SCAD Testi Kullanarak Yara İzi Gelişimini Görselleştirme - Ex-situ Cilt Yara İzi Tahlili

Özet

Bu protokol, "Bir Çanakta SCar benzeri doku" veya SCAD olarak adlandırılan bir cilt-fasya eksplantının oluşumunu tanımlar. Bu model, skar oluşumu sırasında tek fibroblastların benzeri görülmemiş bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.

Özet

Memelilerin derin doku yaralarının kapatılmasına verdiği küresel yanıt, özel fasya fibroblastlarının aracılık ettiği skar oluşumu ve doku kasılması yoluyladır. Yara izi oluşumunun ve bozulmuş yara iyileşmesinin klinik önemine rağmen, yara iyileşmesinde fasya fibroblast dinamiklerini anlamamız, fibroblast koreografisinin ve dinamiklerinin cilt yaraları gibi karmaşık ortamlarda doğrudan görselleştirilmesini sağlayan ilgili testlerin bulunmaması nedeniyle üstünkörüdür. Bu yazıda, cilt yaralarının karmaşık ortamını taklit eden SCAD veya "Bir Çanakta SCar benzeri doku" kullanılarak ex-situ cilt izleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlilde, 2 mm tam kalınlıkta cilt eksize edilir ve 5 gün boyunca ortamda baş aşağı kültürlenir, bu süre zarfında yara izleri ve cilt kontraktürleri eşit olarak gelişir. Bu metodoloji, fibroblast soyuna özgü transgenik fare modelleri ile birleştiğinde, tüm yara onarım süreci boyunca bireysel fibroblast soylarının görselleştirilmesini sağlar. Genel olarak, bu protokol araştırmacıların yara onarımının temel süreçlerini ve mekanizmalarını anlamalarına, modülatörlerin yara iyileşmesi sonuçları üzerindeki etkilerini doğrudan keşfetmelerine yardımcı olur.

Giriş

Yara iyileşmesi, ihlal edilen yaraların restorasyonu sürecidir. Omurgasızlarda doku yaralanmaları kısmi veya tam rejenerasyonla sonuçlanır. Buna karşılık, memeliler derin yaralanmalara yara izi bırakarak yanıt verirler; bu, ihlal edilen alanı en aza indiren ve aynı zamanda yaralı bölgeyi kalıcı olarak deforme eden yoğun matris lifleri tıkaçları ile yaraları hızlı bir şekilde kapatmak için uyarlanmış bir süreç ^1,2,3. Memelilerde büyük deri yanıkları veya derin açık yaralar, hipertrofik veya keloid skarlar gibi patolojik fenotiplere neden olur ^4,5. Bu coşkulu yara izleri, klinik ve küresel sağlık sistemleri üzerinde muazzam bir yüke neden olmaktadır. Sadece ABD'de, yara izi yönetimi yıllık yaklaşık 10 milyar dolara mal oluyor ^6,7. Bu nedenle, skar oluşumunda rol oynayan temel süreçleri ve mekanizmaları daha iyi anlamak için ilgili metodolojilerin geliştirilmesi gerekmektedir.

Son yıllarda, farelerde yapılan çok çeşitli çalışmalar, belirli cilt bölgelerindeki kökenlerine bağlı olarak farklı fonksiyonel potansiyellere sahip heterojen fibroblast popülasyonlarını ortaya koymuştur ^8,9,10. Arka deride, Rinkevich ve ark., 2015, EPF (Engrailed pozitif fibroblast) olarak adlandırılan Engrailed-1'in (En1) erken embriyonik ekspresyonuna sahip spesifik bir fibroblast popülasyonunun, yaralanma üzerine kutanöz skarlaşmaya katkıda bulunduğunu tanımlamıştır. Tersine, engrailed ekspresyon öyküsü olmayan başka bir fibroblast soyu olan Engrailed negatif fibroblast (ENF), skar oluşumuna katkıda bulunmaz⁸. R26^mTmG (En1Cre x R26^mTmG) gibi floresan muhabir fare çizgilerine çapraz Cre-driven transgenik fare çizgileri kullanılarak bu En1 soylarının kader haritalanması, EPF ve ENF popülasyonlarının görselleştirilmesine olanak tanır.

Fibroblast göçünü birkaç gün boyunca in vivo olarak incelemek, etik ve teknik kısıtlamalarla sınırlıdır. Ayrıca, skarlaşmada rol oynayan yolları modüle etmek için bileşik, viral ve nötralize edici antikor kütüphanesi ekranları teknik olarak zordur. Daha önce kullanılan in vitro veya ex vivo modeller, gerçek cilt mikro ortamlarında fibroblast göçünü ve skar oluşumunu, skar gelişiminde homojenliği ve in vivo cilt ortamlarını taklit eden doku karmaşıklığını görselleştirme yeteneğinden yoksundur ^11,12. Yukarıdaki sınırlamaların üstesinden gelmek için, SCAD (Bir Çanakta SCar benzeri doku) ^13,14 olarak adlandırılan bir ex vivo skar testi geliştirdik. Bu basit tahlil, epidermis, dermis ve deri altı fasya bölgelerini içeren 2 mm tam kalınlıkta cildin eksize edilmesi ve serum takviyeli DMSO ortamında 5 güne kadar kültürlenmesiyle gerçekleştirilebilir. SCAD'den üretilen skarlar, in vivo skarların transkriptomik ve proteomik özelliklerini güvenilir bir şekilde çoğaltır. Ek olarak, floresan muhabir fare çizgileriyle kesişen ilgili transgenik fare çizgilerinden (örneğin, En1 fareler) üretilen SCAD'ler, fibroblast göç dinamiklerinin ve yara izi gelişiminin benzeri görülmemiş bir çözünürlükte görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca, bu model herhangi bir yüksek verimli uygulama için kolayca uyarlanabilir (örneğin, bileşik kütüphanesi, antikor kütüphanesi veya viral tarama)^13,14. Bu makalede, skar gelişiminde hücresel ve matris dinamiklerini incelemek için SCAD'ler ve ardından aşağı akış işleme uygulamaları oluşturmak için optimize edilmiş bir protokolü açıklıyoruz.

Protokol

Aşağıda sunulan model, Jiang ve ark., 2020^13'te kısaca açıklandığı gibi SCAD testinin oluşturulmasının ayrıntılı bir adım adım açıklamasını sunmaktadır. SCAD numune hazırlıkları, uluslararası ve Yukarı Bavyera Hükümeti yönergelerine uygun olarak hayvanlar kurban edildikten sonra gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar, Münih Helmholtz Merkezi'nin hayvan tesisinde barındırıldı. Odalar, 12 saatlik bir ışık döngüsü ile optimum nem ve sabit sıcaklık ile korunmuştur. Hayvanlara yiyecek ve su ad libitum sağlandı.

1. SCAD doku hazırlığı

1. Yenidoğan yavruları doğum sonrası gün 0 veya 1. günde (P0 veya P1) kurban edin.
2. Steril bir cerrahi neşter kullanarak iskelet kası tabakasına kadar en az 1,5 cm x 1,5 cm tam kalınlıkta dorsal sırt derisini dikkatlice tüketin.
3. Steril kavisli forseps kullanarak cildi soyun ve yüzeysel fasyanın altta yatan panniculus karnoz kası ile bozulmamış olmasını sağlayın.
4. Kirletici kanı temizlemek için eksize edilen dokuyu 50-100 mL soğuk DMEM/F-12 ortamı ile yıkayın.
5. Doku ve hücre canlılığını korumak için Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile bir kez yıkayın.
6. Cildi baş aşağı (üstte yüzeysel fasya) DMEM/F12 ortamı içeren 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
7. Tek kullanımlık 2 mm'lik bir biyopsi punch kullanarak, tam kalınlıkta yuvarlak deri parçalarını tüketin, yüzeysel fasyanın SCAD dokuları oluşturmak için epidermise kadar altta yatan panniculus karnozus kası ile bozulmamış olmasını sağlayın.
8. % 10 FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM esansiyel olmayan amino asitler ve 1x Penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 200 μL DMEM / F12 (fenol kırmızısı olmadan) komple medya-DMEM / F12 ortamını hazırlayın ve 96 delikli bir plakanın bireysel kuyucuklarına doldurun.
9. Steril forseps kullanarak, bireysel SCAD dokusunu dikkatlice aktarın ve 96 delikli bir plakanın kuyularına baş aşağı (fasyaya bakacak şekilde) tamamen batırın.
10. Plakayı standart koşullar altında tutulan bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın (37 ° C,% 21 (v / v) oksijen,% 5 (v / v) C0₂ ve% 95 nem).

2. SCAD - Doku kültürü

1. Kültür SCAD'leri bir inkübatörde 5 güne kadar.
2. Kültürün 2. ve 4. günlerinde, hücre ve doku canlılığı koşullarının devam etmesini sağlamak için medyayı 200μl taze önceden ısıtılmış DMEM / F12 komple medya ile değiştirin. Her ortam değişikliği sırasında arıtma bileşiklerini değiştirin.
   NOT: Dokuların kuyucuklara yapışmasını önlemek için kuyuda 10 μL ortam bıraktığınızdan emin olun.
3. SCAD'leri aşağıdaki deneyler için hazırlayın: Canlı görüntüleme (bölüm 3) ve Doku Toplama ve 2D / 3D immünofloresan boyama (bölüm 4).

3. SCAD'lerin canlı görüntülenmesi

1. Bir cam şişede PBS'de en az 30 mL% 2-3% (w / v) düşük erime noktalı agaroz çözeltisini, kaynayana kadar bir mikrodalgada ısıtarak hazırlayın.
2. Hemen şişeyi aktarın ve sıvı agaroz çözeltisini 40 ° C'lik bir su banyosunda soğutun.
3. SCAD dokusunu fasya/yara izi yukarı bakacak şekilde 35 mm'lik bir kabın ortasına aktarın.
4. SCAD'yi oda sıcaklığında (RT) 40 °C sıvı agarozu bir Pasteur pipet kullanarak 35 mm'lik kabın üzerine yavaşça aktararak yerleştirin. Agaroz 2 dakika içinde polimerize olur.
5. 2 mL önceden ısıtılmış DMEM / F12 tam ortam ekleyin (fenol kırmızı göstergesi olmadan).
6. 37 °C, %21 (v/v) oksijen, %5 (v/v) C0 2 ve %95 neme ayarlanmış uygun bir inkübasyon sistemi ile donatılmış bir konfokal veya çoklu foton mikroskop kullanarak 48 saate kadar 0. gün SCAD'lerinin hızlandırılmış görüntülerini elde_edin.

4. Doku hasadı ve 2D / 3D immünofloresan boyama

1. Ortamı steril PBS ile değiştirerek dokuları ilgili zaman noktalarında yıkayın.
2. Steril forseps kullanarak, dokuları gece boyunca 4 ° C'de sabitlemek için bireysel SCAD'leri 500 μL% 2 paraformaldehit içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine dikkatlice aktarın.
3. Dokuları PBS ile üç kez yıkayın ve 2D / 3D immünofloresan boyama işlemine devam edin.
4. 3D immünofloresan boyama
   1. RT'de 24 saat boyunca% 0.2 jelatin,% 0.5 Triton-X100 ve% 0.01 Thimerosal (PBSGT) ile desteklenmiş 500 μL PBS içeren 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde inkübe ederek dokuları geçirgenleştirin.
   2. Üreticinin talimatlarına göre yeterli miktarda birincil antikor hazırlayın ve SCAD dokularını RT'de 24 saat boyunca 150 μL PBSGT çözeltisinde inkübe edin.
      NOT: İmmün floresan için optimal antikor konsantrasyonu üretici tarafından bildirilmemişse, kontrol dokularında farklı konsantrasyonlar kullanılarak (örneğin, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000) önceden antikor titrasyonu yapılmalıdır.
   3. İlişkisiz primer antikoru çıkarmak için SCAD'leri PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.
   4. RT'de bir gecede PBS'de 1:1000 ilgili Alexa Fluor sekonder antikorları ile dokuyu inkübe edin.
   5. Fazla bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için dokuyu PBS'de 30 dakika boyunca üç kez nazikçe yıkayın.
   6. Konfokal veya multifoton görüntüleme için dokuyu 35 mm'lik cam tabanlı bir kaba aktarın.
      NOT: Suya daldırma hedeflerini kullanırken, görüntü elde etme sırasında sürüklenmeyi önlemek amacıyla dokuyu hareketsiz hale getirmek için SCAD'leri %2 düşük erime noktası agarozuna yerleştirin
5. 2D immünofloresan boyama
   1. Dokuyu bir kriyo-kalıba aktarın ve dokuyu tamamen daldırmak için optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile yavaşça doldurun.
   2. Dokunun yönünü yavaşça ayarlayın, bir enine kesit veya dikey bir bölüm elde etmek için hava kabarcıklarının olmamasını sağlayın.
   3. Kalıbı 20-30 dakika kuru buz üzerine yerleştirin ve bloğu gece boyunca -80 ° C'de inkübe edin.
   4. Bıçak sıcaklığını -25 °C'ye ve numune bloğu sıcaklığını -17 °C'ye ayarlayın. Bir kriyostat kullanarak 6 μm kriyoseksiyon hazırlayın, bölümleri bir yapışma slaydına aktarın ve slaytları -20 °C dondurucuda saklayın.
   5. Slaytları PBS'de üç kez durulayın ve slaytları PBST'de (% 0.05 Ara ile desteklenmiş PBS) 1 saat boyunca% 5 Sığır Serum Albümini (BSA) ile inkübe edin.
   6. 150μl PGST'ye uygun miktarda birincil antikor ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin
      NOT: İmmün floresan için optimal antikor konsantrasyonu üretici tarafından bildirilmemişse, kontrol bölümlerinde farklı konsantrasyonlar kullanılarak (örneğin, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000, 1:1000) önceden antikor titrasyonu yapılmalıdır.
   7. İlişkisiz birincil antikoru çıkarmak için bölümleri PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.
   8. PBS'de 1:1000 ilgili Alexa Fluor sekonder antikorları ile dokuyu RT'de 2 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.
   9. Fazla bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için dokuyu PBS'de 5 dakika boyunca üç kez nazikçe yıkayın.
   10. Slaytları DAPI içeren bir montaj ortamıyla monte edin ve slaytları RT'de karanlıkta kurulayın.
   11. Bölümleri bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin.

Sonuçlar

SCAD'lerin üretimi üç temel adıma ayrılabilir: P0-P1 farelerinden arka cildin toplanması, tam kalınlıkta biyopsi punchlarının üretilmesi ve ardından 96 kuyucuklu plakalarda 5 güne kadar bireysel scads kültürü. Bir okuma olarak, bu tahlil yara izinin mekansal ve zamansal yönlerini analiz etmek için daha fazla uygulanabilir. Uzamsal analiz, gelişmekte olan skar dokusundaki hücresel ve matris bileşenlerinin mekansal lokalizasyonunu incelemek için dokuların 2D ve 3D bağışıklık etiketlemesini kulla...

Tartışmalar

Yaralanma sonrası skar oluşumunu anlamak için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bu konuda birçok ilerleme kaydedilmesine rağmen, gerçek mekanizmalar hala net değildir. Önceki tekniğin aksine, SCAD modeli tüm hücre tiplerini ve kutanöz tabakaları içerir, böylece doğal cildin karmaşıklığını korur^18,19. Bu metodoloji, skar oluşumunu yönlendiren moleküler mekanizmaları anlamada önemli olan temel veri kümeleri üretebilir. Tahlil, basi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Tween 20, Nonionic Detergent	Biorad Laboratories	1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat	Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides	Fisher scientific	J1800AMNZ	Adhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL	LIFE Technologies	10500064
Fluoromount-G with DAPI	Life Technologies	00 4959 52	Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length	Fisher Scientific	12381369
Gelatin from porcine skin	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2	Ibidi	11922
Ibidi Heating system	Ibidi	10915
Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm	Leica		Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino Acids	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT Embedding Matrix	Carlroth	6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL	VWR International	43368.9M
Pen-Strep	Gibco	15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm	Stiefel	270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscope	Zeiss