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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se presenta y discute la formación de haces de actomiosina in vitro y la medición de la generación de fuerza del conjunto de miosina utilizando pinzas ópticas.

Resumen

Las miosinas son proteínas motoras que hidrolizan ATP para avanzar a lo largo de las pistas de filamentos de actina (FA) y son esenciales en procesos celulares como la motilidad y la contracción muscular. Para comprender sus mecanismos de generación de fuerza, la miosina II se ha investigado tanto a nivel de molécula única (SM) como como equipos de motores in vitro utilizando métodos biofísicos como el atrapamiento óptico.

Estos estudios mostraron que el comportamiento generador de fuerza de miosina puede diferir mucho cuando se mueve desde el nivel de una sola molécula en una disposición de tres perlas a grupos de motores que trabajan juntos en una superficie rígida de talón o cubreobjetos en una disposición de deslizamiento. Sin embargo, estas construcciones de ensayo no permiten evaluar la dinámica de grupo de la miosina dentro de la jerarquía estructural viscoelástica como lo harían dentro de una célula. Hemos desarrollado un método que utiliza pinzas ópticas para investigar la mecánica de la generación de fuerza por conjuntos de miosina que interactúan con múltiples filamentos de actina.

Estos paquetes de actomiosina facilitan la investigación en un entorno jerárquico y compatible que captura la comunicación motora y la salida de fuerza del conjunto. La naturaleza personalizable del ensayo permite alterar las condiciones experimentales para comprender cómo las modificaciones al conjunto de miosina, el haz de filamentos de actina o el entorno circundante dan como resultado diferentes salidas de fuerza.

Introducción

Las proteínas motoras son esenciales para la vida, convirtiendo la energía química en trabajo mecánico 1,2,3. Los motores de miosina interactúan con los filamentos de actina dando pasos a lo largo de los filamentos similares a una pista, y la dinámica de las redes actina-miosina lleva a cabo la contracción muscular, la motilidad celular, el anillo contráctil durante la citocinesis y el movimiento de la carga dentro de la célula, entre otras tareas esenciales 3,4,5,6,7,8 . Dado que las miosinas tienen tantas funciones esenciales, la falla en la funcionalidad de la red miosina-actina puede conducir al desarrollo de enfermedades, como mutaciones en la cadena pesada de miosina que causan hipercontractilidad cardíaca en la miocardiopatía hipertrófica (MCH)9,10,11,12,13,14 . En la contracción muscular, los motores individuales de miosina cooperan entre sí trabajando como un conjunto para proporcionar la energía mecánica requerida que lleva a cabo el deslizamiento relativo de las FA 4,15,16,17,18. Los motores de miosina forman puentes cruzados entre los AF y utilizan cambios conformacionales debido a su ciclo mecanoquímico para moverse colectivamente hacia el extremo de púas de los filamentos alineados 17,18,19,20,21.

El desarrollo de ensayos cuantitativos de motilidad in vitro a nivel de SM utilizando técnicas como la captura óptica ha facilitado la recopilación de detalles sin precedentes sobre cómo funcionan los motores de miosina individuales, incluida la medición de la generación de fuerza SM y los tamaños de paso 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. desarrollaron el ensayo de atrapamiento óptico de "tres perlas" o "mancuernas" para sondear la mecánica de generación de fuerza de motores de miosina II23,31. Como la miosina muscular II trabaja en equipos para contraer AF pero no es procesiva a nivel SM, la orientación del ensayo de captura óptica tuvo que reorganizarse a partir del enfoque clásico de perlas ligadas al motor32. Para formar el ensayo de mancuernas, se utilizaron dos trampas ópticas para sostener un AF sobre un motor de miosina unido a un cordón adherido a un cubreobjetos, y la salida de fuerza del motor único se midió a través de los movimientos del AF dentro de la trampa23.

Sin embargo, las fuerzas SM y el uso de una orientación de ensayo de un solo motor / filamento único no dan una imagen completa sobre la generación de fuerza a nivel de sistema, ya que muchas proteínas motoras, incluida la miosina II, no funcionan de forma aislada y, a menudo, no funcionan como una suma de sus partes 15,16,17,32,33,34,35,36 . Son necesarias estructuras más complejas que incluyan más de un motor interactuando con más de un filamento para comprender mejor la sinergia de las redes de filamentos de miosina y actina15,32. La orientación del ensayo con mancuernas se ha explotado para investigar la generación de fuerza de conjuntos pequeños al tener múltiples miosinas unidas a un cordón o usar un filamento grueso de miosina unido a una superficie y permitir que los motores interactúen con el AF suspendido 4,23,34,37,38,39,40.

Otros ensayos de conjunto pequeño incluyen un ensayo de deslizamiento de filamentos in vitro en el que los motores de miosina están recubiertos sobre una superficie de cubreobjetos, y se utiliza un cordón unido a un AF para sondear la fuerza generada por el equipo de motores 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . En ambos casos, las miosinas están unidas a una superficie rígida (perla o cubreobjetos) y utilizan un AF. En estos casos, los motores no son capaces de moverse libremente o comunicarse entre sí, ni tener miosinas rígidamente unidas refleja el ambiente jerárquico y compatible en el que los motores trabajarían juntos en el sarcómero32. Estudios previos han sugerido que la miosina II puede detectar su entorno y adaptarse en consecuencia a las cambiantes condiciones de concentración viscoelástica o motora alterando características como la generación de fuerza y la relación de trabajo41,44,45. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un ensayo de captura óptica que fomente y capture la comunicación motora y el cumplimiento del sistema para pintar una imagen más realista de los fundamentos mecanicistas de la generación de fuerza del conjunto de miosina II.

Aquí, desarrollamos un método para acoplar la estructura jerárquica in vitro con la captura óptica formando haces de actomiosina o sándwiches que consisten en múltiples motores de miosina que interactúan entre dos filamentos de actina. Esta geometría de ensayo modular tiene la capacidad de sondear directamente cómo los factores moleculares y ambientales influyen en la generación de fuerza de miosina en conjunto. Además, la investigación de los mecanismos de generación de fuerza a través de estos conjuntos de actina-miosina tiene el potencial de ayudar a modelar y comprender cómo las tareas celulares a gran escala, como la contracción muscular, se propagan desde el nivel molecular 9,10,13.

Protocolo

1. Cubreobjetos de grabado

  1. Disolver 100 g de KOH en 300 ml de etanol al 100% en un vaso de precipitados de 1.000 ml. Revuelva con una barra de agitación hasta que la mayoría del KOH se haya disuelto.
    PRECAUCIÓN: La solución concentrada de KOH puede causar quemaduras y daños a la ropa. Use guantes, protección para los ojos y una bata de laboratorio.
  2. Coloque los cubreobjetos individualmente en los bastidores de limpieza de cubreobjetos.
    NOTA: Los bastidores están diseñados con ranuras que sostienen cubreobjetos individuales separados para permitir el grabado y el enjuague en cada cara del cubreobjetos, orificios de drenaje en la parte inferior y están hechos de material que puede soportar las duras condiciones de grabado. Pueden ser hechos a medida o comprados comercialmente.
  3. Prepare y etiquete tres vasos de precipitados de 1,000 ml: uno con 300 ml de etanol y dos vasos con 300 ml de agua de ósmosis inversa (RO).
    NOTA: Aquí, el agua RO se obtuvo de un purificador de agua de laboratorio, pero también se puede comprar comercialmente si no hay un purificador local disponible.
  4. Coloque cada uno de los cuatro vasos de precipitados en un sonicador de baño para desgasificar durante 5 minutos.
  5. Sumerge un estante de cubreobjetos en el vaso de precipitados de KOH y etanol y sonicate durante 5 min.
  6. Transfiera el estante de cubreobjetos del vaso de precipitados KOH/etanol al vaso de precipitados de etanol solo. Sumerja el bastidor hacia arriba y hacia abajo en el vaso de precipitados hasta que no haya cuentas.
    NOTA: Tenga cuidado de no perturbar los cubreobjetos o dejar caer con fuerza la rejilla en el vaso de precipitados. Esto hará que los cubreobjetos salgan del estante o causen salpicaduras químicas.
  7. Transfiera con cuidado el estante de cubreobjetos del vaso de precipitados de etanol a un vaso de precipitados de agua, sumergiéndolo hacia arriba y hacia abajo hasta que no haya cuentas.
  8. Sumerge el estante de cubreobjetos en el vaso de precipitados de agua que aún no se ha utilizado y sonica de nuevo durante 5 min.
  9. Use una botella para rociar el estante de cubreobjetos con agua hasta que se escurra suavemente fuera de los cubreobjetos. Repita con el etanol.
  10. Colocar las rejillas a secar en un horno a 90 °C durante 20 min. Almacene los bastidores de cubreobjetos grabados a temperatura ambiente en recipientes cerrados para evitar la contaminación antes de su uso.

2. Polimerización de filamentos de actina

  1. Hacer solución T
    1. En un tubo cónico de 50 ml, añadir 3,94 g de Tris-HCl y 0,147 g de CaCl2. Agregue agua RO para hacer un volumen total de 50 ml y mezcle bien.
      NOTA: Las concentraciones finales de la solución T son 500 mM Tris-HCl y 20 mM CaCl2, respectivamente.
    2. Etiquetar el tubo Solución T y conservarlo a 4 °C.
  2. Hacer búfer TC
    1. Mezcle 40 ml de agua RO y 1,5 ml de solución T en un tubo cónico de 50 ml. Cambie el pH a 8.0 agregando pequeñas cantidades de KOH concentrado. Agregue agua para hacer 50 ml de la solución y verifique el pH. Ajuste el pH si es necesario.
      NOTA: El tampón TC final contiene 5 mM de Tris-HCl y 0,2 mM de CaCl2 a pH 8.
    2. Etiquetar el tubo TC y almacenarlo a 4 °C.
  3. Hacer FC Buffer
    1. Agregue 85 ml de agua de ósmosis inversa, 10 ml de solución T, 3,73 g de KCl y 0,041 g de MgCl2 a un frasco tampón de 100 ml. Modifique el pH a 7.5 agregando pequeños volúmenes de KOH concentrado. Agregue agua para hacer un volumen final de 100 mL y verifique el pH.
      NOTA: El tampón FC final contiene 500 mM de Tris-HCl, 500 mM de KCl, 2 mM de MgCl 2 y 2 mM de CaCl2 a pH 7,5.
    2. Etiquetar el tubo FC y almacenarlo a 4 °C.
  4. Prepare el tampón de actina general (GAB).
    1. Mezclar 485 μL de tampón TC, 10 μL de ATP de 10 mM y 5 μL de TDT de 50 mM en un tubo de microcentrífuga.
      NOTA: Las condiciones finales del búfer son 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl 2, 0,5 mM DTT y0,2 mM ATP.
    2. Etiquételo como GAB y guárdelo a 4 °C.
  5. Prepare el tampón de polimerización de actina (APB).
    1. Mezclar 455 μL de tampón FC, 25 μL de ATP de 100 mM y 20 μL de TDT de 50 mM en un tubo de microcentrífuga.
      NOTA: Las condiciones finales del búfer son 50 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl2 2 mM TDT y 5 mM ATP.
    2. Etiquetar el tubo como APB y almacenarlo a 4 °C.
  6. Reconstituir actina
    1. Reconstituir la actina del músculo esquelético del conejo añadiendo 100 μL de agua desionizada a un vial de 1 mg de actina liofilizada. Mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Alícuota en muestras de 5 μL, congelar rápidamente y almacenar las alícuotas de actina de 10 mg/ml a -80 °C.
    2. Reconstituir la actina del músculo esquelético del conejo biotinilado añadiendo 20 μL de agua RO. Alícuota en muestras de 5 μL, congelar a presión y almacenar las alícuotas de actina biotiniladas de 1 mg/ml a -80 °C.
  7. Polimerización de actina no marcada con estabilización de faloidina rodamina
    1. Descongele un vial de 10 mg/ml de actina y manténgalo en hielo.
    2. Prepare un tampón de GAB fresco, agregue 100 μL de GAB a la alícuota de actina y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar la solución en hielo durante 1 h.
    3. Preparar APB fresco durante la incubación. Después de la incubación, polimerizar la actina en filamentos añadiendo 11 μL de APB a la solución de actina. Mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Colocar sobre hielo durante 20 min.
    4. Agregue 5 μL de faloidina marcada con rodamina a la solución de filamento de actina recién polimerizada. Dejar en hielo en la oscuridad durante 1 h.
    5. Guarde el vial de rodamina y actina envuelto en papel de aluminio en la oscuridad a 4 °C.
      NOTA: Se sugiere utilizar estos filamentos durante un período máximo de 1 semana. La calidad del AF se puede confirmar cada día a través de una imagen rápida de una celda de flujo que contiene solo AF y la visualización de filamentos consistentes día a día.
  8. Polimerización de actina biotinilada con estabilización de faloidina Alexa Fluor 488
    1. Descongele un vial de 10 mg/ml de actina y 1 vial de 1 mg/ml de actina biotinilada y manténgalos en hielo.
    2. Haga un nuevo búfer GAB.
    3. Combinar los dos viales (paso 2.8.1) en una proporción 10:1 actina:actina biotinilada. Añadir 100 μL de GAB a la mezcla de actina y mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar en hielo durante 1 h.
    4. Hacer APB fresco durante la incubación.
    5. Después de la etapa de incubación, polimerizar la actina añadiendo 11 μL de APB a la solución de actina. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente. Incubar en hielo durante 20 min.
    6. Agregue 5 μL de faloidina marcada con Alexa Fluor 488 e incube en hielo en la oscuridad durante 1 h.
    7. Conservar el vial de actina biotinilada envuelto en papel de aluminio en la oscuridad a 4 °C.
      NOTA: Estos filamentos se pueden utilizar durante un periodo máximo de 1 semana.

3. Preparación de miosina y perlas

  1. Reconstituir la miosina II
    1. Gire brevemente (~5 s) la miosina esquelética liofilizada II para recogerla en el fondo del tubo usando una minicentrífuga estándar.
    2. Reconstituir la miosina a 10 mg/ml añadiendo 100 μL de 1 mM de TDT preparado en agua RO.
    3. Diluir la solución madre de miosina 10 veces añadiendo 10 μL de 10 mg/ml de miosina a 90 μL de 1 mM de DTT en agua RO. Hacer alícuotas de volumen pequeño (1-5 μL), congelarlas a presión y almacenar a -80 °C.
      NOTA: La actividad de la miosina se puede confirmar mediante la realización de un ensayo de filamento deslizante estándar como se publicó anteriormente46,47. Vea la discusión para una breve descripción.
  2. Limpieza de perlas recubiertas de estreptavidina
    1. Diluir 20 μL de perlas de estreptavidina de 1 μm en 80 μL de agua RO. Lavar cuatro veces girando a 9.600 × g y reconstituyendo en 100 μL de agua RO.
    2. Sonicar durante 2 min a una amplitud del 40% y almacenar las perlas lavadas en un rotador a 4 °C.

4. Preparación de la celda de flujo

  1. Prepare una solución de poli-l-lisina (PLL) agregando 30 ml de etanol al 100% a un tubo de 50 ml y agregando 200 μL de poli-l-lisina al 0,1% p/v en agua y mezcle bien.
  2. Agregue un cubreobjetos grabados a la solución de PLL y déjela en remojo durante 15 minutos. Retire el cubreobjetos con unas pinzas, teniendo cuidado de tocar únicamente el borde del cubreobjetos a medida que se levanta del tubo (véase la figura 1A-C). Agarra los cubreobjetos por sus bordes con una mano enguantada.
  3. Seque el cubreobjetos con una línea aérea filtrada hasta que no quede etanol ni residuos en el cubreobjetos.
  4. Aplique dos piezas de cinta adhesiva de doble cara en el centro de un portaobjetos de microscopio, a 3-4 mm de distancia entre sí. Rasgue o corte el exceso de cinta que cuelga del borde de la diapositiva.
  5. Agregue el cubrecubierto con PLL en la parte superior de la cinta perpendicular al eje largo del portaobjetos del microscopio (formando una T) para formar un canal.
  6. Use un tubo pequeño para comprimir el cubreobjetos en la cinta y el portaobjetos del microscopio a fondo hasta que la cinta sea transparente (Figura 1A). Asegúrese de que no haya burbujas en la cinta, ya que esto puede causar fugas del canal de flujo.
    NOTA: La celda de flujo puede contener un volumen de 10-15 μL.

5. Preparación del haz de actomiosina

  1. En tubos separados, diluir cada tipo de filamento de actina (marcado con rodamina y biotinilado 488) 600x mezclando 0,5 μL de la respectiva actina marcada con 300 μL de APB. Agregue 5 μL adicionales de faloidina correspondientemente etiquetada a cada tubo e incube en hielo en la oscuridad durante 15 minutos.
  2. A la solución de actina biotinilada, añadir un sistema de eliminación de oxígeno de 1 μL de beta-D-glucosa a 500 mg/ml, 1 μL de glucosa oxidasa a 25 mg/ml y 1 μL de catalasa a 500 unidades/ml. Añadir 1 μL de ATP de 100 mM y 1 μL de perlas de estreptavidina diluidas y limpias 100x. Revuelva suavemente con la punta de una pipeta. Coloque la suspensión en un rotador a 4 °C mientras se monta el resto del haz de actomiosina.
  3. Añadir 15 μL de la actina rodamina diluida a la célula de flujo PLL (Figura 1D). Absorba el exceso de solución a través de la celda de flujo, pero no permita que el canal de flujo se seque. Incubar durante 10 min en una cámara de humedad.
    NOTA: Las cámaras de humedad se pueden hacer de cajas de punta de pipeta vacías con agua agregada a la parte inferior y la tapa cubierta con papel de aluminio para bloquear la luz.
  4. Prepare una solución de caseína de 1 mg/ml en APB.
  5. Añadir 15 μL de 1 mg/ml de caseína para evitar la unión inespecífica de los componentes posteriores (Figura 1E). Incubar durante 5 min en una cámara de humedad.
  6. Añadir la concentración deseada de miosina a la suspensión de actina y perlas biotiniladas a partir del paso 5.2. Revuelva suavemente con la punta de la pipeta y, a continuación, agregue inmediatamente 15 μL de la suspensión del paso 5.2 + la concentración de miosina deseada a la celda de flujo (Figura 1F, G). Incubar durante 20 min. Selle los extremos abiertos de la celda de flujo con esmalte de uñas para evitar la evaporación durante los experimentos de captura óptica y de imágenes.
    NOTA: Una concentración de solución de miosina de 1 μM produce un agrupamiento robusto y se puede utilizar como punto de partida para la personalización deseada del ensayo (ver Figura 2).

6. Mediciones de fuerza mediante trampa óptica (NT2 Nanotracker2)

NOTA: Si bien el siguiente protocolo es específicamente para el sistema NT2, este ensayo se puede usar con otros sistemas de captura óptica, incluidos los que están hechos a medida, que también tienen capacidades de fluorescencia. El flujo de trabajo general sigue siendo el mismo de enfocar la superficie de la diapositiva, realizar calibraciones de cuentas y adquirir datos mediante la búsqueda de haces de actina fluorescente. Para el sistema NT2, la figura suplementaria S1, la figura suplementaria S2, la figura suplementaria S3, la figura suplementaria S4, la figura suplementaria S5, la figura suplementaria S6 y la figura suplementaria S7 proporcionan detalles del sistema de captura óptica y la interfaz del software.

  1. Encienda la caja de control y el láser (Figura suplementaria S1).
  2. Inicie el software de la computadora de trampa óptica haciendo clic en el icono JPK Nanotracker en el escritorio.
  3. Activa el mando a distancia haciendo clic en el botón Logitech situado en el centro (figura suplementaria S2).
  4. Encienda el módulo de fluorescencia activando el interruptor de encendido/apagado (Figura suplementaria S3).
  5. Gire la torreta del cubo del filtro para obtener imágenes de campo claro (Figura suplementaria S4).
  6. Una vez que el sistema esté listo, encienda el láser usando el botón de encendido láser en la esquina inferior izquierda de la pantalla a 50 mW y deje que se estabilice durante 30 minutos (Figura suplementaria S5).
  7. Haga clic secuencialmente en los botones Iluminación, Cámara, Objetivo y Movimiento de escenario dentro del software para abrir esas ventanas para ver y manipular durante el experimento. Encienda la iluminación del microscopio haciendo clic en el botón de encendido/apagado y ajustándola a máxima potencia haciendo clic y arrastrando la barra hasta la derecha (Figura suplementaria S5).
  8. Abra el área de muestra y retire el portamuestras de la etapa del microscopio. Agregue la celda de flujo, asegúrela con los soportes de muestras de metal y asegúrese de que la diapositiva con el cubreobjetos esté en la parte inferior.
  9. Agregue 30 μL de agua RO al centro del objetivo inferior. No deje que la punta de la pipeta toque la lente. Vuelva a insertar la etapa de ejemplo.
    NOTA: Como el sistema NT2 utiliza un objetivo de inmersión en agua como objetivo de captura, el medio de inmersión puede ser diferente dependiendo del objetivo de captura en la configuración del usuario.
  10. Levante el objetivo inferior con las flechas de control en pantalla o L2 en el control remoto hasta que la cuenta de agua toque el cubreobjetos (Figura suplementaria S5).
  11. Baje el objetivo superior hasta que se alcance aproximadamente la mitad de la distancia a la celda de flujo utilizando las flechas en pantalla o R2 en el control remoto. Agregue 170 μL de agua RO a la parte superior de la celda de flujo directamente debajo del objetivo superior. Baja el objetivo superior hasta que rompa la tensión superficial del agua y forme un menisco.
  12. Mueva la plataforma del microscopio con la almohadilla de flecha del mando a distancia hasta alcanzar el borde de la cinta adyacente al canal de flujo. Cierre la puerta de muestra.
    NOTA: Un "clic" al cerrar la puerta de muestra indica que el obturador láser ahora está abierto. Esta es una característica de seguridad que solo permite que el obturador se abra si la puerta está cerrada.
  13. Usando la ventana Objetivo en la pantalla, enfoca el borde de la cinta levantando el objetivo inferior llamado Objetivo láser haciendo clic en la flecha superior usando los controles en pantalla. Haga lo mismo para el objetivo superior haciendo clic en la flecha inferior (Figura suplementaria S5).
    NOTA: Las flechas dobles mueven el objetivo o la etapa más rápido. El borde de la cinta se utiliza para enfocar porque es un objeto grande y fácil de encontrar que está cerca de la superficie del cubreobjetos. Las burbujas de aire dentro de la cinta son otra opción. Sin embargo, esto no es necesario si el usuario tiene una rutina automatizada para encontrar el enfoque de superficie o un método interno preferido.
  14. Una vez que la cinta esté enfocada, cierre parcialmente el iris en la parte superior de la trampa óptica. Coloca el objetivo superior hacia abajo hasta que la forma poligonal del iris sea visible. Enfoca esos bordes, vuelve a abrir el iris y luego acopla los objetivos haciendo clic en el icono del candado (Figura suplementaria S5).
  15. Encuentra una cuenta flotante y trampérala haciendo clic en el botón Trap Shutter , que abrirá el obturador y permitirá que el láser de captura golpee la muestra. Haga clic en el cursor Trap en la pantalla y arrástrelo para mover la ubicación del láser de captura. Una vez atrapado, calibre el talón para correlacionar las mediciones de voltaje con la fuerza y el desplazamiento.
  16. Haga clic en el botón Calibración . Ajuste la rutina de calibración basada en el análisis de espectros de potencia y ajuste la frecuencia de esquina dentro del software para las direcciones X, Y y Z (Figura suplementaria S6).
  17. Haga clic en Configuración. Escriba el diámetro de la cuenta (1,000 nm) y escriba la temperatura de la etapa que se encuentra en la parte inferior izquierda de la ventana del software. (véase la figura suplementaria S6).
  18. Haga clic en Trampa 1. Haga clic en X Signal. Haga clic en Ejecutar para realizar el ajuste de frecuencia de esquina. Haga clic y arrastre dentro de la ventana para optimizar el ajuste de la función. Haga clic en Usarlo para conocer los valores de sensibilidad y rigidez. Haga clic en Aceptar valores. Repita para las señales Y y Z. Cierre la ventana. (véase la figura suplementaria S6).
    NOTA: Las rutinas de calibración de cuentas en otros sistemas de captura óptica o sistemas personalizados que han sido probados sólidamente por el usuario, como el método de equipartición o el método de fuerza de arrastre, también son aceptables57,58.
  19. Encuentre un paquete de actomiosina buscando cuentas unidas a AF en la superficie del cubreobjetos.
  20. Cuando se detecta una cuenta no abarrotada por otras cuentas flotantes, observe los AF a su alrededor mediante imágenes de fluorescencia para verificar la presencia de un paquete.
  21. Verifique que un paquete esté presente buscando ambos AF fluorescentes colocalizados. Encienda la fuente de luz blanca y use el cubo de filtro apropiado para obtener imágenes de cada filamento de actina girando la torreta (cubos de filtro de excitación de 488 nm y 532 nm para Alexa Fluor 488 y excitación de rodamina, respectivamente). Véase la figura suplementaria S4.
    NOTA: Un experimento de control para verificar la intensidad de fluorescencia de AF individuales puede ser útil para identificar haces que están compuestos por un solo filamento marcado con rodamina 488 y simples, o aplicable a cualquier conjunto de fluoróforos que el usuario elija usar.
  22. Una vez verificado, atrape la cuenta unida al filamento superior del paquete haciendo clic en el botón Obturador de trampa .
  23. Utilice los controles en pantalla para registrar los datos haciendo clic en el botón Osciloscopio (Figura suplementaria S7). Para visualizar las mediciones sin registrar los datos, haga clic en Inicio. Para guardar todos los datos, haga clic en Autoguardar. Para registrar las mediciones, haga clic en Iniciar registro. Elija qué datos deben visualizarse en tiempo real (posición, fuerza, dirección x, dirección y) eligiendo en el menú desplegable señal X o señal Y. Recuerde que xdirection es de izquierda a derecha, y la dirección y está arriba y abajo en la pantalla. Véase la figura suplementaria S7.
    NOTA: Los datos se guardarán como archivos .out e incluyen tiempo, voltaje, desplazamiento y fuerza para cada dirección. Estos archivos se pueden exportar a otro software para su visualización y análisis.

Resultados

Las células de flujo que contienen los sistemas de haz de actomiosina son de un diseño estándar, que consiste en un portaobjetos de microscopio y un cubreobjetos grabados separados por un canal hecho de cinta adhesiva de doble cara (Figura 1). Luego, el ensayo se construye desde el cubreobjetos utilizando introducciones escalonadas como se describe en el protocolo. El ensayo final consiste en filamentos de actina marcados con rodamina plantilla; la concentración de miosina deseada (se ut...

Discusión

Se realizó un estudio in vitro utilizando pinzas ópticas combinadas con imágenes de fluorescencia para investigar la dinámica de los conjuntos de miosina que interactúan con los filamentos de actina. Los haces de actina-miosina-actina se ensamblaron utilizando miosina muscular II, actina rodamina en la parte inferior del haz y en la superficie del cubreobjetos, y filamentos de actina biotinilados marcados con 488 en la parte superior del paquete. La proteína de actina del músculo del conejo se polimerizó...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado en parte por la Beca de Investigación del Consejo de Estudiantes Graduados de la Universidad de Mississippi (OA), la Universidad de Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), el Consorcio de Subvenciones Espaciales de Mississippi bajo el número de subvención NNX15AH78H (JCW, DNR) y la Asociación Americana del Corazón bajo el número de subvención 848586 (DNR).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Actin protein (biotin): skeletal muscleCytoskeletonAB07-ABiotinylated actin protein
Actin protein, rabbit skeletal muscleCytoskeletonAKL99-AActin protein
Alexa Fluor 488 PhalloidinInvitrogenA12379Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain
ATPFisher scientificBP413-25Required for actin assembly and myosin motility
Beta-D-glucoseFisher scientificMP218069110Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Blotting Grade Blocker (casein)Biorad1706404Used to block surface from non-specific binding
CaCl2Fisher scientificC79500Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network
CatalaseFisher scientificICN10040280Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
CoverslipsFisher scientific12544CUsed to make flow cells
DTTFisher scientificAC327190010Used for buffer preparation
EthanolFisher scientificA4094Regent used for cleaning coverslips
Glucose oxidaseFisher scientific34-538-610KUPart of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
KClFisher scientificP217-500Used for buffer preparation
KOHFisher scientificP250-1Used to etch coverslips and adjust buffer pH
MgCl2Fisher scientificM33-500Used for buffer preparation
Microscope slidesFisher scientific12-544-2Used to make flow cells
Myosin II protein: rabbit skeletal muscleCytoskeletonMY02Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle
Nanotracker2Bruker/JPKNT2Optical trapping instrument
Poly-l-lysineSigma-AldrichP8920Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip
Rhodamine PhalloidinCytoskeletonPHDR1Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain
Streptavidin beads, 1 μmSpherotechSVP-10-5Optical trapping handle
Tris-HClFisher scientificPR H5121Used for buffer preparation

Referencias

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