的盖玻片添加到垂直于显微镜载玻片长轴（形成T形）的胶带顶部以形成通道。
  6. 使用一根小管将盖玻片压缩到胶带上，显微镜载玻片彻底，直到胶带透明（图1A）。确保胶带中没有气泡，因为这会导致流道泄漏。
    注意:流通池可容纳 10-15 μL 的体积。

5.肌动球蛋白束制备

  1. 在单独的管中，通过将 0.5 μL 相对标记的肌动蛋白与 300 μL APB 混合，将每种类型的肌动蛋白丝（罗丹明和生物素化的 488 标记）稀释 600 倍。向每个试管中额外添加 5 μL 相应标记的鬼笔环肽，并在黑暗中在冰上孵育 15 分钟。
  2. 向生物素化的肌动蛋白溶液中加入 500 mg/mL 的 1 μL β-D-葡萄糖、25 mg/mL 的 1 μL 葡萄糖氧化酶和 500 单位/mL 的 1 μL 过氧化氢酶的除氧系统。加入 1 μL 100 mM ATP 和 1 μL 100x 稀释、清洁的链霉亲和素珠。用移液器吸头轻轻搅拌。将悬浮液放在4°C的旋转器上，同时组装肌动球蛋白束的其余部分。
  3. 向PLL流通池中加入15 μL稀释的罗丹明肌动蛋白（图1D）。将多余的溶液吸干通过流通池，但不要让流道变干。在湿度室中孵育10分钟。
    注意:湿度室可以由空的移液器吸头盒制成，底部加水，盖子上覆盖铝箔以阻挡光线。
  4. 在 APB 中制备 1 mg/mL 酪蛋白溶液。
  5. 加入 15 μL 1 mg/mL 酪蛋白，以防止后续组分的非特异性结合（图 1E）。在湿度室中孵育5分钟。
  6. 将所需浓度的肌球蛋白添加到步骤5.2中的生物素化肌动蛋白和珠悬浮液中。用移液器吸头轻轻搅拌，然后立即向流通池中加入 15 μL 步骤 5.2 悬浮液 + 所需的肌球蛋白浓度（图 1F，G）。孵育20分钟。用指甲油密封流通池的开口端，以防止成像和光学捕获实验期间蒸发。
    注意:肌球蛋白溶液浓度为1μM可产生稳健的捆绑，并可用作所需测定定制的起点（见 图2）。

6. 使用光学陷阱（NT2纳米跟踪仪）进行力测量2

注意:虽然以下方案专门用于NT2系统，但该测定可以与其他光学捕获系统一起使用，包括那些定制的，也具有荧光功能。一般工作流程与聚焦载玻片表面、执行磁珠校准以及通过查找荧光肌动蛋白束获取数据相同。对于NT2系统，补充图S1、补充图S2、补充图S3、补充图S4、补充图 S5、补充图S6和补充图S7 提供了光捕获系统和软件界面的详细信息。

  1. 打开控制盒和激光（补充图S1）。
  2. 通过单击桌面上的 JPK纳米跟踪器 图标启动光学陷阱计算机软件。
  3. 通过单击中间的 罗技 按钮唤醒遥控器（补充图 S2）。
  4. 通过切换开/关开关打开荧光模块（补充图S3）。
  5. 转动滤光片立方体转盘进行明场成像（补充图S4）。
  6. 系统准备就绪后，使用屏幕左下角的激光功率按钮将激光器打开至 50 mW，并使其稳定 30 分钟（补充图 S5）。
  7. 依次单击软件中的 照明、相机、物镜 和 载物台移动 按钮，以调出这些窗口，以便在实验过程中进行查看和操作。通过单击 开/关 按钮打开显微镜照明，并通过单击并一直向右拖动条将其设置为最大功率（补充图S5）。
  8. 打开样品区域并从显微镜载物台上取下样品架。添加流通池，用金属样品架固定，并确保带有盖玻片的载玻片位于底部。
  9. 在底部物镜的中心加入30 μLRO水。不要让移液器吸头接触镜头。重新插入样品台。
    注意:由于NT2系统使用水浸物镜作为捕集物镜，因此浸没介质可能会有所不同，具体取决于用户设置中的捕集物镜。
  10. 使用遥控器上的屏幕控制箭头或L2升高下部物镜，直到水珠接触盖玻片（补充图S5）。
  11. 降低顶部物镜，直到使用遥控器上的屏幕箭头或R2达到到流通池距离的一半左右。将 170 μL RO 水添加到流通池顶部的顶部，直接位于顶部物镜下方。降低顶部物镜，直到它破坏水的表面张力并形成弯月面。
  12. 使用遥控器上的箭头垫移动显微镜载物台，直到到达靠近流道的胶带边缘。关闭样品门。
    注意:关闭样品门时"咔嗒"声表示激光快门现已打开。这是一项安全功能，仅在门关闭时允许百叶窗打开。
  13. 使用屏幕中的物镜窗口，通过使用屏幕上的控件单击上方箭头，将名为"激光物镜"的底部物镜向上调，从而使胶带边缘清晰对焦。 通过单击底部箭头对顶部目标执行相同的操作（补充图S5）。
    注意:双箭头可更快地移动物镜或舞台。胶带的边缘用于聚焦，因为它是一个靠近盖玻片表面的大型、易于找到的物体。胶带内的气泡是另一种选择。但是，如果用户有自动例程来查找表面焦点或首选的内部方法，则不需要这样做。
  14. 胶带对焦后，部分关闭光学陷阱顶部的光圈。向下放置顶部物镜，直到虹膜的多边形形状可见。聚焦这些边缘，重新打开光圈，然后通过单击 挂锁 图标来耦合物镜（补充图S5）。
  15. 找到一个漂浮的珠子并通过单击陷阱快门按钮来捕获它，这将打开 快门 并允许捕获激光击中样品。单击屏幕上的 陷 印光标并拖动它以移动陷印激光的位置。捕获后，校准磁珠以将电压测量值与力和位移相关联。
  16. 单击 校准 按钮。根据功率谱分析调整校准程序，并在软件中针对 X、Y 和 Z 方向拟合转角频率（补充图 S6）。
  17. 单击 设置。输入磁珠的直径（1，000 nm），并在软件窗口左下角输入载物台的温度。（见 补充图S6）。
  18. 单击 陷阱 1。点击 X 信号。单击 "运行 "以执行拐角频率拟合。在窗口中单击并拖动以优化功能拟合。单击" 使用它" 以获取灵敏度和刚度值。单击接受 值。对 Y 和 Z 信号重复此操作。关闭窗口。（见 补充图S6）。
    注意:其他光学捕获系统或经过用户可靠测试的定制系统上的磁珠校准程序（例如均分法或拖曳力法）也是可以接受的57，58。
  19. 通过搜索与盖玻片表面的 AF 结合的磁珠来查找肌动肌肽束。
  20. 当检测到没有其他浮珠拥挤的磁珠时，通过荧光成像观察其周围的AF以验证是否存在束。
  21. 通过查找共定位的两个荧光AF来验证是否存在束。打开白色光源，并使用适当的滤光片立方体通过转动转塔对每个肌动蛋白丝进行成像（Alexa Fluor 488 和罗丹明激发分别为 488 nm 和 532 nm 激发滤光片立方体）。见 补充图S4。
    注意:验证单个AF荧光强度的对照实验可用于识别由单个488和单个罗丹明标记的细丝组成的束，或适用于用户选择使用的任何一组荧光团。
  22. 验证后，通过单击 陷阱快门 按钮捕获附着在束顶部细丝上的珠子。
  23. 使用屏幕上的控件通过单击 示波器 按钮来记录数据（补充图 S7）。要在不记录数据的情况下可视化测量，请单击 "开始"。要保存所有数据，请单击 自动保存。要记录测量值，请单击 "开始记录"。通过从下拉菜单中选择 X 信号或 Y 信号，选择要实时可视化的数据（位置、力、x 方向、y 方向）。请记住，xdirection 是从左到右的，y 方向在屏幕上是上下的。见 补充图S7。
    注意:数据将另存为 .out 文件，包括每个方向的时间、电压、位移和力。这些文件可以导出到其他软件中进行可视化和分析。

结果

含有肌动球蛋白束系统的流通池采用标准设计，由显微镜载玻片和蚀刻盖玻片组成，由双面胶带制成的通道隔开（图1）。然后使用协议中所述的分阶段引入从盖玻片开始构建测定。最终测定由模板罗丹明标记的肌动蛋白丝组成;所需的肌球蛋白浓度（图 2 和 图3中的代表性结果使用1μM）;生物素化，Alexa Fluor 488标记的肌动蛋白丝;1μ...

讨论

使用光镊结合荧光成像进行体 外 研究，以研究肌球蛋白集合与肌动蛋白丝相互作用的动力学。肌动蛋白-肌球蛋白-肌动蛋白束使用肌球蛋白II，罗丹明肌动蛋白在束底部和盖玻片表面组装，488标记的生物素化肌动蛋白丝在束的顶部组装。来自兔肌肉的肌动蛋白使用通用肌动蛋白缓冲液（GAB）和肌动蛋白聚合缓冲液（APB）聚合和稳定。GAB 和 APB 必须每天在实验室中使用 ATP、FC 缓冲液和 TC 缓?...

披露声明

作者没有利益冲突需要声明。

致谢

这项工作得到了密西西比大学研究生会研究奖学金（OA），密西西比大学Sally McDonnell-Barksdale荣誉学院（JCW，JER），密西西比州太空资助联盟（资助号NNX15AH78H）（JCW，DNR）和美国心脏协会（资助号848586（DNR）的部分支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Actin protein (biotin): skeletal muscleCytoskeletonAB07-ABiotinylated actin protein
Actin protein, rabbit skeletal muscleCytoskeletonAKL99-AActin protein
Alexa Fluor 488 PhalloidinInvitrogenA12379Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain
ATPFisher scientificBP413-25Required for actin assembly and myosin motility
Beta-D-glucoseFisher scientificMP218069110Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Blotting Grade Blocker (casein)Biorad1706404Used to block surface from non-specific binding
CaCl2Fisher scientificC79500Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network
CatalaseFisher scientificICN10040280Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
CoverslipsFisher scientific12544CUsed to make flow cells
DTTFisher scientificAC327190010Used for buffer preparation
EthanolFisher scientificA4094Regent used for cleaning coverslips
Glucose oxidaseFisher scientific34-538-610KUPart of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
KClFisher scientificP217-500Used for buffer preparation
KOHFisher scientificP250-1Used to etch coverslips and adjust buffer pH
MgCl2Fisher scientificM33-500Used for buffer preparation
Microscope slidesFisher scientific12-544-2Used to make flow cells
Myosin II protein: rabbit skeletal muscleCytoskeletonMY02Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle
Nanotracker2Bruker/JPKNT2Optical trapping instrument
Poly-l-lysineSigma-AldrichP8920Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip
Rhodamine PhalloidinCytoskeletonPHDR1Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain
Streptavidin beads, 1 μmSpherotechSVP-10-5Optical trapping handle
Tris-HClFisher scientificPR H5121Used for buffer preparation

参考文献

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