JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول توليد نبات اللفافة الجلدية المسمى "SCar مثل الأنسجة في طبق" أو SCAD. يسمح هذا النموذج بتصور غير مسبوق للخلايا الليفية المفردة أثناء تكوين الندبة.

Abstract

إن استجابة الثدييات العالمية لسد جروح الأنسجة العميقة هي من خلال تكوين الندبات وتقلص الأنسجة ، بوساطة الخلايا الليفية المتخصصة في اللفافة. على الرغم من الأهمية السريرية لتشكيل الندوب وضعف التئام الجروح ، فإن فهمنا لديناميكيات الخلايا الليفية اللفافة في التئام الجروح سريع بسبب عدم وجود فحوصات ذات صلة تمكن من التصور المباشر لتصميم رقصات الخلايا الليفية والديناميكيات في البيئات المعقدة مثل جروح الجلد. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتوليد ندوب جلدية خارج الموقع باستخدام SCAD أو "أنسجة تشبه SCar في طبق" تحاكي البيئة المعقدة للجروح الجلدية. في هذا الفحص ، يتم استئصال الجلد كامل السماكة 2 مم وزراعته رأسا على عقب في الوسائط لمدة 5 أيام ، تتطور خلالها الندوب وتقلصات الجلد بشكل موحد. تتيح هذه المنهجية، إلى جانب نماذج الفئران المعدلة وراثيا الخاصة بسلالة الخلايا الليفية، تصور سلالات الخلايا الليفية الفردية عبر عملية إصلاح الجرح بأكملها. بشكل عام ، يساعد هذا البروتوكول الباحثين في فهم العمليات والآليات الأساسية لإصلاح الجروح ، واستكشاف آثار المعدلات مباشرة على نتائج التئام الجروح.

Introduction

التئام الجروح هو عملية لاستعادة الجروح المخترقة. تؤدي إصابات الأنسجة في اللافقاريات إلى تجديد جزئي أو كامل. في المقابل، تستجيب الثدييات للإصابات العميقة عن طريق التندب، وهي عملية مصممة خصيصا لإغلاق الجروح بسرعة باستخدام سدادات كثيفة من ألياف المصفوفة التي تقلل من المنطقة المخترقة وفي الوقت نفسه تشوه الموقع المصاب بشكل دائم1،2،3. حروق الجلد الكبيرة أو الجروح المفتوحة العميقة في الثدييات تؤدي إلى أنماط ظاهرية مرضية مثل الندوب الضخامية أو الجدرة 4,5. هذه الندوب الوفيرة تسبب عبئا هائلا على أنظمة الرعاية الصحية السريرية والعالمية. في الولايات المتحدة وحدها ، تكلف إدارة الندوب حوالي 10 مليارات دولار سنويا 6,7. لذلك ، هناك حاجة إلى تطوير منهجيات ذات صلة لفهم العمليات والآليات الأساسية التي ينطوي عليها تكوين الندبات بشكل أفضل.

في السنوات الأخيرة ، كشفت مجموعة واسعة من الدراسات التي أجريت على الفئران عن مجموعات من الخلايا الليفية غير المتجانسة ذات القدرات الوظيفية المتميزة بناء على أصولها في مواقع جلدية معينة8،9،10. في الجلد الخلفي ، حدد Rinkevich et al. ، 2015 ، أن مجموعة محددة من الخلايا الليفية مع تعبير جنيني مبكر عن Engrailed-1 (En1) ، تسمى EPF (Engrailed positive Fibroblast) تساهم في تندب الجلد عند الجرح. وعلى العكس من ذلك، فإن سلالة أخرى من الخلايا الليفية ليس لها تاريخ من التعبير المتشابك، وهي الخلايا الليفية السلبية المسننة (ENF)، لا تساهم في تكوين الندبة8. يسمح رسم خرائط المصير لهذه السلالات En1 باستخدام خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تحركها Cre والتي تم عبورها إلى خطوط ماوس مراسل التألق مثل R26 mTmG (En1Cre x R26mTmG) بتصور مجموعات EPF و ENF.

دراسة هجرة الخلايا الليفية في الجسم الحي على مدى عدة أيام محدودة بسبب القيود الأخلاقية والتقنية. علاوة على ذلك ، فإن شاشات مكتبة الأجسام المضادة المركبة والفيروسية والمحايدة لتعديل المسارات المشاركة في الندوب تمثل تحديا تقنيا. تفتقر النماذج المستخدمة سابقا في المختبر أو خارج الجسم الحي إلى القدرة على تصور هجرة الخلايا الليفية وتكوين الندبات في البيئات الدقيقة للبشرة الحقيقية ، والتوحيد في تطور الندبة ، بالإضافة إلى تعقيد الأنسجة التي تحاكي بيئات الجلد في الجسم الحي 11,12. للتغلب على القيود المذكورة أعلاه ، قمنا بتطوير اختبار تندب خارج الجسم الحي يسمى SCAD (الأنسجة الشبيهة ب SCar في طبق) 13،14. يمكن إجراء هذا الفحص البسيط عن طريق استئصال الجلد كامل السماكة 2 مم الذي يحتوي على البشرة والأدمة ومناطق اللفافة تحت الجلد وزراعتها في وسائط DMSO المكملة بالمصل لمدة تصل إلى 5 أيام. الندوب الناتجة عن SCAD تكرر بشكل موثوق السمات المميزة للنسخ والبروتينات في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن SCADs الناتجة عن خطوط الفئران المعدلة وراثيا ذات الصلة (على سبيل المثال ، الفئران En1) التي تم عبورها مع خطوط فأر مراسل الفلورسنت تسمح بتصور ديناميكيات هجرة الخلايا الليفية وتطوير الندوب بدقة غير مسبوقة. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف هذا النموذج بسهولة لأي تطبيقات عالية الإنتاجية (على سبيل المثال ، المكتبة المركبة أو مكتبة الأجسام المضادة أو الفحص الفيروسي)13،14. في هذه المقالة ، نصف بروتوكولا محسنا لإنشاء SCADs وتطبيقات المعالجة اللاحقة لدراسة ديناميكيات الخلايا والمصفوفة في تطوير الندبة.

Protocol

يقدم النموذج المعروض أدناه وصفا مفصلا خطوة بخطوة لجيل فحص SCAD كما هو موضح بإيجاز في Jiang et al.، 202013. تم إجراء تحضيرات عينة SCAD بعد التضحية بالحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية وحكومة بافاريا العليا. تم إيواء الحيوانات في منشأة الحيوانات في مركز هيلمهولتز في ميونيخ. تم الحفاظ على الغرف مع الرطوبة المثلى ودرجة حرارة ثابتة مع دورة ضوء 12 ساعة. تم تزويد الحيوانات بالطعام والماء المجاني.

1. إعداد أنسجة SCAD

  1. التضحية الجراء حديثي الولادة في يوم ما بعد الولادة 0 أو اليوم 1 (P0 أو P1).
  2. قم باستئصال الجلد الظهري الظهري كامل السماكة بعناية 1.5 سم على الأقل 1.5 سم حتى طبقة العضلات الهيكلية باستخدام مشرط جراحي معقم.
  3. قشر الجلد باستخدام ملقط منحني معقم ، مما يضمن أن اللفافة السطحية سليمة مع عضلة البانيكولوس الكارنوسوس الكامنة.
  4. اغسل الأنسجة المستأصلة ب 50-100 مل من وسائط DMEM/F-12 الباردة لإزالة الدم الملوث.
  5. اغسل مرة واحدة باستخدام محلول الملح المتوازن (HBSS) من هانكس للحفاظ على صلاحية الأنسجة والخلايا.
  6. ضع الجلد رأسا على عقب (اللفافة السطحية في الأعلى) في طبق بتري 10 سم يحتوي على وسائط DMEM/F12.
  7. باستخدام لكمة خزعة 2 مم يمكن التخلص منها ، قم باستئصال قطع الجلد المستديرة كاملة السماكة ، مما يضمن أن اللفافة السطحية سليمة مع عضلة البانيكولوس الكارنوسية الكامنة حتى البشرة لتوليد أنسجة SCAD.
  8. قم بإعداد وملء 200 ميكرولتر من DMEM / F12 (بدون الفينول الأحمر) وسائط كاملة - DMEM / F12 مكملة ب 10٪ FBS و 1x GlutaMAX و 1x MEM من الأحماض الأمينية غير الأساسية و 1x Penicillin / streptomycin في آبار فردية من صفيحة 96 بئرا.
  9. باستخدام ملقط معقم ، قم بنقل أنسجة SCAD الفردية بعناية وغمرها بالكامل رأسا على عقب (اللفافة متجهة لأعلى) إلى آبار لوحة 96 بئرا.
  10. انقل اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا التي يتم الحفاظ عليها في ظل الظروف القياسية (37 درجة مئوية ، 21٪ (v / v) الأكسجين ، 5٪ (v / v) C02 ، و 95٪ رطوبة).

2. SCAD - زراعة الأنسجة

  1. ثقافة SCADs في حاضنة لمدة تصل إلى 5 أيام.
  2. في اليوم 2 واليوم 4 من الثقافة، استبدل الوسائط ب 200 ميكرولتر من الوسائط الكاملة DMEM/F12 الطازجة التي تم تسخينها مسبقا لضمان استمرار ظروف بقاء الخلايا والأنسجة. استبدل مركبات المعالجة أثناء كل تغيير في الوسائط.
    ملاحظة: تأكد من ترك 10 ميكرولتر من الوسائط في البئر لتجنب التصاق الأنسجة بالآبار.
  3. قم بإعداد SCADs للتجارب التالية: التصوير الحي (القسم 3) ، وحصاد الأنسجة وتلطيخ التألق المناعي 2D / 3D (القسم 4).

3. التصوير الحي ل SCADs

  1. تحضير ما لا يقل عن 30 مل من 2٪ -3٪ (ث / v) محلول الأغاروز منخفض الذوبان في PBS في زجاجة زجاجية عن طريق تسخينه في الميكروويف حتى الغليان.
  2. انقل الزجاجة على الفور وقم بتبريد محلول الأغاروز السائل في حمام مائي 40 درجة مئوية.
  3. انقل نسيج SCAD مع واجهة / ندبة متجهة لأعلى إلى وسط طبق 35 مم.
  4. قم بتضمين SCAD في درجة حرارة الغرفة (RT) عن طريق نقل الأغاروز السائل 40 درجة مئوية ببطء إلى طبق 35 مم باستخدام ماصة باستور. يتبلمر Agarose في غضون 2 دقيقة.
  5. أضف 2 مل من وسائط DMEM/F12 الكاملة التي تم تسخينها مسبقا (بدون مؤشر أحمر الفينول).
  6. احصل على صور بفاصل زمني لليوم 0 SCADs تصل إلى 48 ساعة باستخدام مجهر بؤري أو متعدد الفوتونات مجهز بنظام حضانة مناسب مضبوط على 37 درجة مئوية و 21٪ (v / v) أكسجين و 5٪ (v / v) C02 ورطوبة 95٪.

4. حصاد الأنسجة وتلطيخ التألق المناعي 2D / 3D

  1. اغسل الأنسجة في النقاط الزمنية ذات الصلة عن طريق استبدال الوسائط ب PBS معقمة.
  2. باستخدام ملقط معقم ، قم بنقل SCADs الفردية بعناية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل التي تحتوي على 500 ميكرولتر من 2٪ paraformaldehyde لإصلاح الأنسجة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  3. اغسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام PBS واستمر في تلطيخ التألق المناعي 2D / 3D.
  4. 3D تلطيخ التألق المناعي
    1. تخلل الأنسجة عن طريق الحضانة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من PBS مع استكمال 0.2 ٪ من الجيلاتين ، 0.5 ٪ Triton-X100 ، و 0.01 ٪ Thimerosal (PBSGT) في RT لمدة 24 ساعة.
    2. تحضير كمية كافية من الأجسام المضادة الأولية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واحتضان أنسجة SCAD في 150 ميكرولتر من محلول PBSGT لمدة 24 ساعة في RT.
      ملاحظة: إذا لم يتم الإبلاغ عن تركيز الأجسام المضادة الأمثل للتألق المناعي من قبل الشركة المصنعة، فيجب إجراء معايرة الأجسام المضادة مسبقا على أنسجة التحكم باستخدام تركيزات مختلفة (على سبيل المثال، 1:50، 1:200، 1:500، 1:1000).
    3. اغسل SCADs بلطف ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الجسم المضاد الأساسي غير المقيد.
    4. احتضان الأنسجة مع 1: 1000 الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor ذات الصلة في PBS بين عشية وضحاها في RT.
    5. اغسل الأنسجة بلطف لمدة 30 دقيقة في PBS ثلاث مرات لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة غير المقيدة.
    6. انقل الأنسجة إلى طبق زجاجي سفلي 35 مم للتصوير متحد البؤرة أو متعدد الفوتونات.
      ملاحظة: عند استخدام أهداف الغمر بالماء، قم بتضمين SCADs في أغاروز منخفض درجة الانصهار بنسبة 2٪ لشل حركة الأنسجة لمنع الانجراف أثناء التقاط الصورة
  5. 2D تلطيخ التألق المناعي
    1. انقل الأنسجة إلى قالب مبرد واملأها بلطف بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) لغمر الأنسجة تماما.
    2. اضبط اتجاه الأنسجة بلطف ، مما يضمن عدم وجود فقاعات هواء للحصول على مقطع عرضي أو مقطع رأسي.
    3. ضع القالب على الثلج الجاف لمدة 20-30 دقيقة واحتضن الكتلة عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    4. اضبط درجة حرارة الشفرة على -25 درجة مئوية ودرجة حرارة كتلة العينة على -17 درجة مئوية. قم بإعداد مقطع مبرد 6 ميكرومتر باستخدام جهاز تبريد ، وانقل الأقسام إلى شريحة التصاق ، وخزن الشرائح في ثلاجة -20 درجة مئوية.
    5. شطف الشرائح ثلاث مرات في PBS واحتضان الشرائح في 5٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) ث / v في PBST (PBS مع استكمال 0.05٪ Tween) لمدة 1 ساعة.
    6. أضف كمية مناسبة من الأجسام المضادة الأولية إلى 150μl PGST ، واحتضنها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية
      ملاحظة: إذا لم يتم الإبلاغ عن تركيز الأجسام المضادة الأمثل للتألق المناعي من قبل الشركة المصنعة، فيجب إجراء معايرة سابقة للأجسام المضادة على أقسام التحكم باستخدام تركيزات مختلفة (على سبيل المثال، 1:50، 1:200، 1:500، 1:1000).
    7. اغسل الأقسام بلطف ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الجسم المضاد الأساسي غير المقيد.
    8. احتضان الأنسجة مع 1: 1000 الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor ذات الصلة في PBS بين عشية وضحاها في RT لمدة 2 ساعة.
    9. اغسل الأنسجة بلطف لمدة 5 دقائق في PBS ثلاث مرات لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة غير المقيدة.
    10. قم بتركيب الشرائح باستخدام وسيط تركيب يحتوي على DAPI وجفف الشرائح في الظلام في RT.
    11. قم بتصوير الأقسام باستخدام مجهر التألق.

النتائج

يمكن فصل توليد SCADs إلى ثلاث خطوات أساسية: حصاد الجلد مرة أخرى من الفئران P0-P1 ، وتوليد لكمات خزعة كاملة السماكة ، وزراعة لاحقة من السكادس الفردية تصل إلى 5 أيام في 96 لوحة بئر. كقراءة ، يمكن تطبيق هذا الفحص بشكل أكبر لتحليل الجوانب المكانية والزمنية للتندب. يستخدم التحليل المكاني 2D و 3D وضع العل?...

Discussion

تم بالفعل تطوير العديد من النماذج لفهم تكوين الندبات بعد الإصابة. وفي حين أحرز الكثير من أوجه التقدم في هذا الصدد، فإن الآليات الفعلية لا تزال غير واضحة. على النقيض من التقنية السابقة ، يتضمن نموذج SCAD جميع أنواع الخلايا والطبقات الجلدية ، وبالتالي الحفاظ على تعقيد الجلد الأصلي18,1...

Disclosures

جميع المؤلفين يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نحن نقدر جميع المؤلفين المشاركين في Jiang et al. 2020 للمساهمة في تطوير منهجية SCAD13. نشكر الدكتور ستيفن ديتزل ومرفق التصوير الحيوي الأساسي في جامعة لودفيغ ماكسيميلان على الوصول إلى نظام الفوتون المتعدد. تم دعم Y.R. من قبل مؤسسة Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21) ، ومنحة مجلس البحوث الأوروبي الموحد (ERC-CoG 819933) ، ومؤسسة LEO (LF-OC-21-000835).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Tween 20, Nonionic DetergentBiorad Laboratories1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fractSigmaA4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mLLIFE Technologies11039021
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190169
Epredia Cryostar NX70 CryostatThermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slidesFisher scientificJ1800AMNZAdhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mLLIFE Technologies 10500064
Fluoromount-G with DAPILife Technologies00 4959 52Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm lengthFisher Scientific12381369
Gelatin from porcine skinSigmaG2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mLLIFE Technologies35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mLLIFE Technologies14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2Ibidi11922
Ibidi Heating systemIbidi10915
Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nmLeicaEquipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino AcidsLIFE Technologies11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 gBiozym /Lonza859081
OCT Embedding MatrixCarlroth6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mLVWR International43368.9M
Pen-StrepGibco15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mmStiefel270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cmFisher Scientific15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101%Sigma-AldrichT8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscopeZeiss

References

  1. Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
  2. desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
  3. Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
  4. Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
  5. Martin, P. Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
  6. Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
  7. Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
  8. Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
  9. Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
  10. Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
  11. Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
  12. Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
  13. Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
  14. Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
  15. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
  16. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  17. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  18. Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
  19. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved