Sondare la meccanica dell'ensemble di miosina in fasci di filamenti di actina usando pinzette ottiche

Riepilogo

Viene presentata e discussa la formazione di fasci di actomiosina in vitro e la misurazione della generazione della forza dell'insieme di miosina utilizzando pinzette ottiche.

Abstract

Le miosine sono proteine motorie che idrolizzano l'ATP per camminare lungo le tracce del filamento di actina (AF) e sono essenziali nei processi cellulari come la motilità e la contrazione muscolare. Per comprendere i loro meccanismi di generazione della forza, la miosina II è stata studiata sia a livello di singola molecola (SM) che come team di motori in vitro utilizzando metodi biofisici come l'intrappolamento ottico.

Questi studi hanno dimostrato che il comportamento di generazione della forza della miosina può differire notevolmente quando si passa dal livello di singola molecola in una disposizione a tre sfere a gruppi di motori che lavorano insieme su una superficie rigida di tallone o di copertura in una disposizione di scorrimento. Tuttavia, queste costruzioni di saggi non consentono di valutare la dinamica di gruppo della miosina all'interno della gerarchia strutturale viscoelastica come farebbero all'interno di una cellula. Abbiamo sviluppato un metodo che utilizza pinzette ottiche per studiare la meccanica della generazione di forza da parte di insiemi di miosina che interagiscono con più filamenti di actina.

Questi fasci di actomiosina facilitano l'indagine in un ambiente gerarchico e conforme che cattura la comunicazione motoria e l'output della forza d'insieme. La natura personalizzabile del test consente di alterare le condizioni sperimentali per capire come le modifiche all'insieme di miosina, al fascio di filamenti di actina o all'ambiente circostante si traducono in diversi output di forza.

Introduzione

Le proteine motorie sono essenziali per la vita, convertendo l'energia chimica in lavoro meccanico ^1,2,3. I motori della miosina interagiscono con i filamenti di actina prendendo passi lungo i filamenti simili a una traccia, e la dinamica delle reti actina-miosina svolge la contrazione muscolare, la motilità cellulare, l'anello contrattile durante la citochinesi e il movimento del carico all'interno della cellula, tra gli altri compiti essenziali 3,4,5,6,7,8 . Poiché le miosine hanno così tanti ruoli essenziali, il fallimento nella funzionalità della rete miosina-actina può portare allo sviluppo di malattie, come mutazioni nella catena pesante della miosina che causano ipercontrattilità cardiaca nella cardiomiopatia ipertrofica (HCM)9,10,11,12,13,14 . Nella contrazione muscolare, i singoli motori della miosina cooperano tra loro lavorando come un insieme per fornire l'energia meccanica richiesta che esegue lo scorrimento relativo delle AF 4,15,16,17,18. I motori della miosina formano ponti trasversali tra le AF e utilizzano cambiamenti conformazionali dovuti al suo ciclo meccanochimico per spostarsi collettivamente verso l'estremità spinata dei filamenti allineati 17,18,19,20,21.

Lo sviluppo di saggi quantitativi di motilità in vitro a livello SM utilizzando tecniche come l'intrappolamento ottico ha facilitato la raccolta di dettagli senza precedenti su come funzionano i singoli motori della miosina, compresa la misurazione della generazione della forza SM e delle dimensioni dei passi 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. hanno sviluppato il saggio di intrappolamento ottico "a tre perle" o "manubri" per sondare la meccanica di generazione della forza dei motori a singola miosina II^23,31. Poiché la miosina muscolare II lavora in team per contrarre la fibrillazione atriale ma non è processiva a livello SM, l'orientamento del saggio di intrappolamento ottico ha dovuto essere riorganizzato dal classico approccio a perline legate al motore³². Per formare il test con manubri, sono state utilizzate due trappole ottiche per tenere un AF su un motore di miosina legato a un tallone attaccato al coprifoglio, e la forza emessa dal singolo motore è stata misurata attraverso i movimenti dell'AF all'interno della trappola²³.

Tuttavia, le forze SM e l'utilizzo di un singolo motore / singolo filamento di orientamento del saggio non forniscono un'immagine completa della generazione di forza a livello di sistema poiché molte proteine motorie, inclusa la miosina II, non funzionano isolatamente e spesso non funzionano come somma delle loro parti 15,16,17,32,33,34,35,36 . Strutture più complesse che includono più di un motore che interagisce con più di un filamento sono necessarie per comprendere meglio la sinergia delle reti di filamenti di miosina e actina ^15,32. L'orientamento del saggio con manubri è stato sfruttato per studiare la generazione di piccole forze d'insieme avendo miosine multiple attaccate a una perlina o usando un filamento spesso miosina attaccato a una superficie e consentendo ai motori di interagire con l'AF sospeso 4,23,34,37,38,39,40.

Altri piccoli saggi di ensemble includono un saggio di scorrimento a filamento in vitro in cui i motori della miosina sono rivestiti su una superficie di copertura e un tallone legato a un AF viene utilizzato per sondare la forza generata dal team di motori 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . In entrambi i casi, le miosine sono legate a una superficie rigida – perlina o coprislip – e utilizzano una fibrillazione atriale. In questi casi, i motori non sono in grado di muoversi liberamente o comunicare tra loro, né avere miosine rigidamente legate riflette l'ambiente gerarchico e conforme in cui i motori lavorerebbero insieme nel sarcomero³². Studi precedenti hanno suggerito che la miosina II può percepire il suo ambiente e adattarsi di conseguenza alle mutevoli condizioni di concentrazione viscoelastica o motoria alterando caratteristiche come la generazione di forza e il rapporto di lavoro^41,44,45. Pertanto, è necessario sviluppare un saggio di intrappolamento ottico che promuova e catturi la comunicazione motoria e la conformità del sistema per dipingere un quadro più realistico delle basi meccanicistiche della generazione della forza dell'insieme di miosina II.

Qui, abbiamo sviluppato un metodo per accoppiare la struttura gerarchica in vitro con l'intrappolamento ottico formando fasci di actomiosina o sandwich costituiti da più motori di miosina che interagiscono tra due filamenti di actina. Questa geometria di saggio modulare ha la capacità di sondare direttamente come i fattori molecolari e ambientali influenzano la generazione della forza della miosina dell'insieme. Inoltre, studiare i meccanismi di generazione della forza attraverso questi insiemi di actina-miosina ha il potenziale per aiutare a modellare e comprendere come i compiti cellulari su larga scala, come la contrazione muscolare, si propagano dal livello molecolare 9,10,13.

Protocollo

1. Copertine per incisione

1. Sciogliere 100 g di KOH in 300 ml di etanolo al 100% in un becher da 1.000 ml. Mescolare con una barra di mescolamento fino a quando la maggior parte del KOH si è sciolta.
   ATTENZIONE: La soluzione concentrata di KOH può causare ustioni e danni agli indumenti. Indossare guanti, protezioni per gli occhi e un camice da laboratorio.
2. Posizionare i coprivetrini singolarmente negli scaffali per la pulizia dei coprifogli.
   NOTA: I rack sono progettati con fessure che contengono singoli vetrini distanziati per consentire l'incisione e il risciacquo su ciascuna faccia del coprivetrino, i fori di scarico sul fondo e realizzati in materiale in grado di resistere alle difficili condizioni di incisione. Possono essere realizzati su misura o acquistati commercialmente.
3. Preparare ed etichettare tre becher da 1.000 ml: uno con 300 ml di etanolo e due becher con 300 ml di acqua ad osmosi inversa (RO).
   NOTA: Qui, l'acqua RO proviene da un depuratore d'acqua di laboratorio, ma potrebbe anche essere acquistata commercialmente se non è disponibile un depuratore locale.
4. Posizionare ciascuno dei quattro becher in un sonicatore da bagno per degassare per 5 minuti.
5. Immergere un rack di coprivetrini nel becher di KOH ed etanolo e sonicare per 5 minuti.
6. Trasferire il rack dei vetrini di copertura dal becher KOH/etanolo al becher di solo etanolo. Immergere il rack su e giù nel becher fino a quando non c'è perline.
   NOTA: Fare attenzione a non disturbare i coperchi o a far cadere con forza il rack nel becher. Ciò causerà la fuoriuscita dei coperchi dal rack o causerà schizzi chimici.
7. Trasferire con cautela il rack di coperchi dal becher di etanolo a un becher d'acqua, immergendo su e giù fino a quando non c'è perline.
8. Immergere il rack di coperchi nel becher d'acqua che non è stato ancora utilizzato e sonicare di nuovo per 5 minuti.
9. Utilizzare una bottiglia per spruzzare il rack di coprivetrini con acqua fino a quando non scorre senza intoppi dai coprivetrini. Ripetere con l'etanolo.
10. Mettere le griglie ad asciugare in forno a 90 °C per 20 minuti. Conservare i rack dei vetrini incisi a temperatura ambiente in contenitori chiusi per evitare contaminazioni prima dell'uso.

2. Polimerizzazione del filamento di actina

1. Crea soluzione T
   1. In un tubo conico da 50 ml, aggiungere 3,94 g di Tris-HCl e 0,147 g di CaCl₂. Aggiungere acqua RO per ottenere un volume totale di 50 ml e mescolare bene.
      NOTA: Le concentrazioni finali della Soluzione T sono rispettivamente 500 mM Tris-HCl e 20 mM CaCl_2.
   2. Etichettare il tubo Soluzione T e conservarlo a 4 °C.
2. Crea buffer TC
   1. Mescolare 40 mL di acqua RO e 1,5 mL di Soluzione T in un tubo conico da 50 mL. Modificare il pH a 8,0 aggiungendo piccole quantità di KOH concentrato. Aggiungere acqua per ottenere 50 ml della soluzione e verificare il pH. Regolare il pH se necessario.
      NOTA: Il tampone TC finale contiene 5 mM di Tris-HCl e 0,2 mM di CaCl₂ a pH 8.
   2. Etichettare il tubo TC e conservarlo a 4 °C.
3. Crea buffer FC
   1. Aggiungere 85 ml di acqua RO, 10 ml di soluzione T, 3,73 g di KCl e 0,041 g di MgCl₂ in un flacone tampone da 100 ml. Modificare il pH a 7,5 aggiungendo piccoli volumi di KOH concentrato. Aggiungere acqua per ottenere un volume finale di 100 ml e verificare il pH.
      NOTA: il buffer FC finale contiene 500 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 2 mM MgCl 2 e 2 mM CaCl₂ a pH 7,5.
   2. Etichettare il tubo FC e conservarlo a 4 °C.
4. Preparare il tampone generale di actina (GAB).
   1. Miscelare 485 μL di tampone TC, 10 μL di 10 mM ATP e 5 μL di 50 mM DTT in una provetta da microcentrifuga.
      NOTA: le condizioni finali del buffer sono 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl 2, 0,5 mM DTT e_0,2 mM ATP.
   2. Etichettarlo come GAB e conservarlo a 4 °C.
5. Preparare il tampone di polimerizzazione dell'actina (APB).
   1. Miscelare 455 μL di tampone FC, 25 μL di 100 mM di ATP e 20 μL di 50 mM DTT in una provetta da microcentrifuga.
      NOTA: Le condizioni tampone finali sono 50 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl₂ 2 mM DTT e 5 mM ATP.
   2. Etichettare il tubo come APB e conservarlo a 4 °C.
6. Ricostituire l'actina
   1. Ricostituire l'actina del muscolo scheletrico di coniglio aggiungendo 100 μL di acqua deionizzata a un flaconcino da 1 mg di actina liofilizzata. Mescolare bene pipettando delicatamente su e giù. Aliquote in campioni da 5 μL, congelare a scatto e conservare le aliquote di actina da 10 mg/mL a -80 °C.
   2. Ricostituire l'actina del muscolo scheletrico di coniglio biotinilato aggiungendo 20 μL di acqua RO. Aliquote in campioni da 5 μL, congelare a scatto e conservare le aliquote di actina biotinilata da 1 mg/mL a -80 °C.
7. Polimerizzazione dell'actina non marcata con stabilizzazione della rodamina falloidina
   1. Scongelare un flaconcino da 10 mg/mL di actina e tenerlo in ghiaccio.
   2. Preparare il tampone GAB fresco, aggiungere 100 μL di GAB all'aliquota di actina e mescolare pipettando delicatamente su e giù. Incubare la soluzione sul ghiaccio per 1 ora.
   3. Preparare APB fresco durante l'incubazione. Dopo l'incubazione, polimerizzare l'actina in filamenti aggiungendo 11 μL di APB alla soluzione di actina. Mescolare bene pipettando delicatamente su e giù. Mettere in ghiaccio per 20 min.
   4. Aggiungere 5 μL di falloidina marcata con rodamina alla soluzione di filamento di actina appena polimerizzata. Lasciare sul ghiaccio al buio per 1 ora.
   5. Conservare il flaconcino di rodamina actina avvolto in un foglio di alluminio al buio a 4 °C.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare questi filamenti per un periodo massimo di 1 settimana. La qualità della fibrillazione atriale può essere confermata ogni giorno attraverso una rapida immagine di una cella di flusso contenente solo AF e visualizzando filamenti coerenti giorno per giorno.
8. Polimerizzazione di actina biotinilata con stabilizzazione della falloidina Alexa Fluor 488
   1. Scongelare un flaconcino di actina da 10 mg/mL e 1 flaconcino di actina biotinilata da 1 mg/mL e tenerli sotto ghiaccio.
   2. Crea un nuovo buffer GAB.
   3. Unire i due flaconcini (punto 2.8.1) in un rapporto actina:actina biotinilata 10:1. Aggiungere 100 μL di GAB alla miscela di actina e mescolare bene pipettando delicatamente su e giù. Incubare su ghiaccio per 1 ora.
   4. Fai APB fresco durante l'incubazione.
   5. Dopo la fase di incubazione, polimerizzare l'actina aggiungendo 11 μL di APB alla soluzione di actina. Mescolare bene pipettando su e giù delicatamente. Incubare su ghiaccio per 20 min.
   6. Aggiungere 5 μL di falloidina marcata con Alexa Fluor 488 e incubare sul ghiaccio al buio per 1 ora.
   7. Conservare il flaconcino di actina biotinilata avvolto in un foglio di alluminio al buio a 4 °C.
      NOTA: Questi filamenti possono essere utilizzati per un periodo massimo di 1 settimana.

3. Preparazione della miosina e delle perline

1. Ricostituire la miosina II
   1. Ruotare brevemente verso il basso (~ 5 s) miosina scheletrica II liofilizzata per raccoglierla sul fondo del tubo usando una minicentrifuga standard.
   2. Ricostituire la miosina a 10 mg/ml aggiungendo 100 μL di 1 mM DTT preparato in acqua RO.
   3. Diluire la soluzione madre di miosina 10x aggiungendo 10 μL di 10 mg/mL di miosina a 90 μL di 1 mM DTT in acqua RO. Produrre aliquote di piccolo volume (1-5 μL), congelare a scatto e conservare a -80 °C.
      NOTA: L'attività della miosina può essere confermata eseguendo un saggio standard del filamento di scorrimento come pubblicato in precedenza^46,47. Vedere la discussione per una breve descrizione.
2. Pulizia delle perle rivestite di streptavidina
   1. Diluire 20 μL di sfere di streptavidina da 1 μm in 80 μL di acqua RO. Lavare quattro volte centrifugando a 9.600 × g e ricostituendo in 100 μL di acqua RO.
   2. Sonicare per 2 minuti al 40% di ampiezza e conservare le perle lavate su un rotatore a 4 °C.

4. Preparazione della cella di flusso

1. Preparare una soluzione di poli-l-lisina (PLL) aggiungendo 30 ml di etanolo al 100% in un tubo da 50 ml e aggiungendo 200 μL di 0,1% p/v di poli-l-lisina in acqua e mescolare bene.
2. Aggiungere un coprislip inciso alla soluzione PLL e lasciarlo in ammollo per 15 minuti. Rimuovere il coprislip con una pinzetta, avendo cura di toccare solo il bordo del coprivetrino mentre viene tirato verso l'alto dal tubo (vedi figura 1A-C). Afferrare le copertine per i bordi con una mano guantata.
3. Asciugare il coprislip con una linea filtrata fino a quando non rimane etanolo e nessun residuo sul coprifoglio.
4. Applicare due pezzi di nastro adesivo biadesivo al centro di un vetrino da microscopio, a 3-4 mm di distanza l'uno dall'altro. Strappare o tagliare il nastro in eccesso che pende dal bordo della diapositiva.
5. Aggiungere il coprislip rivestito in PLL sulla parte superiore del nastro perpendicolare all'asse lungo del vetrino del microscopio (formando una T) per formare un canale.
6. Utilizzare un tubicino per comprimere il vetrino sul nastro e il vetrino del microscopio accuratamente fino a quando il nastro non è trasparente (Figura 1A). Assicurarsi che non vi siano bolle nel nastro in quanto ciò può causare perdite dal canale di flusso.
   NOTA: La cella di flusso può contenere un volume di 10-15 μL.

5. Preparazione del fascio di actiomiosina

1. In provette separate, diluire ogni tipo di filamento di actina (marcato con rodamina e biotinilato 488) 600x mescolando 0,5 μL della relativa actina marcata con 300 μL di APB. Aggiungere altri 5 μL della falloidina marcata in modo corrispondente a ciascuna provetta e incubare sul ghiaccio al buio per 15 minuti.
2. Alla soluzione di actina biotinilata, aggiungere un sistema di evacuazione dell'ossigeno di 1 μL di beta-D-glucosio a 500 mg / ml, 1 μL di glucosio ossidasi a 25 mg / ml e 1 μL di catalasi a 500 unità / ml. Aggiungere 1 μL di 100 mM di ATP e 1 μL di perle di streptavidina diluite e pulite 100x. Mescolare delicatamente con una punta di pipetta. Mettere la sospensione su un rotatore a 4 °C mentre il resto del fascio di actomiosina viene assemblato.
3. Aggiungere 15 μL di rodamina actina diluita alla cella di flusso PLL (Figura 1D). Stoppare la soluzione in eccesso attraverso la cella di flusso, ma non lasciare che il canale di flusso si asciughi. Incubare per 10 minuti in una camera di umidità.
   NOTA: Le camere di umidità possono essere realizzate con scatole di punta per pipette vuote con acqua aggiunta sul fondo e coperchio coperto in foglio di alluminio per bloccare la luce.
4. Preparare una soluzione di caseina da 1 mg/mL in APB.
5. Aggiungere 15 μL di caseina da 1 mg/mL per evitare il legame non specifico dei componenti successivi (Figura 1E). Incubare per 5 minuti in una camera di umidità.
6. Aggiungere la concentrazione desiderata di miosina all'actina biotinilata e alla sospensione di perline dal punto 5.2. Mescolare delicatamente con la punta della pipetta, quindi aggiungere immediatamente 15 μL della sospensione del passo 5.2 + la concentrazione di miosina desiderata alla cella di flusso (Figura 1F,G). Incubare per 20 min. Sigillare le estremità aperte della cella di flusso con smalto per unghie per evitare l'evaporazione durante gli esperimenti di imaging e di intrappolamento ottico.
   NOTA: Una concentrazione di soluzione di miosina di 1 μM produce un raggruppamento robusto e può essere utilizzata come punto di partenza per la personalizzazione desiderata del saggio (vedere Figura 2).

6. Misurazioni della forza utilizzando trappola ottica (NT2 Nanotracker2)

NOTA: mentre il protocollo riportato di seguito è specifico per il sistema NT2, questo test può essere utilizzato con altri sistemi di intrappolamento ottico, compresi quelli costruiti su misura, che hanno anche capacità di fluorescenza. Il flusso di lavoro generale rimane lo stesso di mettere a fuoco la superficie del vetrino, eseguire calibrazioni di perline e acquisire dati trovando fasci di actina fluorescenti. Per il sistema NT2, la figura supplementare S1, la figura supplementare S2, la figura supplementare S3, la figura supplementare S4, la figura supplementare S5, la figura supplementare S6 e la figura supplementare S7 forniscono dettagli sul sistema di intrappolamento ottico e sull'interfaccia software.

1. Accendere la scatola di controllo e il laser (Figura supplementare S1).
2. Avviare il software del computer trappola ottica facendo clic sull'icona JPK Nanotracker sul desktop.
3. Riattivare il telecomando facendo clic sul pulsante Logitech al centro (figura supplementare S2).
4. Accendere il modulo di fluorescenza attivando o disattivando l'interruttore (Figura supplementare S3).
5. Ruotare la torretta del cubo del filtro per l'imaging in campo chiaro (Figura supplementare S4).
6. Una volta che il sistema è pronto, accendere il laser utilizzando il pulsante di accensione laser nell'angolo in basso a sinistra dello schermo a 50 mW e lasciarlo stabilizzare per 30 minuti (Figura supplementare S5).
7. Fare clic in sequenza sui pulsanti Illuminazione, Fotocamera, Obiettivo e Movimento palcoscenico all'interno del software per visualizzare e modificare tali finestre durante l'esperimento. Accendere l'illuminazione del microscopio facendo clic sul pulsante On/Off e impostandolo sulla massima potenza facendo clic e trascinando la barra completamente verso destra (Figura supplementare S5).
8. Aprire l'area del campione e rimuovere il supporto del campione dallo stadio del microscopio. Aggiungere la cella di flusso, fissarla con i portacampioni metallici e assicurarsi che il vetrino con il coprislip sia sul fondo.
9. Aggiungere 30 μL di acqua RO al centro dell'obiettivo inferiore. Non lasciare che la punta della pipetta tocchi l'obiettivo. Reinserire la fase di esempio.
   NOTA: poiché il sistema NT2 utilizza un obiettivo di immersione in acqua come obiettivo di intrappolamento, il supporto di immersione può essere diverso a seconda dell'obiettivo di abbondanza nella configurazione dell'utente.
10. Sollevare l'obiettivo inferiore utilizzando le frecce di controllo sullo schermo o L2 sul telecomando fino a quando il tallone d'acqua tocca il coprislip (Figura supplementare S5).
11. Abbassare l'obiettivo superiore fino a raggiungere circa la metà della distanza dalla cella di flusso utilizzando le frecce sullo schermo o R2 sul telecomando. Aggiungere 170 μL di acqua RO alla parte superiore della cella di flusso direttamente sotto l'obiettivo superiore. Abbassare l'obiettivo superiore fino a quando non rompe la tensione superficiale dell'acqua e forma un menisco.
12. Spostare lo stadio del microscopio utilizzando il pad a freccia sul telecomando fino a raggiungere il bordo del nastro adiacente al canale di flusso. Chiudere lo sportello del campione.
    NOTA: un "clic" alla chiusura dello sportello del campione indica che l'otturatore laser è ora aperto. Questa è una funzione di sicurezza che consente l'apertura della tapparella solo se la porta è chiusa.
13. Utilizzando la finestra Obiettivo sullo schermo, mettere a fuoco il bordo del nastro spostando verso l'alto l'obiettivo inferiore denominato Obiettivo laser facendo clic sulla freccia superiore utilizzando i controlli sullo schermo. Fate lo stesso per l'obiettivo superiore facendo clic sulla freccia inferiore (Figura supplementare S5).
    NOTA: le doppie frecce spostano l'obiettivo o lo stage più velocemente. Il bordo del nastro viene utilizzato per la messa a fuoco perché è un oggetto grande e facile da trovare che si trova vicino alla superficie del coprifoglio. Le bolle d'aria all'interno del nastro sono un'altra opzione. Tuttavia, questa operazione non è necessaria se l'utente dispone di una routine automatizzata per trovare lo stato attivo della superficie o di un metodo interno preferito.
14. Una volta che il nastro è a fuoco, chiudere parzialmente il diaframma nella parte superiore della trappola ottica. Abbassa l'obiettivo superiore fino a quando non è visibile la forma poligonale dell'iride. Mettere a fuoco questi bordi, riaprire il diaframma, quindi accoppiare gli obiettivi facendo clic sull'icona del lucchetto (Figura supplementare S5).
15. Trova una perlina galleggiante e intrappolala facendo clic sul pulsante Trap Shutter , che aprirà l'otturatore e consentirà al laser di intrappolare il campione. Fare clic sul cursore Abbondanza sullo schermo e trascinarlo per spostare la posizione del laser di abbondanza . Una volta intrappolato, calibrare il tallone per correlare le misurazioni della tensione alla forza e allo spostamento.
16. Fare clic sul pulsante Calibrazione . Regolare la routine di calibrazione in base all'analisi degli spettri di potenza e adattare la frequenza d'angolo all'interno del software per le direzioni X, Y e Z (Figura supplementare S6).
17. Fare clic su Impostazioni. Digitare il diametro del tallone (1.000 nm) e digitare la temperatura dello stadio che si trova in basso a sinistra della finestra del software. (cfr . figura supplementare S6).
18. Fare clic su Trap 1. Fare clic su Segnale X. Fare clic su Esegui per eseguire l'adattamento della frequenza d'angolo. Fare clic e trascinare all'interno della finestra per ottimizzare la funzione di adattamento. Fare clic su Usalo per i valori di sensibilità e rigidità. Fare clic su Accetta valori. Ripetere l'operazione per i segnali Y e Z. Chiudere la finestra. (cfr . figura supplementare S6).
    NOTA: Le routine di calibrazione del tallone su altri sistemi di intrappolamento ottico o sistemi personalizzati che sono stati testati in modo robusto dall'utente, come il metodo di equipartizione o il metodo della forza di trascinamento, sono accettabili anche^57,58.
19. Trova un fascio di actomiosina cercando perline legate alle AF sulla superficie del vetrino.
20. Quando viene rilevata una perla non affollata da altre perle galleggianti, osservare gli AF intorno ad essa mediante imaging a fluorescenza per verificare la presenza di un fascio.
21. Verificare che sia presente un fascio cercando entrambi gli AF fluorescenti colocalizzati. Accendere la sorgente di luce bianca e utilizzare il cubo filtrante appropriato per visualizzare ciascun filamento di actina ruotando la torretta (cubi del filtro di eccitazione 488 nm e 532 nm per l'eccitazione Alexa Fluor 488 e rodamina, rispettivamente). Vedere la figura supplementare S4.
    NOTA: Un esperimento di controllo per verificare l'intensità di fluorescenza di singoli AF può essere utile per identificare fasci composti da un singolo filamento marcato con rodamina 488 e singolo, o applicabile a qualsiasi set di fluorofori che l'utente sceglie di utilizzare.
22. Una volta verificato, intrappolare il tallone attaccato al filamento superiore del fascio facendo clic sul pulsante Trap Shutter .
23. Utilizzare i controlli sullo schermo per registrare i dati facendo clic sul pulsante Oscilloscopio (Figura supplementare S7). Per visualizzare le misurazioni senza registrare i dati, fare clic su Start. Per salvare tutti i dati, fare clic su Salvataggio automatico. Per registrare le misurazioni, fare clic su Avvia registrazione. Scegli quali dati devono essere visualizzati in tempo reale (posizione, forza, direzione x, direzione y) scegliendo dal menu a discesa Segnale X o segnale Y. Ricorda che xdirection è da sinistra a destra e la direzione y è su e giù sullo schermo. Vedere la figura supplementare S7.
    NOTA: i dati verranno salvati come file .out e includono tempo, tensione, spostamento e forza per ogni direzione. Questi file possono essere esportati in altri software per la visualizzazione e l'analisi.

Risultati

Le celle a flusso contenenti i sistemi di fasci di actomiosina hanno un design standard, costituito da un vetrino da microscopio e da un coprivetrino inciso separati da un canale costituito da nastro adesivo biadesivo (Figura 1). Il test viene quindi costruito dal coverslip up utilizzando introduzioni graduali come descritto nel protocollo. Il test finale consiste in filamenti di actina marcati con rodamina; la concentrazione di miosina desiderata (1 μM è stato utilizzato per i risultati r...

Discussione

Uno studio in vitro utilizzando pinzette ottiche combinate con imaging a fluorescenza è stato eseguito per studiare la dinamica degli insiemi di miosina che interagiscono con i filamenti di actina. I fasci di actina-miosina-actina sono stati assemblati utilizzando miosina muscolare II, actina rodamina nella parte inferiore del fascio e sulla superficie del coprislip e filamenti di actina biotinilati marcati con 488 sulla parte superiore del fascio. La proteina actina del muscolo di coniglio è stata polimerizza...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actin protein (biotin): skeletal muscle	Cytoskeleton	AB07-A	Biotinylated actin protein
Actin protein, rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99-A	Actin protein
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain
ATP	Fisher scientific	BP413-25	Required for actin assembly and myosin motility
Beta-D-glucose	Fisher scientific	MP218069110	Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Blotting Grade Blocker (casein)	Biorad	1706404	Used to block surface from non-specific binding
CaCl2	Fisher scientific	C79500	Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network
Catalase	Fisher scientific	ICN10040280	Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Coverslips	Fisher scientific	12544C	Used to make flow cells
DTT	Fisher scientific	AC327190010	Used for buffer preparation
Ethanol	Fisher scientific	A4094	Regent used for cleaning coverslips
Glucose oxidase	Fisher scientific	34-538-610KU	Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
KCl	Fisher scientific	P217-500	Used for buffer preparation
KOH	Fisher scientific	P250-1	Used to etch coverslips and adjust buffer pH
MgCl2	Fisher scientific	M33-500	Used for buffer preparation
Microscope slides	Fisher scientific	12-544-2	Used to make flow cells
Myosin II protein: rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	MY02	Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle
Nanotracker2	Bruker/JPK	NT2	Optical trapping instrument
Poly-l-lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip
Rhodamine Phalloidin	Cytoskeleton	PHDR1	Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain
Streptavidin beads, 1 μm	Spherotech	SVP-10-5	Optical trapping handle
Tris-HCl	Fisher scientific	PR H5121	Used for buffer preparation