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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Bildung von Actomyosin-Bündeln in vitro und die Messung der Myosin-Ensemble-Krafterzeugung mittels optischer Pinzette wird vorgestellt und diskutiert.

Zusammenfassung

Myosine sind Motorproteine, die ATP hydrolysieren, um entlang der Spuren des Aktinfilaments (AF) zu treten, und sind essentiell für zelluläre Prozesse wie Motilität und Muskelkontraktion. Um ihre krafterzeugenden Mechanismen zu verstehen, wurde Myosin II sowohl auf Einzelmolekülebene (SM) als auch als Motorteams in vitro mit biophysikalischen Methoden wie optischem Trapping untersucht.

Diese Studien zeigten, dass sich das Verhalten der Myosinkrafterzeugung stark unterscheiden kann, wenn man von der Einzelmolekülebene in einer Drei-Perlen-Anordnung zu Gruppen von Motoren übergeht, die auf einer starren Perlen- oder Deckglasoberfläche in einer Gleitanordnung zusammenarbeiten. Diese Assay-Konstruktionen erlauben es jedoch nicht, die Gruppendynamik von Myosin innerhalb der viskoelastischen Strukturhierarchie zu bewerten, wie dies innerhalb einer Zelle der Fall wäre. Wir haben eine Methode mit optischen Pinzetten entwickelt, um die Mechanik der Krafterzeugung durch Myosin-Ensembles zu untersuchen, die mit mehreren Aktinfilamenten interagieren.

Diese Actomyosin-Bündel erleichtern die Untersuchung in einer hierarchischen und konformen Umgebung, die die motorische Kommunikation und die Ensemblekraftabgabe erfasst. Die anpassbare Natur des Assays ermöglicht es, experimentelle Bedingungen zu ändern, um zu verstehen, wie Modifikationen am Myosin-Ensemble, Aktinfilamentbündel oder der Umgebung zu unterschiedlichen Kraftausgängen führen.

Einleitung

Motorproteine sind lebenswichtig und wandeln chemische Energie in mechanische Arbeit um 1,2,3. Myosinmotoren interagieren mit Aktinfilamenten, indem sie Schritte entlang der Filamente ähnlich einer Spur machen, und die Dynamik von Aktin-Myosin-Netzwerken führt unter anderem Muskelkontraktion, Zellmotilität, den kontraktilen Ring während der Zytokinese und die Bewegung der Fracht innerhalb der Zelle durch 3,4,5,6,7,8 . Da Myosine so viele wesentliche Rollen spielen, kann ein Versagen der Funktionalität des Myosin-Aktin-Netzwerks zur Entwicklung von Krankheiten führen, wie z.B. Mutationen in der Myosin-Schwerkette, die eine Herzhyperkontraktilität bei hypertropher Kardiomyopathie (HCM) verursachen9,10,11,12,13,14 . Bei der Muskelkontraktion kooperieren einzelne Myosinmotoren, indem sie als Ensemble zusammenarbeiten, um die erforderliche mechanische Energie bereitzustellen, die das relative Gleiten der AFs 4,15,16,17,18 ausführt. Myosinmotoren bilden Querbrücken zwischen AFs und nutzen Konformationsänderungen aufgrund ihres mechanochemischen Zyklus, um sich kollektiv zum Stachelende der ausgerichteten Filamente 17,18,19,20,21 zu bewegen.

Die Entwicklung quantitativer In-vitro-Motilitätsassays auf SM-Ebene unter Verwendung von Techniken wie optischem Trapping hat es ermöglicht, beispiellose Details über die Funktionsweise einzelner Myosinmotoren zu sammeln, einschließlich der Messung der SM-Krafterzeugung und der Schrittgrößen 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. entwickelten den optischen Fallenassay "Drei-Perle" oder "Hantel", um die Krafterzeugungsmechanik einzelner Myosin-II-Motoren23,31 zu untersuchen. Da Muskelmyosin II in Teams arbeitet, um AFs zu kontrahieren, aber auf SM-Ebene nicht prozessiv ist, musste die Ausrichtung des optischen Fangassays vom klassischen motorgebundenen Perlenansatz32 neu angeordnet werden. Um den Hanteltest zu bilden, wurden zwei optische Fallen verwendet, um einen AF über einem Myosinmotor zu halten, der an eine an einem Deckglas befestigte Perle gebunden war, und die Kraftabgabe durch den einzelnen Motor wurde durch Bewegungen des AF innerhalb der Falle23 gemessen.

SM-Kräfte und die Verwendung einer Einzelmotor-/Einzelfilament-Assay-Orientierung geben jedoch kein vollständiges Bild über die Krafterzeugung auf Systemebene, da viele Motorproteine, einschließlich Myosin II, nicht isoliert arbeiten und oft nicht als Summe ihrer Teile funktionieren 15,16,17,32,33,34,35,36 . Komplexere Strukturen, die mehr als einen Motor umfassen, der mit mehr als einem Filament interagiert, sind notwendig, um die Synergie von Myosin- und Aktinfilament-Netzwerken besser zu verstehen15,32. Die Hantel-Assay-Orientierung wurde ausgenutzt, um die Erzeugung kleiner Ensemblekräfte zu untersuchen, indem mehrere Myosine an einer Perle befestigt sind oder ein Myosin-dickes Filament an einer Oberfläche befestigt ist und die Motoren mit dem hängenden AF 4,23,34,37,38,39,40 interagieren können.

Andere kleine Ensemble-Assays umfassen einen In-vitro-Filament-Gleitassay, bei dem Myosinmotoren auf eine Deckglasoberfläche beschichtet werden und eine an einen AF gebundene Perle verwendet wird, um die vom Motorteam erzeugte Kraft zu untersuchen 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . In beiden Fällen sind die Myosine an eine starre Oberfläche – Perle oder Deckglas – gebunden und verwenden einen AF. In diesen Fällen sind die Motoren nicht in der Lage, sich frei zu bewegen oder miteinander zu kommunizieren, noch spiegelt die starre Bindung von Myosinen die nachgiebige, hierarchische Umgebung wider, in der die Motoren im Sarkomerzusammenarbeiten würden 32. Frühere Studien haben gezeigt, dass Myosin II seine Umgebung wahrnehmen und sich entsprechend an sich ändernde viskoelastische oder motorische Konzentrationsbedingungen anpassen kann, indem Eigenschaften wie Krafterzeugung und Tastverhältnis41,44,45 verändert werden. Daher besteht die Notwendigkeit, einen optischen Trapping-Assay zu entwickeln, der die motorische Kommunikation und Systemkonformität fördert und erfasst, um ein realistischeres Bild der mechanistischen Grundlagen der Myosin-II-Ensemblekrafterzeugung zu zeichnen.

Hier haben wir eine Methode entwickelt, um hierarchische Strukturen in vitro mit optischem Trapping zu koppeln, indem wir Actomyosin-Bündel oder Sandwiches bilden, die aus mehreren Myosinmotoren bestehen, die zwischen zwei Aktinfilamenten interagieren. Diese modulare Assay-Geometrie hat die Fähigkeit, direkt zu untersuchen, wie molekulare und Umweltfaktoren die Ensemble-Myosin-Krafterzeugung beeinflussen. Darüber hinaus hat die Untersuchung von Krafterzeugungsmechanismen durch diese Aktin-Myosin-Ensembles das Potenzial, bei der Modellierung und dem Verständnis zu helfen, wie sich großräumige zelluläre Aufgaben, wie die Muskelkontraktion, von der molekularen Ebene aus ausbreiten 9,10,13.

Protokoll

1. Deckgläser ätzen

  1. 100 g KOH werden in 300 mL 100% Ethanol in einem 1.000 ml Becherglas gelöst. Mit einem Rührbalken umrühren, bis sich der Großteil der KOH aufgelöst hat.
    ACHTUNG: Konzentrierte KOH-Lösung kann Verbrennungen und Schäden an der Kleidung verursachen. Tragen Sie Handschuhe, Augenschutz und einen Laborkittel.
  2. Deckgläser einzeln in Deckglas-Reinigungsgestelle legen.
    HINWEIS: Die Racks sind mit Schlitzen ausgestattet, die einzelne Deckgläser im Abstand halten, um das Ätzen und Spülen auf jeder Seite des Deckglases zu ermöglichen, Abflusslöcher im Boden und aus Material, das den rauen Ätzbedingungen standhält. Sie können maßgefertigt oder im Handel erworben werden.
  3. Bereiten Sie drei 1.000-ml-Becher vor und kennzeichnen Sie sie: eines mit 300 ml Ethanol und zwei Becher mit 300 ml Umkehrosmosewasser (RO).
    HINWEIS: Hier wurde RO-Wasser aus einem Laborwasserreiniger bezogen, könnte aber auch kommerziell erworben werden, wenn kein lokaler Luftreiniger verfügbar ist.
  4. Legen Sie jedes der vier Becher in einen Badebeschaller, um 5 Minuten lang zu entgasen.
  5. Tauchen Sie ein Gestell mit Deckgläsern in das Becherglas mit KOH und Ethanol und beschallen Sie es für 5 min.
  6. Übertragen Sie das Deckglasgestell aus dem KOH/Ethanol-Becherglas in das reine Ethanolbecherglas. Tauchen Sie das Gestell im Becherglas auf und ab, bis keine Sicken mehr vorhanden sind.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Deckgläser nicht zu stören oder das Gestell gewaltsam in das Becherglas fallen zu lassen. Dies führt dazu, dass die Deckgläser aus dem Gestell kommen oder chemische Spritzer verursachen.
  7. Übertragen Sie vorsichtig das Gestell mit Deckgläsern aus dem Ethanolbecher in ein Becherglas mit Wasser und tauchen Sie auf und ab, bis keine Abperlen mehr vorhanden sind.
  8. Tauchen Sie das Gestell mit Deckgläsern in das Becherglas mit noch nicht verwendetem Wasser und beschallen Sie es erneut für 5 Minuten.
  9. Verwenden Sie eine Flasche, um das Gestell mit Deckgläsern mit Wasser zu besprühen, bis es glatt von den Deckgläsern abläuft. Wiederholen Sie dies mit dem Ethanol.
  10. Stellen Sie die Racks 20 min in einem Ofen bei 90 °C trocknen. Lagern Sie die Regale mit geätzten Deckgläsern bei Raumtemperatur in geschlossenen Behältern, um eine Kontamination vor dem Gebrauch zu vermeiden.

2. Aktinfilamentpolymerisation

  1. Lösung T erstellen
    1. In einem 50 ml konischen Röhrchen 3,94 g Tris-HCl und 0,147 g CaCl2 zugeben. Fügen Sie RO-Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 50 ml zu erhalten, und mischen Sie gut.
      HINWEIS: Die Endkonzentrationen von Lösung T betragen 500 mM Tris-HCl bzw. 20 mM CaCl2 .
    2. Beschriften Sie das Röhrchen Solution T und lagern Sie es bei 4 °C.
  2. TC Buffer erstellen
    1. Mischen Sie 40 mL RO-Wasser und 1,5 ml Lösung T in einem 50-ml-konischen Röhrchen. Ändern Sie den pH-Wert auf 8,0, indem Sie kleine Mengen konzentrierten KOH hinzufügen. Fügen Sie Wasser hinzu, um 50 ml der Lösung herzustellen, und überprüfen Sie den pH-Wert. Stellen Sie bei Bedarf den pH-Wert ein.
      HINWEIS: Der endgültige TC-Puffer enthält 5 mM Tris-HCl und 0,2 mMCaCl2 bei pH 8.
    2. Beschriften Sie das Röhrchen TC und lagern Sie es bei 4 °C.
  3. FC-Puffer erstellen
    1. 85 ml RO-Wasser, 10 ml Lösung T, 3,73 g KCl und 0,041 g MgCl2 in eine 100-ml-Pufferflasche geben. Modifizieren Sie den pH-Wert auf 7,5, indem Sie kleine Mengen konzentrierten KOH hinzufügen. Fügen Sie Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 100 ml zu erhalten, und überprüfen Sie den pH-Wert.
      HINWEIS: Der endgültige FC-Puffer enthält 500 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 2 mM MgCl 2 und 2 mM CaCl2 bei pH 7,5.
    2. Beschriften Sie die Tube FC und lagern Sie sie bei 4 °C.
  4. Bereiten Sie General Actin Buffer (GAB) vor.
    1. Mischen Sie 485 μL TC-Puffer, 10 μL 10 mM ATP und 5 μL 50 mM DTT in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Die endgültigen Pufferbedingungen sind 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl 2, 0,5 mM DTT und0,2 mM ATP.
    2. Beschriften Sie es als GAB und lagern Sie es bei 4 °C.
  5. Aktinpolymerisationspuffer (APB) vorbereiten.
    1. Mischen Sie 455 μL FC-Puffer, 25 μL 100 mM ATP und 20 μL 50 mM DTT in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Die endgültigen Pufferbedingungen sind 50 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 22 mM DTT und 5 mM ATP.
    2. Beschriften Sie das Röhrchen als APB und lagern Sie es bei 4 °C.
  6. Aktin rekonstituieren
    1. Rekonstituieren Sie Kaninchen-Skelettmuskel-Aktin durch Zugabe von 100 μL deionisiertem Wasser zu einer 1-mg-Durchstechflasche mit lyophilisiertem Aktin. Gut mischen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Aliquot in 5 μL Proben, einfrieren und die 10 mg/ml Aktin-Aliquots bei -80 °C lagern.
    2. Rekonstituieren Sie biotinyliertes Kaninchen-Skelettmuskel-Aktin durch Zugabe von 20 μL RO-Wasser. Aliquot in 5 μL Proben, snap-freeze und Lagerung der 1 mg/ml biotinylierten Aktin-Aliquots bei -80 °C.
  7. Unmarkierte Aktinpolymerisation mit Rhodaminphalloidin-Stabilisierung
    1. Eine Durchstechflasche mit 10 mg/ml Aktin auftauen und auf Eis halten.
    2. Bereiten Sie frischen GAB-Puffer vor, geben Sie 100 μL GAB zum Aktin-Aliquot und mischen Sie durch vorsichtiges Pipettieren auf und ab. Die Lösung 1 h auf Eis inkubieren.
    3. Bereiten Sie frisches APB während der Inkubation zu. Nach der Inkubation polymerisieren Sie das Aktin zu Filamenten, indem Sie der Aktinlösung 11 μL APB hinzufügen. Gut mischen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. 20 min auf Eis legen.
    4. Geben Sie 5 μL rhodaminmarkiertes Phalloidin in die frisch polymerisierte Aktinfilamentlösung. 1 h im Dunkeln auf Eis lassen.
    5. Lagern Sie die in Aluminiumfolie eingewickelte Durchstechflasche mit Rhodaminaktin im Dunkeln bei 4 °C.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, diese Filamente für einen Zeitraum von maximal 1 Woche zu verwenden. Die AF-Qualität kann jeden Tag durch eine schnelle Bildgebung einer Flusszelle, die nur AFs enthält, und die tägliche Betrachtung konsistenter Filamente bestätigt werden.
  8. Biotinylierte Aktinpolymerisation mit Alexa Fluor 488 Phalloidin-Stabilisierung
    1. Eine Durchstechflasche mit 10 mg/ml Aktin und 1 Durchstechflasche mit 1 mg/ml biotinyliertem Aktin auftauen und auf Eis halten.
    2. Erstellen Sie einen frischen GAB-Puffer.
    3. Kombinieren Sie die beiden Durchstechflaschen (Schritt 2.8.1) in einem Aktin:Biotinyl-Aktin-Verhältnis von 10:1. Geben Sie 100 μL GAB zu der Aktinmischung und mischen Sie gut, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Auf Eis 1 h inkubieren.
    4. Machen Sie frisches APB während der Inkubation.
    5. Nach dem Inkubationsschritt polymerisieren Sie das Aktin durch Zugabe von 11 μL APB zur Aktinlösung. Gut mischen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Auf Eis 20 min inkubieren.
    6. Fügen Sie 5 μL Alexa Fluor 488-markiertes Phalloidin hinzu und inkubieren Sie 1 h auf Eis im Dunkeln.
    7. Bewahren Sie die in Aluminiumfolie eingewickelte Biotin-Durchstechflasche im Dunkeln bei 4 °C auf.
      HINWEIS: Diese Filamente können für einen Zeitraum von maximal 1 Woche verwendet werden.

3. Myosin und Perlenzubereitung

  1. Rekonstituieren Sie Myosin II
    1. Drehen Sie kurz (~ 5 s) lyophilisiertes Skelettmyosin II herunter, um es am Boden der Röhre mit einer Standard-Minizentrifuge zu sammeln.
    2. Rekonstituieren Sie das Myosin zu 10 mg/ml durch Zugabe von 100 μL 1 mM DTT, hergestellt in RO-Wasser.
    3. Die Stamm-Myosinlösung wird 10x verdünnt, indem man 10 μL 10 mg/ml Myosin zu 90 μL 1 mM DTT in RO-Wasser hinzufügt. Aliquots mit kleinem Volumen (1-5 μL) herstellen, einfrieren und bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Die Myosinaktivität kann durch Durchführung eines Standard-Gleitfilament-Assays bestätigt werden, wie zuvorveröffentlicht 46,47. Eine kurze Beschreibung finden Sie in der Diskussion.
  2. Reinigung von Streptavidin-beschichteten Perlen
    1. 20 μL 1 μm Streptavidinperlen in 80 μL RO-Wasser verdünnen. Viermal waschen, indem man es bei 9.600 × g herunterdreht und in 100 μL RO-Wasser rekonstituiert.
    2. Für 2 min bei 40% Amplitude beschallen und die gewaschenen Perlen auf einem Rotator bei 4 °C lagern.

4. Vorbereitung der Durchflusszelle

  1. Bereiten Sie eine Poly-L-Lysin-Lösung (PLL) vor, indem Sie 30 ml 100% Ethanol zu einem 50-ml-Röhrchen geben und 200 μL 0,1% w/v Poly-L-Lysin in Wasser hinzufügen und gut mischen.
  2. Ein geätztes Deckglas in die PLL-Lösung geben und 15 min einweichen lassen. Entfernen Sie das Deckglas mit einer Pinzette, und achten Sie darauf, nur den Rand des Deckglases zu berühren, wenn es aus dem Schlauch gezogen wird (siehe Abbildung 1A-C). Greifen Sie die Deckgläser mit einer behandschuhten Hand an den Kanten.
  3. Trocknen Sie das Deckglas mit einer gefilterten Fluggesellschaft, bis kein Ethanol mehr vorhanden ist und keine Rückstände mehr auf dem Deckglas vorhanden sind.
  4. Tragen Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband auf die Mitte eines Objektträgers auf, die 3-4 mm voneinander entfernt sind. Reißen oder schneiden Sie das überschüssige Klebeband ab, das am Rand der Folie hängt.
  5. Fügen Sie das PLL-beschichtete Deckglas auf dem Band senkrecht zur Längsachse des Objektträgers hinzu (ein T bildend), um einen Kanal zu bilden.
  6. Verwenden Sie einen kleinen Tubus, um das Deckglas gründlich auf das Band und den Objektträger zu komprimieren, bis das Band transparent ist (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im Band befinden, da dies zu Leckagen aus dem Durchflusskanal führen kann.
    HINWEIS: Die Durchflusszelle kann ein Volumen von 10-15 μL aufnehmen.

5. Actomyosin-Bündel-Vorbereitung

  1. In separaten Röhrchen wird jede Art von Aktinfilament (rhodamin- und biotinyliert 488-markiert) 600x verdünnt, indem 0,5 μL des jeweiligen, markierten Aktins mit 300 μL APB gemischt werden. Zusätzlich 5 μL des entsprechend markierten Phalloidins in jedes Röhrchen geben und 15 min auf Eis im Dunkeln inkubieren.
  2. Zu der biotinylierten Aktinlösung wird ein Sauerstofffängersystem aus 1 μL Beta-D-Glucose bei 500 mg/ml, 1 μL Glucoseoxidase bei 25 mg/ml und 1 μL Katalase bei 500 Einheiten/ml hinzugefügt. Fügen Sie 1 μL 100 mM ATP und 1 μL 100x verdünnte, gereinigte Streptavidin-Perlen hinzu. Vorsichtig mit einer Pipettenspitze umrühren. Setzen Sie die Suspension auf einen Rotator bei 4 °C, während der Rest des Actomyosin-Bündels zusammengebaut wird.
  3. Geben Sie 15 μL des verdünnten Rhodamin-Aktins in die PLL-Durchflusszelle (Abbildung 1D). Leiten Sie die überschüssige Lösung durch die Durchflusszelle, aber lassen Sie den Strömungskanal nicht trocken werden. 10 min in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.
    HINWEIS: Feuchtigkeitskammern können aus leeren Pipettenspitzenkästen hergestellt werden, in denen Wasser auf den Boden gegeben wird und der Deckel mit Aluminiumfolie bedeckt ist, um Licht zu blockieren.
  4. Bereiten Sie eine 1 mg/ml Caseinlösung in APB vor.
  5. Fügen Sie 15 μL 1 mg/ml Casein hinzu, um eine unspezifische Bindung der nachfolgenden Komponenten zu verhindern (Abbildung 1E). 5 min in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.
  6. Geben Sie die gewünschte Konzentration von Myosin zu der biotinylierten Aktin- und Perlensuspension aus Schritt 5.2. Rühren Sie vorsichtig mit der Pipettenspitze um und geben Sie dann sofort 15 μL der Stufe 5.2 Suspension + die gewünschte Myosinkonzentration in die Flusszelle (Abbildung 1F, G). Inkubieren für 20 min. Versiegeln Sie die offenen Enden der Durchflusszelle mit Nagellack, um Verdunstung während bildgebender und optischer Fangexperimente zu verhindern.
    HINWEIS: Eine Myosinlösungskonzentration von 1 μM ergibt eine robuste Bündelung und kann als Ausgangspunkt für die gewünschte Anpassung des Assays verwendet werden (siehe Abbildung 2).

6. Kraftmessungen mit optischer Falle (NT2 Nanotracker2)

HINWEIS: Während das folgende Protokoll speziell für das NT2-System gilt, kann dieser Assay mit anderen optischen Fangsystemen verwendet werden, einschließlich solcher, die speziell angefertigt sind und ebenfalls über Fluoreszenzfähigkeiten verfügen. Der allgemeine Arbeitsablauf bleibt derselbe, die Oberfläche des Objektträgers scharf zu stellen, Perlenkalibrierungen durchzuführen und Daten zu erfassen, indem fluoreszierende Aktinbündel gefunden werden. Für das NT2-System enthalten die ergänzende Abbildung S1, die ergänzende Abbildung S2, die ergänzende Abbildung S3, die ergänzende Abbildung S4, die ergänzende Abbildung S5, die ergänzende Abbildung S6 und die ergänzende Abbildung S7 Einzelheiten zum optischen Fangsystem und zur Softwareschnittstelle.

  1. Schalten Sie die Steuerbox und den Laser ein (Zusatzfigur S1).
  2. Starten Sie die optische Falle-Computersoftware, indem Sie auf das JPK Nanotracker-Symbol auf dem Desktop klicken.
  3. Wecken Sie die Fernbedienung auf, indem Sie auf die Logitech-Taste in der Mitte klicken (Zusatzabbildung S2).
  4. Schalten Sie das Fluoreszenzmodul ein, indem Sie den Ein-/Ausschalter umschalten (Ergänzende Abbildung S3).
  5. Drehen Sie den Filterwürfelturm für die Hellfeld-Bildgebung (ergänzende Abbildung S4).
  6. Sobald das System fertig ist, schalten Sie den Laser mit der Laser-Power-Taste in der linken unteren Ecke des Bildschirms auf 50 mW ein und lassen Sie ihn 30 Minuten lang stabilisieren (ergänzende Abbildung S5).
  7. Klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen Beleuchtung, Kamera, Objektiv und Bühnenbewegung in der Software, um diese Fenster zur Anzeige und Manipulation während des Experiments aufzurufen. Schalten Sie die Mikroskopbeleuchtung ein, indem Sie auf die Schaltfläche On/Off klicken und sie auf maximale Leistung einstellen, indem Sie klicken und den Balken ganz nach rechts ziehen (Ergänzende Abbildung S5).
  8. Öffnen Sie den Probenbereich und nehmen Sie den Probenhalter vom Mikroskoptisch. Fügen Sie die Durchflusszelle hinzu, sichern Sie sie mit den Metallprobenhaltern und stellen Sie sicher, dass sich der Objektträger mit dem Deckglas auf der Unterseite befindet.
  9. Fügen Sie 30 μL RO-Wasser in die Mitte des unteren Objektivs hinzu. Lassen Sie die Pipettenspitze die Linse nicht berühren. Setzen Sie den Probentisch wieder ein.
    HINWEIS: Da das NT2-System ein Wasserimmersionsobjektiv als Fangobjektiv verwendet, können die Tauchmedien je nach Fangobjektiv in der Konfiguration des Benutzers unterschiedlich sein.
  10. Heben Sie das untere Objektiv mit den Kontrollpfeilen auf dem Bildschirm oder L2 auf der Fernbedienung an, bis die Wasserperle das Deckglas berührt (ergänzende Abbildung S5).
  11. Senken Sie das obere Objektiv mit den Bildschirmpfeilen oder R2 auf der Fernbedienung ab, bis etwa die Hälfte der Entfernung zur Durchflusszelle erreicht ist. Geben Sie 170 μL RO-Wasser in die Oberseite der Durchflusszelle direkt unter dem oberen Objektiv. Senken Sie das obere Objektiv, bis es die Oberflächenspannung des Wassers bricht und einen Meniskus bildet.
  12. Bewegen Sie den Mikroskoptisch mit dem Pfeilpad auf der Fernbedienung, bis der Rand des Bandes neben dem Strömungskanal erreicht ist. Schließen Sie die Probenklappe.
    HINWEIS: Ein "Klick" beim Schließen der Probenklappe zeigt an, dass der Laserverschluss nun geöffnet ist. Dies ist eine Sicherheitsfunktion, die das Öffnen des Rollladens nur bei geschlossener Tür zulässt.
  13. Bringen Sie im Objektivfenster auf dem Bildschirm den Rand des Bandes scharf, indem Sie das untere Objektiv mit dem Namen Laserobjektiv nach oben bringen, indem Sie mithilfe der Bildschirmsteuerelemente auf den oberen Pfeil klicken. Machen Sie dasselbe für das oberste Ziel, indem Sie auf den unteren Pfeil klicken (ergänzende Abbildung S5).
    HINWEIS: Die Doppelpfeile verschieben das Ziel oder die Stufe schneller. Der Rand des Bandes wird zum Fokussieren verwendet, da es sich um ein großes, leicht zu findendes Objekt handelt, das sich in der Nähe der Deckglasoberfläche befindet. Luftblasen innerhalb des Bandes sind eine weitere Option. Dies ist jedoch nicht erforderlich, wenn der Benutzer über eine automatisierte Routine zur Ermittlung des Oberflächenfokus oder eine bevorzugte interne Methode verfügt.
  14. Sobald das Band scharf ist, schließen Sie die Iris an der Oberseite der optischen Falle teilweise. Bringen Sie das obere Objektiv nach unten, bis die Polygonform der Iris sichtbar ist. Bringen Sie diese Kanten in den Fokus, öffnen Sie die Blende wieder und koppeln Sie dann die Ziele mit, indem Sie auf das Vorhängeschloss-Symbol klicken (Ergänzende Abbildung S5).
  15. Finden Sie eine schwimmende Perle und fangen Sie sie ein, indem Sie auf den Trap Shutter Button klicken, der den Verschluss öffnet und es dem Trapping-Laser ermöglicht, die Probe zu treffen. Klicken Sie auf den Trap-Cursor auf dem Bildschirm und ziehen Sie ihn, um die Position des Trapping-Lasers zu verschieben. Nach dem Einfangen kalibrieren Sie die Perle, um Spannungsmessungen mit Kraft und Verschiebung zu korrelieren.
  16. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kalibrierung . Passen Sie die Kalibrierungsroutine basierend auf der Leistungsspektrenanalyse an und passen Sie die Eckfrequenz innerhalb der Software für die X-, Y- und Z-Richtung an (ergänzende Abbildung S6).
  17. Klicken Sie auf Einstellungen. Geben Sie den Durchmesser der Perle (1.000 nm) und die Temperatur der Stufe unten links im Softwarefenster ein. (siehe ergänzende Abbildung S6).
  18. Klicken Sie auf Trap 1. Klicken Sie auf X-Signal. Klicken Sie auf Ausführen , um die Eckfrequenzanpassung durchzuführen. Klicken und ziehen Sie innerhalb des Fensters, um die Funktionsanpassung zu optimieren. Klicken Sie auf Verwenden Sie es für Empfindlichkeits- und Steifigkeitswerte. Klicken Sie auf Werte akzeptieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Y- und Z-Signale. Schließen Sie das Fenster. (siehe ergänzende Abbildung S6).
    HINWEIS: Perlenkalibrierungsroutinen auf anderen optischen Fangsystemen oder kundenspezifischen Systemen, die vom Benutzer robust getestet wurden, wie z. B. die Gleichverteilungsmethode oder die Widerstandskraftmethode, sind ebenfalls akzeptabel57,58.
  19. Finden Sie ein Actomyosin-Bündel, indem Sie nach Perlen suchen, die an AFs auf der Oberfläche des Deckglases gebunden sind.
  20. Wenn eine Perle erkannt wird, die nicht von anderen schwimmenden Perlen überfüllt ist, beobachten Sie die AFs um sie herum durch Fluoreszenzbildgebung, um das Vorhandensein eines Bündels zu überprüfen.
  21. Stellen Sie sicher, dass ein Bündel vorhanden ist, indem Sie nach beiden fluoreszierenden AFs suchen, die kolokalisiert sind. Schalten Sie die Weißlichtquelle ein und verwenden Sie den entsprechenden Filterwürfel, um jedes Aktinfilament abzubilden, indem Sie den Turm drehen (488 nm bzw. 532 nm Anregungsfilterwürfel für Alexa Fluor 488 bzw. Rhodaminanregung). Siehe ergänzende Abbildung S4.
    HINWEIS: Ein Kontrollexperiment zur Überprüfung der Fluoreszenzintensität einzelner AFs kann nützlich sein, um Bündel zu identifizieren, die aus einem einzigen 488- und einem einzelnen Rhodamin-markierten Filament bestehen, oder anwendbar auf den Satz von Fluorophoren, den der Benutzer verwendet.
  22. Sobald Sie dies überprüft haben, fangen Sie die Perle ein, die am oberen Filament des Bündels befestigt ist, indem Sie auf den Trap Shutter-Button klicken.
  23. Verwenden Sie die Bildschirmsteuerung, um die Daten aufzuzeichnen, indem Sie auf die Oszilloskop-Schaltfläche klicken (ergänzende Abbildung S7). Um Messungen zu visualisieren, ohne die Daten aufzuzeichnen, klicken Sie auf Start. Um alle Daten zu speichern, klicken Sie auf Automatisch speichern. Um Messungen aufzuzeichnen, klicken Sie auf Aufzeichnung starten. Wählen Sie, welche Daten in Echtzeit visualisiert werden sollen (Position, Kraft, x-Richtung, y-Richtung), indem Sie aus dem Dropdown-Menü X-Signal oder Y-Signal auswählen. Denken Sie daran, dass xdirection von links nach rechts und y-Richtung auf dem Bildschirm oben und unten ist. Siehe ergänzende Abbildung S7.
    HINWEIS: Die Daten werden als .out-Dateien gespeichert und enthalten Zeit, Spannung, Verschiebung und Kraft für jede Richtung. Diese Dateien können zur Visualisierung und Analyse in andere Software exportiert werden.

Ergebnisse

Die Durchflusszellen, die die Actomyosin-Bündelsysteme enthalten, haben ein Standarddesign, bestehend aus einem Objektträger und einem geätzten Deckglas, das durch einen Kanal aus doppelseitigem Klebeband getrennt ist (Abbildung 1). Der Assay wird dann vom Deckglas bis zur Verwendung von abgestuften Einführungen, wie im Protokoll beschrieben, erstellt. Der endgültige Assay besteht aus Rhodamin-markierten Aktinfilamenten; die gewünschte Myosinkonzentration (1 μM wurde für die repräse...

Diskussion

Eine In-vitro-Studie mit optischen Pinzetten in Kombination mit Fluoreszenzbildgebung wurde durchgeführt, um die Dynamik von Myosin-Ensembles zu untersuchen, die mit Aktinfilamenten interagieren. Aktin-Myosin-Aktin-Bündel wurden unter Verwendung von Muskelmyosin II, Rhodamin-Aktin an der Unterseite des Bündels und auf der Deckglasoberfläche und 488-markierten, biotinylierten Aktinfilamenten auf der Oberseite des Bündels zusammengesetzt. Aktinprotein aus Kaninchenmuskeln wurde unter Verwendung von allgemeine...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wird teilweise vom University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), dem University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), dem Mississippi Space Grant Consortium unter der Fördernummer NNX15AH78H (JCW, DNR) und der American Heart Association unter der Fördernummer 848586 (DNR) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Actin protein (biotin): skeletal muscleCytoskeletonAB07-ABiotinylated actin protein
Actin protein, rabbit skeletal muscleCytoskeletonAKL99-AActin protein
Alexa Fluor 488 PhalloidinInvitrogenA12379Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain
ATPFisher scientificBP413-25Required for actin assembly and myosin motility
Beta-D-glucoseFisher scientificMP218069110Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Blotting Grade Blocker (casein)Biorad1706404Used to block surface from non-specific binding
CaCl2Fisher scientificC79500Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network
CatalaseFisher scientificICN10040280Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
CoverslipsFisher scientific12544CUsed to make flow cells
DTTFisher scientificAC327190010Used for buffer preparation
EthanolFisher scientificA4094Regent used for cleaning coverslips
Glucose oxidaseFisher scientific34-538-610KUPart of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
KClFisher scientificP217-500Used for buffer preparation
KOHFisher scientificP250-1Used to etch coverslips and adjust buffer pH
MgCl2Fisher scientificM33-500Used for buffer preparation
Microscope slidesFisher scientific12-544-2Used to make flow cells
Myosin II protein: rabbit skeletal muscleCytoskeletonMY02Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle
Nanotracker2Bruker/JPKNT2Optical trapping instrument
Poly-l-lysineSigma-AldrichP8920Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip
Rhodamine PhalloidinCytoskeletonPHDR1Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain
Streptavidin beads, 1 μmSpherotechSVP-10-5Optical trapping handle
Tris-HClFisher scientificPR H5121Used for buffer preparation

Referenzen

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